Name: Campo eléctrico controlado por migración dirigida de células progenitoras neurales en entornos 2D y 3D (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Aprende a rastrear la migración de células progenitoras neurales en campos eléctricos usando cámaras electrotácticas personalizadas en entornos 2D y 3D. Este método permite estudiar la galvanotaxis celular en tiempo real.

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Este trabajo fue apoyado por la Real Sociedad URF subvención UF051616, Reino Unido y el Consejo Europeo de Investigación StG subvención 243.261 BS. El trabajo en el laboratorio de MZ también es apoyado por un Instituto de California de Medicina Regenerativa de subvención RB1-01417.

1. Progenitoras neurales de aislamiento de células <ol><li> Diseccionar los cerebros enteros de E14-16 ratones y el lugar en frío DMEM/F12 medio basal. Quite todas las meninges con un microscopio anatómica y la transferencia de cerebros en un plato de Petri de 35 mm. </li><li> Use unas pinzas finas para disociar mecánicamente cerebros en fragmentos de tejido y los transfiere a un tubo de 15 ml, centrifugar las muestras a 800 rpm durante 3 minutos para eliminar los residuos. </li><li> Añadir DMEM/F12 que contiene bFGF y EGF y se tritura con una pipeta de 1 ml. </li><li> Pasar la suspensión celular a través de un filtro de células para obtener una suspensión de células individuales. </li><li> Células de la placa en frascos a 2-5 x 10 4 células / ml, a continuación, realizar un medio completo cambian cada 3 días y el paso de las células cada 6 días. </li><li> Después de al menos 5 pasajes, digerir neuroesferas a células individuales usando tripsina y EDTA y crecer en cámaras electrotactic poly-D-lysine/laminin-coated (preparado como se describe a continuación en 2). Utilice el medio de cultivo que contiene N2 suplemento,bFGF y EGF en todo momento para mantener las propiedades de los NPCs. </li></ol> 2. Preparación de la cámara de electrotactic <ol><li> Preparar 22 x 11 mm tiras de vidrio mediante la división en autoclave 22 x 22 mm de espesor cubreobjetos no.1 en medio utilizando una pluma de diamantes. </li><li> Crear un vaso independiente y de dimensiones interiores 22 x 10 mm al pegar cuatro verticalmente de pie 22 x 11 mm tiras con grasa de silicona de alto vacío. Permita que los pozos se sequen por completo y se endurecen durante la noche. </li><li> El día siguiente, conecte dos 22 x 11 mm tiras de vidrio, paralelos entre sí dejando un hueco de 10 mm, a la base de una placa de cultivo de 100 mm utilizando grasa de silicona. Sellar la región entre estas tiras mediante la colocación de un 22 x 22 mm cubreobjetos en cada extremo, unido a la parte inferior del plato con grasa en tres lados, pero no el más próximo al centro. </li><li> Coloque el cristal así preparada en la etapa 2,2 sobre la cubierta se desliza de modo que las paredes interiores crear un espacio confinado para la siembralas células en la parte inferior de la placa. A prueba de agua todas las juntas con grasa de silicona. Capa esta región confinada secuencialmente con poli-D-lisina entonces laminina: añadir 1 ml de poli-D-lisina en la cámara y se deja durante 5 minutos para permitir la poli-D-lisina de obligar a la parte inferior de la placa; lavar la cámara con PBS estéril dos veces, luego diluir laminina en PBS estéril para dar 20 mg / ml y utilizar para cubrir la parte inferior de la placa. Dejar a temperatura ambiente durante la noche. </li><li> El día siguiente, las células de la cosecha y preparar 1 ml de suspensión contiene de 1 x 104 células. Retire la laminina de la copa y, lo que permite que se seque por completo, y sustituir con 1 ml de suspensión celular. Poner la cápsula en la incubadora a 37 ° C durante un mínimo de 4 horas para permitir la fijación. </li><li> Una vez que las células son suficientemente confluente eliminar todo el medio de la cámara. Retire con cuidado el vaso bien. Forme un techo sobre las células por amarrando, con grasa de silicona, un autoclave de 22 x 22 mm cubreobjetospuente entre las dos tiras de 22 x 11 mm. Cubrir las células con unas pocas gotas de medio para evitar la desecación. </li><li> Formar un depósito medio de aislamiento en cada extremo de la cámara mediante la creación de dos barreras estancas de grasa de silicona que se ejecutan desde un borde del plato a la otra, sobre el techo de la cámara. Llenar la cámara con un nuevo medio, asegurar un flujo continuo desde el depósito medio una a la otra. Vuelva a colocar el plato a la incubadora durante 12 horas para permitir la recuperación celular. </li></ol> 3. La aplicación de un campo eléctrico a la cámara de electrotactic <ol><li> Preparar una tapa para cubrir el plato mediante la perforación de dos orificios, uno colocado sobre cada depósito de la cámara de la migración. </li><li> Sustituir todo el medio en la cámara con medio de cultivo que contiene 25 mM de tampón HEPES y transferir el plato para el sistema de imagen de temperatura controlada. Establecer los parámetros experimentales para time-lapse y grabación multi-posición. Alinear la cámara de manera que el cátodo y el ánodo sona la izquierda y derecha, respectivamente, para asegurar que el vector de EF se extiende horizontalmente como se ve por el microscopio y se registra en el sistema de imagen. </li><li> Llene dos vasos con una solución de Steinberg (58 mM de NaCl, 0,67 mM de KCl, 0,44 mM de Ca (NO3) 2 .4 H 2 0, 1,3 mM MgSO 4 .7 H 2 0 y 4,6 mm Trizma base, pH 7,4). Conectar un vaso de precipitados separado para cada depósito medio utilizando pre-preparadas puentes de vidrio (tubos de vidrio ~ 13 ~ cm de largo y 3 mm de diámetro, y doblado en forma de U por calentamiento en un mechero Bunsen), rellenas con 2% (w / v) Steinberg's-agar solución, que pasa a través de los orificios de la tapa. Complete el circuito eléctrico mediante la colocación de Ag / AgCl electrodos conectados a una fuente de alimentación de CC en cada vaso de precipitados de la solución de Steinberg. </li><li> Ajuste el dial de voltaje en el suministro de energía a 0 y se enciende. Medir la tensión a través de la cámara de electrotactic mientras se sube la tensión de línea, utilizando un medidor de voltaje, y ajustar para adaptarse a los requerimientos experimentales. </li><li> Inicio de lapso de tiempo de grabación. Realizar un cambio de medio y reajustar la tensión, según se requiera, cada hora. Medio fresco, drogas o agentes químicos se pueden añadir a los depósitos según sea necesario. Cuando realizar cambio de medio, dos opciones pueden ser considerados como a continuación: <ol><li> Opción N º 1 - Para poner en pausa la grabación de lapso de tiempo temporal, retire con cuidado los puentes de cristal de la cámara para evitar perturbar la tapa cubierta, utilice una pipeta Pasteur esterilizada vuelva a colocar todo el medio con un nuevo medio y colocar los puentes de cristal hacia atrás, a continuación, reanudar la grabación. </li><li> Opción N ° 2 - Alternativamente, hecho a medida tapa cubierta con 4 orificios (dos coloca sobre cada depósito de la cámara de la migración) también se puede utilizar para el propósito de cambio de medio. Dos de vidrio conexión puentes, los otros dos para cambiar medio. Opción 2 permite la grabación continua, sin interferencias durante el cambio de medio. </li></ol></li></ol> 4. Preparación de la rebanada de la médula espinal organotípico <ol><li> Diseccionar Lumbar la columna vertebral de los cables de 2 semanas de edad C57 BL / 6 ratones. </li><li> Cortar la médula espinal en 500 secciones micras de espesor con una picadora de tejidos McIlwain. </li><li> Separe las rebanadas en un microscopio anatómica y seleccionar sectores con intacta sagital / axial de la estructura de la médula espinal. </li><li> Rodajas de placa en una placa de Petri de 35 mm que contiene 30 l Matrigel y colocarlos lo más cerca posible del centro como sea posible y mantenerlos en un 5% de CO 2 incubadora a 37 ° C durante al menos 30 minutos hasta que el Matrigel proteínas se auto-ensamblan para producir una fina película que cubre la superficie de la rebanada de la médula espinal. Es muy importante asegurarse de que Matrigel ha sido montada por completo, se incuba la placa de Petri a 37 ° C durante otros 30 minutos si es necesario. </li><li> Añadir 4-6 ml DMEM/F-12 medio que contiene 25 mM de tampón HEPES y suero fetal de ternera 15-20% muy suavemente de modo que se evite el flujo medio directamente sobre la rebanada. Asegurarse de que la rebanada no está completamente sumergido en el medio, dejando la superficie de los explantes así expuestos ael aire. Cambiar medio dos veces por semana. </li></ol> 5. La inyección de Hoechst 33342 NPCs etiquetados en el segmento de la médula espinal organotípico <ol><li> Preparar la suspensión de la APN en el 1 × 10 6 células / l. </li><li> Preincubar la suspensión celular en un medio con 5 Hoechst 33342 mM durante 30 min. </li><li> Utilizar tubo capilar de vidrio a microinyectar 2 l de suspensión en el segmento de la médula espinal lentamente bajo un microscopio. Asegúrese tubo capilar de vidrio pasa a través del Matrigel (parte rosa bajo microscopio) y llegar al interior de la rebanada de la médula espinal (tejido gris bajo microscopio), siendo el interior de la rebanada de la médula espinal por lo menos 30 segundos para evitar la suspensión de células arrollado. Coloque la placa de Petri que contiene parte de la médula espinal en la incubadora (37 º C 5% 2) y se deja durante la noche. </li><li> Al día siguiente, aplicar una EF de 500 mV / mm para el corte de la médula espinal que contiene Hoechst 33342 que llevan la etiqueta de NPCs en la cámara de electrotactic (usando los métodos descritos en3). </li></ol> 6. Los resultados representativos Cuando NPCs fueron expuestos a una amplia gama de EF fisiológicos que mostraban la migración de células altamente dirigido hacia el cátodo (Figura 1). La misma observación se hizo también en un nivel de células individuales en el modelo de la columna vertebral organotípico rebanada de médula ex vivo, un entorno 3D que imitan las condiciones in vivo (Figura 2). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3453/3453fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. PNJ muestran la migración dirigida de la SSC. PC, mostró una migración altamente dirigido hacia el cátodo cuando se expone a EF, líneas rojas y las flechas azules representan las trayectorias y la dirección de movimiento de las células (A). B muestra las rutas de migración de los NPCs. Bar: 50 m. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3453/3453fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. NPC trasplantados muestran migración dirigida hacia el cátodo en la rebanada de la médula espinal organotípico

<ol><li>Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+with+electric+potential%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Wound healing with electric potential.</a> N. Engl. J. Med. 356, 303-303 (2007).</li>
<li>McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+cell+behavior+electrically%3A+current+views+and+future+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Controlling cell behavior electrically: current views and future potential.</a> Physiol. Rev. 85, 943-943 (2005).</li>
<li>Borgens, R. B., Jaffe, L. F., Cohen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+and+persistent+electrical+currents+enter+the+transected+lamprey+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Large and persistent electrical currents enter the transected lamprey spinal cord.</a> PNAS. 77, 1209-1209 (1980).</li>
<li>Shapiro, S., Borgens, R., Pascuzzi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillating+field+stimulation+for+complete+spinal+cord+injury+in+humans%3A+a+phase+1+trial%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosurg.+Spine%22%5BJournal%5D)">Oscillating field stimulation for complete spinal cord injury in humans: a phase 1 trial.</a> J. Neurosurg. Spine. 2, 3-3 (2005).</li>
<li>Zhao, M., Song, B., Pu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+signals+control+wound+healing+through+phosphatidylinositol-3-OH+kinase-gamma+and+PTEN%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electrical signals control wound healing through phosphatidylinositol-3-OH kinase-gamma and PTEN.</a> Nature. 442, 457-457 (2006).</li>
<li>Yao, L., Shanley, L., McCaig, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+applied+electric+fields+guide+migration+of+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Small applied electric fields guide migration of hippocampal neurons.</a> J. Cell. Physiol. 216, 527-527 (2008).</li>
<li>Li, L., El-Hayek, Y. H., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct-current+electrical+field+guides+neuronal+stem%2Fprogenitor+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Direct-current electrical field guides neuronal stem/progenitor cell migration.</a> Stem Cells. 26, 2193-2193 (2008).</li>
<li>Meng, X., Arocena, M., Penninger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K+mediated+electrotaxis+of+embryonic+and+adult+neural+progenitor+cells+in+the+presence+of+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">PI3K mediated electrotaxis of embryonic and adult neural progenitor cells in the presence of growth factors.</a> Exp. Neurol. 227, 210-210 (2011).</li>
<li>Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+stromal+cells+promote+neurite+extension+in+organotypic+spinal+cord+slice%3A+significance+for+cell+transplantation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurorehabil.+Neural+Repair%22%5BJournal%5D)">Bone marrow stromal cells promote neurite extension in organotypic spinal cord slice: significance for cell transplantation therapy.</a> Neurorehabil. Neural Repair. 22, 447-447 (2008).</li>
<li>Shichinohe, H., Kuroda, S., Tsuji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+stromal+cells+promote+neurite+extension+in+organotypic+spinal+cord+slice%3A+significance+for+cell+transplantation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurorehabil.+Neural+Repair%22%5BJournal%5D)">Bone marrow stromal cells promote neurite extension in organotypic spinal cord slice: significance for cell transplantation therapy.</a> Neurorehabil. Neural Repair. 22, 447-447 (2008).</li>
<li>Song, B., Gu, Y., Pu, j <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+direct+current+electric+fields+to+cells+and+tissues+in+vitro+and+modulation+of+wound+electric+field+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol%22%5BJournal%5D)">Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo.</a> Nature Protocol. 2, 1479-1479 (2007).</li>
</ol>

No tenemos nada que revelar.

Los protocolos que utilizamos se basa en estudios previos 5,11. El uso de estos métodos, la cultura estable y eléctrica actuales condiciones se puede mantener mientras se aplica una EF a través de puentes de agar, la solución de Steinberg, y los electrodos de Ag / AgCl, a las células o rodajas cultivadas en cámaras electrotactic diseño personalizado de dimensiones normalizadas y precisa. La profundidad de las cámaras puede ser ajustada para adaptarse a diferentes espesores de la muestra 11, y en el...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> FGF-básico humano recombinante </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0026 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td> EGF humano recombinante </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0311 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td> N2-Suplemento (100X) de líquido </td><td> Invitrogen </td><td> 02048 </td><td></td></tr><tr><td> Medio DMEM/F12 (glucosa alta) </td><td> Invitrogen </td><td> 31330-095 </td><td></td></tr><tr><td> Poli-D-lisina </td><td> Millipore </td><td> Una-003-E </td><td></td></tr><tr><td> Natural de laminina de ratón </td><td> Invitrogen </td><td> 23017-015 </td><td></td></tr><tr><td> Factor de reducción del crecimiento de la membrana basal de matriz (Matrigel) </td><td> BD Biosciences </td&gt; <td> 354230 </td><td></td></tr><tr><td> Tampón HEPES </td><td> Gibco </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> McIlwain helicóptero del tejido </td><td> El Mickle Laboratorio de Ingeniería Co Ltd </td><td> TC752-PD </td><td></td></tr><tr><td> Dow Corning de alto vacío grasa de silicona </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z273554 </td><td></td></tr></tbody></table>

campo eléctrico controlado por migración dirigida de células progenitoras neurales en entornos 2d y 3d

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

Endógenos campos eléctricos (EFS) de forma natural en vivo y desempeñan un papel fundamental durante el desarrollo del tejido / órgano y la regeneración, incluida la de los 1,2 del sistema nervioso central. Estos FAN endógenos son generados por la regulación celular de transporte iónico en combinación con la resistencia eléctrica de las células y tejidos. Se ha informado de que aplicada EF tratamiento puede promover la reparación funcional de lesiones de la médula espinal en animales y humanos 3,4. En particular, EF-dirigida migración celular se ha demostrado en una amplia variedad de tipos celulares 5,6, incluyendo las células progenitoras neurales (NPC) 7,8. Aplicación de corriente continua (DC) FAN no es una técnica disponible en la mayoría de los laboratorios. Hemos descrito los protocolos de aplicación de los FAN DC a cultivos de células y tejidos previamente 5,11. Aquí presentamos un video de demostración de los métodos estándar basado en una intensidad de campo calculada para crear un 2Dd entornos 3D para los NPCs, y para investigar las respuestas celulares a la estimulación de EF en ambas condiciones de crecimiento de células individuales en 2D, y la porción de la médula espinal organotípico en 3D. El cordslice espinal es un tejido receptor ideal para el estudio del NPC comportamientos ex vivo, post-trasplante, debido a que la organización del tejido citoarquitectura está bien conservada dentro de estas culturas 9,10. Además, este modelo ex vivo también permite que los procedimientos que no sean técnicamente viables para rastrear las células in vivo utilizando lapso de tiempo de grabación en el nivel de células individuales. Es sumamente esencial para evaluar el comportamiento celular no sólo en un entorno 2D, sino también en una condición 3D organotípico que imita el entorno in vivo. Este sistema permitirá a imágenes de alta resolución con cubierta a base de platos de cristal en el tejido o el cultivo de órganos con seguimiento 3D de la migración celular solo in vitro y ex vivo y puede ser un paso intermedio antes de pasar a en vivo paradigmas.

Este protocolo muestra los métodos utilizados para establecer entornos 2D y 3D en las cámaras de electrotactic de diseño personalizado, que puede rastrear las células<em&gt; In vivo / ex vivo</em&gt; Con lapso de tiempo de grabación en el nivel de células individuales, a fin de investigar galvanotaxia o electrotaxis y otras respuestas celulares a la corriente directa (DC) los campos eléctricos (EFS).

Campo eléctrico controlado por migración dirigida de células progenitoras neurales en entornos 2D y 3D

Los campos eléctricos (CE) endógenos se producen de forma natural in vivo y desempeñan un papel fundamental durante el desarrollo y la regeneración de tejidos y órganos, incluyendo el de...

El objetivo general de este procedimiento es registrar el efecto de los campos eléctricos aplicados sobre la migración de células progenitoras neuronales en cultivos 2D y modelos 3D ex vivo. Esto se logra primero aislando y expandiendo células progenitoras neuronales in vitro. El segundo paso consiste en preparar una suspensión individual de células progenitoras neuronales.A continuación, para la preparación del cultivo en 2D, las células progenitoras neurales se siembran en cámaras electrotácticas diseñadas a medida. Alternativamente, para la preparación del modelo tridimensional *ex vivo*, las células progenitoras neurales se marcan con los ganchos 3, 3, 3, 4, 2, y se inyectan en un modelo organotípico de corte de médula espinal. Finalmente, se aplica un campo eléctrico a las cámaras electrotácticas y se realiza una grabación con lapse de tiempo para demostrar que las células progenitoras migran hacia el cátodo del campo eléctrico tanto en entornos 2D como 3D.La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un método novedoso para el seguimiento en tiempo real de la migración inducida por campo eléctrico de células individuales tras su trasplante en un modelo organotípico tridimensional, que se asemeja estrechamente al entorno natural. Este método no solo puede aportar información sobre la técnica electro, migración de células neuroentales trasplantadas en cortes de médula espinal, sino que también puede aplicarse a otros sistemas como modelos de cortes cerebrales pequeños. Para comenzar este procedimiento, prepare tiras de vidrio de 22 por 11 milímetros dividiendo la autoclave de 22 por 22 milímetros.Corte por la mitad cubreobjetos de grosor número uno utilizando un lápiz de diamante. A continuación, cree un pozo de vidrio independiente con dimensiones internas de 22 por 10 milímetros, pegando cuatro tiras de vidrio verticales de 22 por 11 milímetros entre sí mediante grasa de silicona de alto vacío; deje que el pozo se seque y endurezca completamente durante la noche. Al día siguiente, fije dos tiras de vidrio de 22 por 11 milímetros en paralelo una con otra, dejando un espacio de 10 milímetros respecto a la base de una placa de cultivo de 100 milímetros, utilizando grasa de silicona.Luego, selle la región entre estas tiras fijando un cubreobjetos de 22 por 22 milímetros con grasa de silicona. Coloque el recipiente de vidrio sobre los cubreobjetos de manera que las paredes internas creen un espacio confinado para sembrar las células. Aísle herméticamente todas las uniones con grasa de silicona.Recubra esta región confinada secuencialmente con poli-D-lisina, seguido de laminina, como se describe en el manuscrito adjunto. En este procedimiento, obtenga los cerebros de ratones E14 a E16 y colóquelos en medio basal D-MEM-F12 frío. A continuación, retire las meninges bajo un microscopio anatómico.A continuación, transfiera los cerebros a una placa de Petri de 35 milímetros. Utilice la pinza fina para disociar los cerebros en fragmentos de tejido. Luego, transfiéralos a un tubo centrífugo de 15 mililitros.Se centrifugaron las muestras a 800 RPM durante tres minutos para eliminar los restos de D. A continuación, se añadió A-D-M-E-M-F 12 que contenía BFDF y DGF a las muestras. Se trituran con una pipeta de un mililitro.Luego, obtenga la suspensión de células individuales utilizando un filtro para células. Siembre las células en los frascos a una concentración de 20.000 a 50.000 células por mililitro. A continuación, realice un cambio completo del medio cada tres días, lo que implica centrifugar las células a 1.300 RPM durante cinco minutos.Descarte el sobrenadante, suspenda el PT en medio fresco y regrese las células al frasco cada seis días tras al menos cinco. Transfiera los NEUROESFERAS a un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugue a 1.500 RPM durante cinco minutos. Descarte el sobrenadante.Re suspender el sedimento en trips en EDTA para obtener una suspensión de células individuales. Antes de realizar el recuento celular, preparar un mililitro de suspensión que contenga 10 000 células. A continuación, eliminar la laminina del pozo de vidrio y dejar que se seque completamente.Sustitúyalo con un mililitro de suspensión celular. A continuación, coloque la placa en el incubador a 37 grados Celsius durante un mínimo de cuatro horas para permitir la adhesión. Una vez que las células alcancen una cofluencia suficiente, retire el medio del cámara.Retire cuidadosamente el vidrio. Luego forme un techo sobre las células sujetando cuidadosamente una cubreobjetos de vidrio autoclavada de 22 por 22 milímetros entre dos tiras de 22 por 11 milímetros con grasa de silicona. Recuerde cubrir las células con unas gotas de medio para evitar que se sequen.Luego, forme un reservorio de medio aislado en cada extremo de la cámara creando dos barreras estancas de grasa de silicona que se extienden desde un extremo del recipiente hasta el otro. Llene la cámara con medio fresco, asegurando un flujo desde un reservorio de medio hacia el otro. Posteriormente, devuelva el recipiente al incubador durante 12 horas para permitir la recuperación celular.En el siguiente paso, prepare una tapa para cubrir el recipiente perforando dos orificios, uno colocado sobre cada reservorio de la cámara de migración. Luego, reemplace el medio en la cámara con medio de cultivo que contenga tampón hippies 25 milimolar. A continuación, transfiera el recipiente al sistema de imagen con control de temperatura.Establezca los parámetros experimentales para la grabación con lapse de tiempo y en múltiples posiciones. Alinee la cámara de modo que el cátodo y el ánodo queden a la izquierda y a la derecha, respectivamente, para asegurar que el vector del campo eléctrico se extienda horizontalmente, tal como se observa bajo el microscopio y se registra en el sistema de imagen. A continuación, llene dos vasos de precipitado.Con la solución de Steinberg. Conecte un vaso separado a cada reservorio de medio utilizando los puentes de vidrio previamente preparados llenos con solución de agar al 2 % en la solución de Steinberg. Luego, coloque los electrodos de plata conectados a una fuente de alimentación de corriente continua en la solución de Steinberg.En cada vaso de precipitados, coloque el regulador de voltaje de la fuente de alimentación en cero y enciéndala. Mida el voltaje a través de la cámara electrotáctica con un voltímetro mientras aumenta el regulador de voltaje. Luego, ajuste el voltaje según los requisitos del experimento.Después de eso, inicie la grabación lapse. Realice un cambio de medio y reajuste el voltaje según sea necesario. Cada hora, se pueden agregar al medio fresco fármacos o agentes químicos a los depósitos según sea necesario.Utilizando orificios adicionales perforados en la tapa de la placa de cultivo, uno situado sobre cada depósito de medio. En este paso, diseccionar las médulas espinales lumbares de ratones de dos semanas de edad. Luego, cortar las médulas espinales en secciones de 500 micrones de grosor con un cortador de tejidos machel wane bajo un microscopio anatómico.Separar las secciones y seleccionar aquellas con estructura intacta del cordón espinal sagital axial. A continuación, colocar las secciones en una placa de Petri de 100 milímetros que contenga 30 microlitros de gel MA. Colocarlas lo más cerca posible del centro.Manténgalos en una incubadora con 5% de dióxido de carbono a 37 grados Celsius durante al menos 30 minutos. Para que las proteínas de matrigel se autoensamblen y produzcan una película delgada que cubra la superficie de los cortes de médula espinal, es muy importante que el matrigel se haya ensamblado completamente. Incube la placa de Petri a 37 grados Celsius durante otros 30 minutos si es necesario, luego agregue de cuatro a seis mililitros de medio D-M-E-M-F 12 que contenga tampón hepes a 25 milimolares y 15 a 20% de suero fetal de ternera.Muy suavemente, para evitar que el medio fluya directamente sobre las rebanadas, asegúrese de que las rebanadas no estén completamente sumergidas en el medio, dejando la superficie de las berenjenas bien expuesta al aire. Cambie el medio dos veces por semana. Incube ahora la suspensión de células progenitoras neuronales en el medio con cinco micromoles de hooks.3, 3, 3, 4, 2 durante 30 minutos. Bajo un microscopio, utilice un tubo de vidrio capilar para microinyectar dos microlitros de suspensión en el corte de médula espinal. Asegúrese lentamente de que el tubo de vidrio capilar atraviese el matrigel y alcance el interior del corte de médula espinal.Mantenga el tubo de vidrio dentro del corte de médula espinal durante al menos 30 segundos para evitar la suspensión celular. Pase rápidamente, luego coloque la placa de Petri que contiene el corte de médula espinal en el incubador a 37 grados Celsius con 5 centímetros cúbicos de dióxido de carbono durante la noche. Al día siguiente, construya una cámara electrotáctica alrededor del corte de médula espinal que contenga células de neurogénesis etiquetadas 3 3 3 4 2 antes de aplicar un campo eléctrico que mida 500 milivoltios por milímetro.Aquí, las células progenitoras neurales muestran una migración altamente dirigida hacia el cátodo cuando se exponen a los campos eléctricos; las líneas rojas y las flechas azules representan respectivamente las trayectorias y la dirección del movimiento celular. Y aquí se muestra la gráfica de las trayectorias de migración. Aquí se observan las células progenitoras neurales marcadas con hooks 3 3, 3, 4 2.Fueron trasplantadas en el corte de médula espinal organotípica en el punto inicial del tratamiento con campo eléctrico. Después de que las células progenitoras neuronales migraron direccionalmente hacia el cátodo durante 2,5 horas, se invirtió la polaridad del campo eléctrico. La alteración de la polaridad del campo eléctrico desencadenó una brusca inversión del eje hacia el nuevo cátodo.Aquí se muestra una imagen de las células progenitoras neurales trasplantadas dentro de una sección de la médula espinal. Al final de la grabación de lapso de tiempo y la reconstrucción tridimensional de las células progenitoras neurales trasplantadas dentro de la sección de la médula espinal se muestra aquí. Dominio masivo.Esta técnica puede realizarse en dos semanas si se lleva a cabo correctamente después de su desarrollo. Esta técnica allana ahora el camino para que los investigadores en el campo de la biología celular exploren la migración de células progenitoras neurales en sistemas de cultivo 2D y 3D en respuesta a un campo eléctrico y su aplicación.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Nos demuestran que la sobreexpresión de los receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) mejora la motilidad de las células madre neurales (NSC) utilizando un nuevo gel de agarosa de microfluidos dispositivo basado. Esta tecnología puede ser fácilmente adaptable a otros sistemas de células de mamíferos, donde las fuentes de células son escasos, como las células madre neurales, y la vuelta el tiempo es crítico.

La evaluación de la motilidad de células madre neurales uso de un gel de agarosa al dispositivo basado en microfluídica

En este protocolo, se muestran cómo construir cámaras personalizados que permitan la aplicación de un campo eléctrico de corriente directa para activar el tiempo de imágenes a intervalos de cerebro adulto derivado translocación célula precursora neural durante galvanotaxia.

Un ensayo Galvanotaxis por análisis de la cinética precursoras neurales migración celular en un campo aplicado externamente directo Corriente Eléctrica

Este video demuestra el uso de un chip microfluídico recubierto de matriz extracelular para diferenciar células madre neurales y progenitoras o NPC a través de la estimulación eléctrica. Después de sembrarse y adherirse a la región recubierta, las NPC crecen y la aplicación de una corriente continua desencadena su diferenciación en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos.

Diferenciación inducida por estimulación eléctrica de células madre neurales y progenitoras

Se presenta un ensayo in vivo la migración ex célula que permite la cuantificación precisa de los nervios potencial de migración de células de la cresta entérica en la presencia de varios factores de crecimiento.

Un ensayo de migración celular cuantitativa para murinos entéricas Neuronales Progenitores

La migración de los neuroblastos es un paso crucial en la neurogénesis postnatal. El protocolo se describe aquí se puede utilizar para investigar el papel de los reguladores candidatos de la migración de los neuroblastos mediante el empleo de ADN / ARN de horquilla pequeña (shRNA) nucleofection y un ensayo de migración de neuroblastos 3D con aislados de la corriente migratoria rostral posnatal roedor.

Nucleofection de roedores neuroblastos para el Estudio de la Migración Neuroblast<em&gt; In vitro</em

Presentamos un método para aplicar un campo eléctrico fisiológico a las células prostáticas migratorias e inmortalizadas en una cámara de galvanotaxis hecha a medida. Usando este método, demostramos que 2 líneas de células prostáticas no tumorigénicas muestran diferentes grados de direccionalidad de migración en el campo.

Utilizando diseño personalizado galvanotaxia Cámaras para Estudiar direccional migración de las células de la próstata

La transición epitelial a mesenquimal (EMT) permite que los cánceres se vuelvan invasivos. Para investigar la EMT, se describe un modelo in vitro basado en células madre neurales (NSC) desprovisto de suero y enzimas. Este sistema estandarizado permite la evaluación cuantitativa y cualitativa de la migración celular, la expresión génica y proteica. El modelo es adecuado para el descubrimiento de fármacos.

Un modelo enzima y Cultura Neural Stem Cell libre de suero para la EMT Investigación Adecuado para el descubrimiento de fármacos

Nos muestra el desarrollo de los paquetes uno mismo-montado, tridimensionales de somata astrocytic longitudinalmente alineado y procesos dentro de un protector nuevo biomaterial. Estos diseñados "andamios de vida", que diámetro de la escala del micrón pero extiende centímetros de longitud, puede servir como bancos de pruebas para estudiar los mecanismos del desarrollo neurológico o facilitar la Neurorregeneración por dirige la migración neuronal y axonal pathfinding.

Ingeniería tisular tridimensional alineado astrositos redes para recapitular los mecanismos del desarrollo y facilitar la regeneración del sistema nervioso

En este estudio, presentamos un protocolo para la diferenciación de células madre neurales y progenitoras (NPC) inducidas únicamente por estimulación del pulso de corriente directa (DC) en un sistema microfluídico.

Diferenciación celular precursora neuronal inducida por campo eléctrico en dispositivos microfluídicos

Durante el desarrollo de la corteza cerebral, las neuronas y las células gliales se originan en la zona ventricular que recubre el ventrículo y migran hacia la superficie cerebral. Muchos genes están involucrados en este proceso. Este protocolo introduce la técnica para la obtención de imágenes en time-lapse de las neuronas migratorias y los progenitores gliales.

Imágenes de lapso de tiempo de neuronas migratorias y progenitores gliales en cortes de cerebro de ratón embrionario

Aprende a rastrear la migración de células progenitoras neurales en campos eléctricos usando cámaras electrotácticas personalizadas en entornos 2D y 3D. Este método permite estudiar la galvanotaxis celular en tiempo real.

Campo eléctrico controlado por migración dirigida de células progenitoras neurales en entornos 2D y 3D

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