Name: Dinámica presináptica de dopamina estriatal en rodajas de cerebro de voltametría cíclica rápida de exploración (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Aprende a medir la dinámica presináptica de dopamina en rodajas de cerebro estriatal mediante voltametría cíclica rápida. Este método permite observar la liberación y recaptación de dopamina en tiempo real.

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Financiamiento proporcionado por el Instituto Nacional sobre el Abuso de Alcohol y Alcoholismo (NIAAA, AA-016967 y AA016967 01S1; TAM), Wayne State University en marcha los fondos, y Wayne State University Programa de Becas de Investigación. El contenido es responsabilidad exclusiva de sus autores y no representan la opinión oficial del NIAAA y los Institutos Nacionales de Salud.

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<li>Hashemi, P., Dankoski, E. C., Petrovic, J., Keithley, R. B., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltammetric+detection+of+5-hydroxytryptamine+release+in+the+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Voltammetric detection of 5-hydroxytryptamine release in the rat brain.</a> Anal. Chem. 81, 9462-9471 (2009).</li>
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<li>Budygin, E. A., John, C. E., Mateo, Y., Daunais, J. B., Friedman, D. P., Grant, K. A., Jones, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+ethanol+exposure+alters+presynaptic+dopamine+function+in+striatum+of+monkeys%3A+a+preliminary+study%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Chronic ethanol exposure alters presynaptic dopamine function in striatum of monkeys: a preliminary study.</a> Synapse. 50, 266-268 (2003).</li>
<li>Jones, S. R., Gainetdinov, R. R., Jaber, M., Giros, B., Wightman, R. M., Caron, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profound+neuronal+plasticity+in+response+to+inactivation+of+the+dopamine+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Profound neuronal plasticity in response to inactivation of the dopamine transporter.</a> PNAS. 95, 4029-4034 (1998).</li>
<li>Kennedy, R. T., Jones, S. R., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+observation+of+dopamine+autoreceptor+effects+in+rat+striatal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Dynamic observation of dopamine autoreceptor effects in rat striatal slices.</a> J. Neurochem. 59, 449-445 (1992).</li>
<li>Rice, M. E., Cragg, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+amplifies+reward-related+dopamine+signals+in+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nicotine amplifies reward-related dopamine signals in striatum.</a> Nat. Neurosci. 7, 583-584 (2004).</li>
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<li>Paredes, D., Grnaholm, A. C., Bickford, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+NGF+and+BDNF+on+baseline+glutamate+and+dopamine+release+in+the+hippocampal+formation+of+the+adult+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of NGF and BDNF on baseline glutamate and dopamine release in the hippocampal formation of the adult rat.</a> Brain. Res. 11141, 56-64 (2007).</li>
<li>Goggi, J., Puller, I. A., Carney, S. L., Bradford, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+pathways+involved+in+the+short-term+potentiation+of+dopamine+release+by+BDNF%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Res%22%5BJournal%5D)">Signalling pathways involved in the short-term potentiation of dopamine release by BDNF.</a> Brain. Res. 968, 156-161 (2003).</li>
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<li>Phillips, P. E., Stuber, G. D., Heien, M. L., Wightman, R. M., Carelli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subsecond+dopamine+release+promotes+cocaine+seeking%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Subsecond dopamine release promotes cocaine seeking.</a> Nature. 422, 614-618 (2003).</li>
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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El protocolo que aquí se presenta muestra cómo preparar y usar rodajas de cerebro de ratón coronal para experimentos FSCV. Aunque este método es específico para la obtención y medición de la dinámica de la dopamina, neurotransmisores tales como la adenosina, el peróxido de hidrógeno, norepinefrina y serotonina han sido controlados en vivo o in vitro con FSCV 3, 8 - 11. FSCV se puede utilizar para controlar algunos de estos neuroquímicos otras modificaciones simples de la forma de onda aplica...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Empresa </td><td> CAS </td></tr><tr><td width="274"> Reactivo </td><td></td><td></td></tr><tr><td width="274"> Cloruro de Potasio </td><td> Pescador </td><td width="142" valign="top"> 7447407 </td></tr><tr><td width="274"> De cloruro de sodio </td><td> EMD Chemicals </td><td width="142" valign="top"> 7647145 </td></tr><tr><td width="274"> Cloruro de magnesio </td><td width="194" valign="top"> Pescador </td><td width="142" valign="top"> 7791186 </td></tr><tr><td width="274"> Cloruro de calcio </td><td width="194" valign="top"> Pescador </td><td width="142" valign="top"> 10035048 </td></tr><tr><td width="274"> De bicarbonato de sodio </td><td width="194" valign="top"> EMD Chemicals </td><td width="142" valign="top"> 144558 </td></tr><tr><td width="274"> Fosfato de sodio, dibásico </td><td width="194" valign="top"> EMD Químicas </td><td width="142" valign="top"> 7558794 </td></tr><tr><td width="274"> D-glucosa </td><td width="194" valign="top"> Pescador </td><td width="142" valign="top"> 50997 </td></tr><tr><td width="274"> Ácido ascórbico </td><td width="194" valign="top"> Pescador </td><td width="142" valign="top"> 50817 </td></tr><tr><td width="274"> Sacarosa </td><td width="194" valign="top"> Pescador </td><td> 57501 </td></tr><tr><td width="274">&nbsp;</td><td width="194" valign="top">&nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td width="274"> Materiales </td><td width="194" valign="top"> Vendedor </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td width="274"> De fibra de carbono </td><td> Goodfellow Oakdale, PA </td><td></td></tr><tr><td width="274"> Capilar de vidrio </td><td> AM Sistemas Carlsborg WA. </td><td> 602000 </td></tr><tr><td width="274"> Alambre de plata </td><td> A-M Sistemas Carlsborg WA. </td><td> 787000 </td></tr><tr><td width="274"> Tungsteno electrodos estimulantes </td><td> Uno de los plásticos, Roanoke, VA </td><td></td></tr><tr><td width="274"> De alambre de platino </td><td></td><td></td></tr><tr><td width="274"> Cable conductor </td><td> Squires Electronics, Cornelius, OR </td><td></td></tr><tr><td width="274"> Loctite 404 adhesivos instantáneos </td><td> Hankal Corp. Rocky Hill CT. </td><td></td></tr><tr><td width="274"> Hoja de afeitar </td><td> World Precision Instruments Inc. FL. </td><td></td></tr><tr><td width="274"> BD aguja espinal </td><td> BD Medical Systems, Franlin Lake, NJ </td><td> REF 405234 </td></tr><tr><td width="274"> Hoja de bisturí </td><td> Plumas para maquinillas de afeitar Co. LTD. Japón </td><td></td></tr><tr><td width="274"></td><td></td><td></td></tr><tr><td width="274"> Software </td><td width="194" valign = &quot;top&quot;&gt; Vendedor </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td width="274"> TH software </td><td> ESA Inc., de Chelmsford, MA </td><td></td></tr><tr><td width="274"> Instrumento </td><td width="194" valign="top"> Vendedor </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td width="274"> Cámara de grabación de la inmersión </td><td> Costumbre Científico, Denver, CO </td><td></td></tr><tr><td width="274"> Neorolog aislador de estímulo </td><td> Digitmeter, Hertfordshire, Inglaterra </td><td></td></tr><tr><td width="274"> Controlador automático de temperatura </td><td> Warner Instrument Corporation </td><td></td></tr><tr><td width="274"> Microscopio (SZX7) </td><td> Olimpo </td><td></td></tr><tr><td width="274"> Microscopio </td><td> Pescador </td><td></td></tr><tr><td width="274"> Vibratome 3000 seccionamiento del sistema </td><td> San LouEs decir, MO. </td><td></td></tr><tr><td width="274"> Perfusión de la bomba </td><td> Watson Marlow Limited, Falmouth Cornwall - Inglaterra </td><td> H110708 </td></tr><tr><td width="274"> Micropipeta extractor </td><td> Narishige, Tokio, Japón </td><td></td></tr><tr><td width="274"> ChemClamp potenciostato </td><td> Dagan de Sociedades Anónimas, Minneapolis, MN. </td><td></td></tr></tbody></table>

dinámica presináptica de dopamina estriatal en rodajas de cerebro de voltametría cíclica rápida de exploración

Presynaptic Dopamine Dynamics in Striatal Brain Slices with Fast-scan Cyclic Voltammetry

Una amplia investigación se ha centrado en el neurotransmisor dopamina debido a su importancia en el mecanismo de acción de las drogas de abuso (cocaína y anfetaminas, por ejemplo), el papel que desempeña en las enfermedades psiquiátricas (esquizofrenia, por ejemplo, y déficit de atención e hiperactividad), y su participación en degenerativos trastornos como el Parkinson y la enfermedad de Huntington. En condiciones fisiológicas normales, la dopamina se sabe que regulan la actividad locomotora, la cognición, el aprendizaje, afecta emocional y la secreción de hormonas neuroendocrinas. Una de las mayores densidades de las neuronas de dopamina en el estriado es, que se pueden dividir en dos regiones distintas neuroanatómicas conocida como el núcleo accumbens y el núcleo caudado putamen. El objetivo es ilustrar un protocolo general para la voltametría cíclica corte rápido escaneo (FSCV) en el cuerpo estriado del ratón. FSCV es una técnica bien definida electroquímico proporciona la oportunidad de medir la liberación de dopamina y la captación en tiempo real en discrete regiones del cerebro. Microelectrodos de fibra de carbono (diámetro de aproximadamente 7 micras) se utilizan en FSCV para detectar la oxidación de la dopamina. La ventaja de la utilización de análisis para detectar FSCV dopamina es su mejor resolución temporal de 100 milisegundos y una resolución espacial de menos de diez micras, proporciona información complementaria a la microdiálisis in vivo.

El uso rápido de exploración voltametría cíclica para medir la dinámica evocada eléctricamente presináptica de dopamina estriatal en rodajas de cerebro.

Dinámica presináptica de dopamina estriatal en rodajas de cerebro de voltametría cíclica rápida de exploración

Se ha llevado a cabo una investigación exhaustiva sobre el neurotransmisor dopamina debido a su importancia en el mecanismo de acción de las drogas de abuso (p. ej., la cocaína y...

El objetivo general de este procedimiento es ilustrar un protocolo general para la telemetría de voltametría cíclica rápida en cortes. Esto se logra primero preparando el tejido cerebral para el corte coronal. Luego, se colocan electrodos en la región cerebral discreta de interés.El siguiente paso consiste en aplicar un voltaje en forma de onda triangular a través del electrodo para detectar la dopamina. Finalmente, se aplica un agente farmacológico de interés al corte cerebral y se observa su efecto sobre la dinámica dopaminérgica presináptica. En última instancia, este protocolo muestra cambios en la dinámica dopaminérgica presináptica, como la liberación de dopamina estimulada y las tasas de captación de dopamina mediante voltametría cíclica de barrido rápido Telemetry.Aunque este método puede proporcionar información sobre la dinámica de dopamina presináptica, también puede aplicarse a otros sistemas, incluyendo animales y neurotransmisores, como ratas y moscas de la fruta, y serotonina y noradrenalina, respectivamente. Quienes demostrarán el procedimiento serán Francis Mena, MEA Khalid y Erin oo, estudiantes de posgrado de mi laboratorio. Para comenzar este procedimiento, según el manuscrito adjunto, prepare tres tipos de soluciones de fluido espinal cerebral artificial: solución de sacarosa A-CSF-A-CSF para registros voltamétricos y una solución A-CSF modificada para la calibración del electrodo. A continuación, transfiera 10 mililitros de A-CSF con sacarosa a un vaso de precipitados pequeño y colóquelo en un recipiente con hielo. Luego, coloque el adhesivo instantáneo Loctite en un recipiente con hielo.A continuación, prepare una hoja de bisturí y las herramientas necesarias para la disección, como pinzas, espátula y tijeras, limpiándolas con una toallita con alcohol. Luego sacrifique un ratón mediante decapitación y extraiga rápidamente su cerebro. Coloque el cerebro en un vaso de precipitados con sacarosa fría con A CSF durante aproximadamente 10 minutos.Mientras tanto, prepare el VIBRAM para cortar. Coloque hielo triturado en el baño de la muestra. Luego coloque la cámara de la muestra en el Vibram y fíjela firmemente.Agregue más hielo alrededor de la cámara de la muestra para llenar los espacios y asegúrese de que no entre hielo en la cámara. Posteriormente, coloque una cuchilla de afeitar limpia en el soporte de la cuchilla. Luego, llene la cámara de la muestra con A CSF de sacarosa fría con hielo.Posteriormente, vierta algo de solución de sacarosa fría A CSF sobre una toalla de papel colocada en un plato de Petri invertido. Transfiera el cerebro de ratón recién diseccionado sobre esta superficie con un par de pinzas. A continuación, elimine el cerebelo cortando a lo largo del eje medial lateral con una hoja de afeitar.Esto crea una base plana que puede fijarse al soporte vibram. A continuación, agregue una gota del adhesivo Loctite sobre el portaobjetos. Fije inmediatamente el extremo plano del cerebro preparado al soporte y manténgalo lo más vertical posible.Luego coloque la platina en la cámara de la muestra y apriete el tornillo. Asegúrese de que el cerebro esté completamente sumergido en la solución de sacarosa A CSF dentro de la cámara. A continuación, ajuste la platina con el control para que la cuchilla de afeitar quede alineada con la parte superior del cerebro.Los parámetros óptimos para el vibrátomo se obtienen ajustando la frecuencia y la velocidad a niveles bajos. A continuación, establezca el grosor de la sección en 400 micrómetros. Las primeras secciones generalmente no contienen el estriado.Repita el corte hasta obtener las secciones que contengan el estriado. Una vez alcanzada la región AAL del estriado, utilice un pincel para levantar la sección y colocarla en un vaso de precipitados con solución salina amortiguada con CO₂ (CSF) oxigenada a temperatura ambiente.Típicamente, se pueden obtener tres o cuatro secciones que contienen el complejo estriatal en las que se incluyen el putamen caudado y el núcleo accumbens. Deje que las secciones se aclimaten en un ACSF burbujeado con 95 %O₂ y 5 %CO₂ a temperatura ambiente durante al menos una hora antes de proceder con el experimento. Para comenzar este procedimiento, conecte el tubo a la cámara de registro por inmersión.Luego, bombee el ACSF oxigenado a temperatura ambiente a una velocidad de un mililitro por minuto. Configure el controlador de temperatura a 32 grados Celsius después de que el ACSF haya llenado el portaobjetos personalizado. Retire cualquier burbuja de aire debajo de la malla utilizando una jeringa con aguja.Cree presión negativa en el tubo de salida con una jeringa para iniciar el flujo y controlar el desbordamiento del tampón. Coloque una toalla de papel Kim en el borde del porta-cortes para que actúe como mecha. Luego, transfiera un corte al porta-cortes en la cámara de registro, que se perfunde continuamente con A CSF oxigenado a temperatura ambiente.Sumerja el electrodo de referencia de cloruro de plata en el portaobjetos para cortes y conéctelo al cabezal mediante una pinza cocodrilo. Sujete el microelectrodo de fibra de carbono al micromanipulador y conéctelo al cabezal mediante una pinza cocodrilo. A continuación, baje el electrodo estimulante de tungsteno y el microelectrodo de fibra de carbono hasta la superficie del corte cerebral de sal.El electrodo estimulante se utilizará para aplicar un solo pulso o múltiples pulsos de estimulación eléctrica al corte para provocar la liberación de neurotransmisores y medir la dopamina evocada eléctricamente mediante voltametría cíclica de barrido rápido o FSCV, aplicando un voltaje en una forma de onda triangular al electrodo. Mantenga el potencial del microelectrodo de fibra de carbono en -0,4 voltios. Auméntelo hasta un límite positivo de 1,2 voltios.Luego, regrese a menos 0,4 voltios a una velocidad de barrido de 400 voltios por segundo. Estimule la sección cada cinco minutos y realice la medición volumétrica de la FLX de dopamina resultante durante 15 segundos cada vez, después de al menos tres. Las grabaciones de liberación de dopamina estimulada eléctricamente estables se definen como menos del 10 % de diferencia entre las alturas máximas.Cambie a perfundir la sección con un LCR que contenga el agente farmacológico de interés a un flujo de un mililitro por minuto durante 30 minutos para obtener un efecto máximo similar al registro basal. Registre la liberación eléctricamente estimulada de dopamina cada cinco minutos durante la perfusión farmacológica. La figura A es un ejemplo de la medición de la liberación de dopamina evocada eléctricamente mediante voltametría de escaneo rápido, tras una estimulación de pulso único en el cuerpo estriado.La figura B muestra un gráfico tridimensional de pseudocolor que combina la información de ambos, los rastreos de corriente versus tiempo y el voltamperograma cíclico de Graham. De manera similar, la figura A y C muestran la liberación de dopamina provocada por un único pulso de estimulación eléctrica en el núcleo y la cáscara del núcleo accumbens, respectivamente, y los gráficos tridimensionales de pseudocolor para el núcleo y la cáscara del núcleo accumbens se indican en la figura B y D, respectivamente. Aquí se muestran los rastreos representativos después de que la sección fue tratada con un agente farmacológico durante 30 minutos, seguido de estimulaciones con un solo pulso para provocar la liberación de dopamina en el putamen caudado.Los agentes utilizados en los experimentos son quinol, metanfetamina y factor neurotrófico derivado del cerebro. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar cortes coronales cerebrales de ratón para obtener y medir la dinámica dopaminérgica presináptica utilizando telemetría rápida y probablemente.

presynaptic-dopamine-dynamics-striatal-brain-slices-with-fast-scan

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Una nueva forma de medir la neurotransmisión ópticamente con análogos fluorescentes de la dopamina.

La liberación de dopamina en los terminales presinápticos individuales visualizados con FFNs

La técnica amperométrica mide la liberación de dopamina a partir de una única célula mediante la detección de la corriente oxidativo producido por la oxidación espontánea dopamina. Fijación de tensión simultánea y metodología amperometría revelar la relación mecanicista entre el general "actividad" del transportador de dopamina y el papel regulador de esta actividad en el transporte inverso de la dopamina.

Medición única célula de la liberación de dopamina simultánea con fijación de voltaje y Amperometría

Este video muestra la implantación de electrodos y cánulas en una rata anestesiada para medir la liberación de dopamina en el núcleo accumbens utilizando un potenciostato y la infusión de fármacos para modular la actividad dopaminérgica en el área tegmental ventral.

Monitorización de la liberación de dopamina en un modelo de rata con manipulación del receptor de neuronas dopaminérgicas VTA

Las rápidas fluctuaciones en la dopamina extracelular (DA) median tanto el procesamiento de la recompensa como el comportamiento motivado en los mamíferos. Este manuscrito describe el uso combinado de voltamperometría cíclica de barrido rápido (FSCV) y la administración intraoral de saborizantes para determinar cómo los saborizantes alteran la liberación rápida de dopamina en ratas despiertas que se mueven libremente.

Examen de Rapid dopamina Dinámica con Fast Scan voltametría cíclica Durante intraoral Administración saborizante en ratas Awake

La voltamperometría cíclica de exploración rápida puede monitorizar la neurotransmisión in vivo de dopamina en el contexto de fármacos, enfermedades y otras manipulaciones experimentales. Este trabajo describe la implementación de QNsim1.0, un software para modelar las respuestas de dopamina eléctricamente estimuladas de acuerdo con el modelo neurobiológico cuantitativo para cuantificar las estimaciones de liberación de dopamina y la dinámica de recaptura.

Modelado de datos de voltametría cíclica de exploración rápida de datos de neurotransmisión de dopamina estimulada eléctricamente usando QNsim1.0

El objetivo de este protocolo es manipular directamente los receptores del área tegmental ventral para estudiar su contribución a la liberación de dopamina de subsectores.

Infusión y estimulación combinadas con voltamperometría cíclica de exploración rápida (CIS-FSCV) para evaluar la regulación del receptor del área tegmental ventral de la dopamina fásica

Este informe demuestra una técnica para aislamiento mecánico de las neuronas individuales viable mantener unido boutons presináptica. Vibrodissociated neuronas tienen la ventaja de una rápida producción, el control farmacológico excelente y mejora del espacio-clamp sin la influencia de las células vecinas. Este método puede ser utilizado para obtener imágenes de los elementos sináptica y la grabación de patch-clamp.

Vibrodissociation de las neuronas del cerebro de roedores Rodajas para el Estudio de la transmisión sináptica y la imagen terminales presinápticos

Una forma sólida para estudiar las avalanchas neuronales, es decir, invariante en escala espacio-temporal de ráfagas de actividad, lo que indica la dinámica de estado crítico en la corteza. Avalanchas surgen espontáneamente en el desarrollo de las capas superficiales de la corteza cultivo que permite mediciones a largo plazo de la actividad con planos las redes distribuidas multi-electrodo (MEA) en condiciones controladas con precisión.

Electrodos múltiples grabaciones matriz de avalanchas neuronal en cultivos organotípicos

La interfase electrodo-tejido de electrodos de registro neural puede ser caracterizada con la espectroscopia de impedancia eléctrica (EIS) y voltametría cíclica (CV). Aplicación de máxima tensión de polarización de grabación cambios de las propiedades electroquímicas de la interfase electrodo-tejido y puede mejorar. Tensión de polarización, EIS, CV, y las grabaciones neuronales son complementarios.

Tensión de polarización, voltametría cíclica, y Espectroscopia de Impedancia Eléctrica para las interfaces neuronales

registros de pares son registros simultáneos de pinza de parche de célula completa de dos neuronas conectadas sinápticamente, lo que permite una caracterización electrofisiológica y farmacológica precisa de las sinapsis entre neuronas individuales. Aquí describimos la metodología detallada y los requisitos para establecer esta técnica en cultivos organotípicos de cortes de hipocampo en cualquier laboratorio equipado para electrofisiología.

Pareadas Grabaciones de células enteras en organotípicos de hipocampo rebanadas

Aprende a medir la dinámica presináptica de dopamina en rodajas de cerebro estriatal mediante voltametría cíclica rápida. Este método permite observar la liberación y recaptación de dopamina en tiempo real.

Dinámica presináptica de dopamina estriatal en rodajas de cerebro de voltametría cíclica rápida de exploración

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