Campo eléctrico controlado por migración dirigida de células progenitoras neurales en entornos 2D y 3D

El objetivo general de este procedimiento es registrar el efecto de los campos eléctricos aplicados sobre la migración de células progenitoras neuronales en cultivo 2D y modelos ex vivo 3D. Esto se logra primero aislando y expandiendo las células progenitoras neuronales neurales in vitro. El segundo paso es preparar una suspensión unicelular de células progenitoras neurales.

A continuación, para la preparación de cultivos en 2D, las células progenitoras neurales se recubren en cámaras electrotácticas diseñadas a medida. Alternativamente, para la preparación de modelos ex vivo en 3D, las células progenitoras neurales se marcan con los ganchos 3, 3, 3, 4, 2 y se inyectan en un modelo organotípico de corte de médula espinal. En última instancia, se aplica un campo eléctrico a las cámaras eléctricas y se realiza un registro de lapso de tiempo para mostrar que las células progenitoras migran hacia el cátodo del campo eléctrico tanto en entornos 2D como 3D.

La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un método novedoso para el seguimiento en vivo de la migración inducida por el campo eléctrico de células individuales después del trasplante a un modelo organotípico en 3D, muy parecido al entorno natural. Este método no solo puede proporcionar una inserción en la electrotécnica, la migración de las células neuro entales trasplantadas a un corte de la médula espinal, sino que también se puede aplicar a los otros sistemas que como modelos de corte de cerebro pequeños. Para comenzar este procedimiento, prepare tiras de vidrio de 22 por 11 milímetros dividiendo el autoclave 22 por 22 milímetros.

La cubierta de grosor número uno se desliza por la mitad con un bolígrafo de diamante. A continuación, cree un pozo de vidrio independiente de dimensiones interiores, 22 por 10 milímetros pegando cuatro verticalmente, colocando tiras de 22 por 11 milímetros juntas con grasa de silicona de alto vacío, permita que el pozo se seque y endurezca por completo durante la noche. Al día siguiente, coloque 2 tiras de vidrio de 22 por 11 milímetros paralelas entre sí, dejando un espacio de 10 milímetros hasta la base de un plato de cultivo de 100 milímetros con grasa de silicona.

A continuación, selle la región entre estas tiras colocando un cubreobjetos de 22 por 22 milímetros con grasa de silicona. Coloque el pozo de vidrio en los cubreobjetos de modo que las paredes interiores creen un espacio confinado para sembrar las celdas. Impermeabilizar todas las juntas con grasa de silicona.

Cubra esta región confinada secuencialmente con poli de licina, seguido de laminina como se describe en el manuscrito adjunto. En este procedimiento, obtenga los cerebros de ratones E 14 a E 16 y colóquelos en medio basal frío D-M-E-M-F 12. A continuación, retire las meninges bajo un microscopio anatómico.

Después de eso, transfiera los cerebros a una placa de Petri de 35 milímetros. Utilice las pinzas finas para disociar los cerebros en fragmentos de tejido. Luego transfiéralos a una centrífuga de tubo de 15 mililitros.

Las muestras a 800 RPM durante tres minutos para eliminar los residuos D. A continuación, A-D-M-E-M-F 12 que contiene BFDF y DGF a las muestras. Tritrate los comió con una pipeta de un mililitro.

A continuación, obtenga la suspensión de una sola célula con un colador de células. Coloque las células en los matraces a una velocidad de 20.000 a 50.000 células por mililitro. A continuación, realice un cambio completo del medio cada tres días, lo que implica centrifugar las células a 1.300 RPM durante cinco minutos.

Desechar el Resus supinado, suspender el PT en medio fresco y devolver las células al matraz cada seis días después de al menos cinco años. Transfiera las NEUROSPHERES a una centrífuga de tubo de 15 mililitros a 1.500 RPM durante cinco minutos. Deseche el supinado.

Vuelva a suspender el pellet en viajes en EDTA para producir una suspensión de una sola celda. Antes de realizar un recuento de células, prepare un mililitro de suspensión que contenga 10.000 células. A continuación, retire bien la laminina del vidrio y deje que se seque por completo.

Reemplázalo con un mililitro de suspensión celular. Después de eso, coloque el plato en la incubadora a 37 grados centígrados durante un mínimo de cuatro horas para permitir los accesorios. Una vez que las celdas estén lo suficientemente cofluentes, retire el medio de la cámara.

Retire con cuidado el vidrio. Bueno, luego forme un techo sobre las celdas colocando cuidadosamente una cubierta de vidrio de autoclave de 22 por 22 milímetros deslizada entre 2 tiras de 22 por 11 milímetros con grasa de silicona. Recuerda cubrir las células con unas gotas de medio para evitar que se sequen.

A continuación, forme un depósito de medio aislado en cada extremo de la cámara creando dos barreras de grasa de silicona herméticas que van de un extremo del plato al otro. Llene la cámara con medio fresco, asegurando un flujo de un depósito de medio a otro. Luego, regrese la placa a la incubadora durante 12 horas para permitir la recuperación de las células.

En el siguiente paso, prepare una tapa para cubrir el plato perforando dos orificios, uno colocado sobre cada depósito de la cámara de migración. A continuación, sustituya el medio de la cámara por un medio cultivado que contenga un tampón hippies de 25 milímetros. Después de eso, transfiera el plato al sistema de imágenes con control de temperatura.

Ajuste los parámetros experimentales para el lapso de tiempo y la grabación de múltiples posiciones. Alinee la cámara de modo que el cátodo y el ánodo estén a la izquierda y a la derecha respectivamente para garantizar que el vector del campo eléctrico funcione horizontalmente como se ve bajo el microscopio y se registra en el sistema de imágenes. A continuación, llene dos vasos de precipitados.

Con la solución de Steinberg. Conecte un vaso de precipitados independiente a cada depósito de medio utilizando los puentes de vidrio prepreparados previamente llenos de solución de agar de Steinberg al 2%. A continuación, coloque los electrodos de plata conectados a una fuente de alimentación de CC en la solución de Steinberg.

En cada vaso de precipitados, ponga a cero el dial de tensión de la fuente de alimentación y enciéndalo. Mida el voltaje a través de la cámara electrotáctica con un medidor de voltaje mientras sube el dial de voltaje. A continuación, ajuste el voltaje para adaptarlo a los requisitos experimentales.

Después de eso, inicie la grabación de lapso de tiempo. Realice un cambio de medio y reajuste el voltaje según sea necesario. Cada hora, se pueden agregar medicamentos o agentes químicos frescos y medianos a los depósitos, según sea necesario.

Usando orificios adicionales perforados en la tapa de la placa de cultivo, uno situado sobre cada depósito de medio. En este paso, disecciona la médula espinal lumbar de ratones de dos semanas de edad. A continuación, corte la médula espinal en secciones de 500 micras de grosor con un picador de tejido machel wane bajo un microscopio anatómico.

Separe las rodajas y seleccione las que tengan intacta la estructura de la médula espinal axial sagital. A continuación, coloque las rodajas en una placa de Petri de 100 milímetros que contiene 30 microlitros de gel MA. Colócalos lo más cerca posible del centro.

Manténgalos en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados durante al menos 30 minutos. Para que las proteínas del gel de matri se autoensamblen, para producir una película delgada que cubra la superficie de los cortes de la médula espinal, es muy importante que el gel de matri se haya ensamblado por completo. Incubar la placa de Petri a 37 grados centígrados durante otros 30 minutos si es necesario, luego agregar de cuatro a seis mililitros de medio D-M-E-M-F 12 que contenga 25 milimolares de tampón heis y 15 a 20% de suero fetal para terneros.

Muy suavemente para evitar el flujo medio directamente sobre las rodajas, asegúrese de que las rodajas no estén completamente sumergidas en el medio, dejando la superficie de las berenjenas bien expuesta al aire. Cambie el medio dos veces por semana. Ahora incube la suspensión de la célula progenitora neural en el medio con cinco ganchos micromolares.

3, 3, 3, 4, 2 durante 30 minutos. Bajo un microscopio, use un tubo de vidrio capilar para microinyectar dos microlitros de suspensión en la rodaja de la médula espinal. Lentamente, asegúrese de que el tubo de vidrio capilar pase a través de la matriz y llegue al interior de la rodaja de la médula espinal.

Mantenga el tubo de vidrio dentro de la rodaja de la médula espinal durante al menos 30 segundos para evitar la suspensión celular. Atropelle, luego coloque la placa de Petri que contiene la rebanada de la médula espinal en la incubadora a 37 grados centígrados con 5 centavos de dióxido de carbono durante la noche. Al día siguiente, construya una cámara electrotáctica alrededor del corte de la médula espinal que contenga ganchos 3 3 3 4 2 células de neurogénesis marcadas antes de aplicar un campo eléctrico de 500 milivoltios por milímetro.

Aquí, las células progenitoras neurales muestran una migración altamente dirigida hacia el cátodo cuando se exponen a los campos eléctricos, las líneas rojas y las flechas azules representan las trayectorias y la dirección del movimiento de la célula respectivamente. Y aquí está el gráfico de las rutas de migración que se muestran. Aquí están las células progenitoras neurales marcadas con ganchos 3, 3, 3, 4, 2.

Se trasplantaron al corte organotípico de la médula espinal en el punto de inicio del tratamiento con campo eléctrico. Después de que las células progenitoras neurales hayan migrado direccionalmente hacia el cátodo durante 2,5 horas, se invirtió la polaridad del campo eléctrico. La alteración de la polaridad del campo eléctrico desencadenó una brusca inversión de axxis hacia el nuevo cátodo.

Esta es una imagen de las células progenitoras neurales trasplantadas dentro del corte de la médula espinal. Al final de la grabación de lapso de tiempo se muestra una reconstrucción en 3D de las células progenitoras neurales trasplantadas dentro del corte de la médula espinal. Maestría en masa.

Esta técnica se puede realizar en dos semanas si se realiza correctamente después de su desarrollo. Esta técnica ahora allana el camino para que los investigadores en el campo de la biología celular exploren la migración de células prógenas neuronales en sistemas de cultivo 2D y 3D en respuesta y aplicación al campo eléctrico.