Dinámica presináptica de dopamina estriatal en rodajas de cerebro de voltametría cíclica rápida de exploración

El objetivo general de este procedimiento es ilustrar un protocolo general para la telemetría de voltametría cíclica rápida en cortes. Esto se logra primero preparando el tejido cerebral para el corte coronal. Luego, se colocan electrodos en la región cerebral discreta de interés.

El siguiente paso consiste en aplicar un voltaje en forma de onda triangular a través del electrodo para detectar la dopamina. Finalmente, se aplica un agente farmacológico de interés al corte cerebral y se observa su efecto sobre la dinámica dopaminérgica presináptica. En última instancia, este protocolo muestra cambios en la dinámica dopaminérgica presináptica, como la liberación de dopamina estimulada y las tasas de captación de dopamina mediante voltametría cíclica de barrido rápido Telemetry.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la dinámica de dopamina presináptica, también puede aplicarse a otros sistemas, incluyendo animales y neurotransmisores, como ratas y moscas de la fruta, y serotonina y noradrenalina, respectivamente. Quienes demostrarán el procedimiento serán Francis Mena, MEA Khalid y Erin oo, estudiantes de posgrado de mi laboratorio. Para comenzar este procedimiento, según el manuscrito adjunto, prepare tres tipos de soluciones de fluido espinal cerebral artificial: solución de sacarosa A-CSF-A-CSF para registros voltamétricos y una solución A-CSF modificada para la calibración del electrodo. A continuación, transfiera 10 mililitros de A-CSF con sacarosa a un vaso de precipitados pequeño y colóquelo en un recipiente con hielo. Luego, coloque el adhesivo instantáneo Loctite en un recipiente con hielo.

A continuación, prepare una hoja de bisturí y las herramientas necesarias para la disección, como pinzas, espátula y tijeras, limpiándolas con una toallita con alcohol. Luego sacrifique un ratón mediante decapitación y extraiga rápidamente su cerebro. Coloque el cerebro en un vaso de precipitados con sacarosa fría con A CSF durante aproximadamente 10 minutos.

Mientras tanto, prepare el VIBRAM para cortar. Coloque hielo triturado en el baño de la muestra. Luego coloque la cámara de la muestra en el Vibram y fíjela firmemente.

Agregue más hielo alrededor de la cámara de la muestra para llenar los espacios y asegúrese de que no entre hielo en la cámara. Posteriormente, coloque una cuchilla de afeitar limpia en el soporte de la cuchilla. Luego, llene la cámara de la muestra con A CSF de sacarosa fría con hielo.

Posteriormente, vierta algo de solución de sacarosa fría A CSF sobre una toalla de papel colocada en un plato de Petri invertido. Transfiera el cerebro de ratón recién diseccionado sobre esta superficie con un par de pinzas. A continuación, elimine el cerebelo cortando a lo largo del eje medial lateral con una hoja de afeitar.

Esto crea una base plana que puede fijarse al soporte vibram. A continuación, agregue una gota del adhesivo Loctite sobre el portaobjetos. Fije inmediatamente el extremo plano del cerebro preparado al soporte y manténgalo lo más vertical posible.

Luego coloque la platina en la cámara de la muestra y apriete el tornillo. Asegúrese de que el cerebro esté completamente sumergido en la solución de sacarosa A CSF dentro de la cámara. A continuación, ajuste la platina con el control para que la cuchilla de afeitar quede alineada con la parte superior del cerebro.

Los parámetros óptimos para el vibrátomo se obtienen ajustando la frecuencia y la velocidad a niveles bajos. A continuación, establezca el grosor de la sección en 400 micrómetros. Las primeras secciones generalmente no contienen el estriado.

Repita el corte hasta obtener las secciones que contengan el estriado. Una vez alcanzada la región AAL del estriado, utilice un pincel para levantar la sección y colocarla en un vaso de precipitados con solución salina amortiguada con CO₂ (CSF) oxigenada a temperatura ambiente.

Típicamente, se pueden obtener tres o cuatro secciones que contienen el complejo estriatal en las que se incluyen el putamen caudado y el núcleo accumbens. Deje que las secciones se aclimaten en un ACSF burbujeado con 95 %O₂ y 5 %CO₂ a temperatura ambiente durante al menos una hora antes de proceder con el experimento. Para comenzar este procedimiento, conecte el tubo a la cámara de registro por inmersión.

Luego, bombee el ACSF oxigenado a temperatura ambiente a una velocidad de un mililitro por minuto. Configure el controlador de temperatura a 32 grados Celsius después de que el ACSF haya llenado el portaobjetos personalizado. Retire cualquier burbuja de aire debajo de la malla utilizando una jeringa con aguja.

Cree presión negativa en el tubo de salida con una jeringa para iniciar el flujo y controlar el desbordamiento del tampón. Coloque una toalla de papel Kim en el borde del porta-cortes para que actúe como mecha. Luego, transfiera un corte al porta-cortes en la cámara de registro, que se perfunde continuamente con A CSF oxigenado a temperatura ambiente.

Sumerja el electrodo de referencia de cloruro de plata en el portaobjetos para cortes y conéctelo al cabezal mediante una pinza cocodrilo. Sujete el microelectrodo de fibra de carbono al micromanipulador y conéctelo al cabezal mediante una pinza cocodrilo. A continuación, baje el electrodo estimulante de tungsteno y el microelectrodo de fibra de carbono hasta la superficie del corte cerebral de sal.

El electrodo estimulante se utilizará para aplicar un solo pulso o múltiples pulsos de estimulación eléctrica al corte para provocar la liberación de neurotransmisores y medir la dopamina evocada eléctricamente mediante voltametría cíclica de barrido rápido o FSCV, aplicando un voltaje en una forma de onda triangular al electrodo. Mantenga el potencial del microelectrodo de fibra de carbono en -0,4 voltios. Auméntelo hasta un límite positivo de 1,2 voltios.

Luego, regrese a menos 0,4 voltios a una velocidad de barrido de 400 voltios por segundo. Estimule la sección cada cinco minutos y realice la medición volumétrica de la FLX de dopamina resultante durante 15 segundos cada vez, después de al menos tres. Las grabaciones de liberación de dopamina estimulada eléctricamente estables se definen como menos del 10 % de diferencia entre las alturas máximas.

Cambie a perfundir la sección con un LCR que contenga el agente farmacológico de interés a un flujo de un mililitro por minuto durante 30 minutos para obtener un efecto máximo similar al registro basal. Registre la liberación eléctricamente estimulada de dopamina cada cinco minutos durante la perfusión farmacológica. La figura A es un ejemplo de la medición de la liberación de dopamina evocada eléctricamente mediante voltametría de escaneo rápido, tras una estimulación de pulso único en el cuerpo estriado.

La figura B muestra un gráfico tridimensional de pseudocolor que combina la información de ambos, los rastreos de corriente versus tiempo y el voltamperograma cíclico de Graham. De manera similar, la figura A y C muestran la liberación de dopamina provocada por un único pulso de estimulación eléctrica en el núcleo y la cáscara del núcleo accumbens, respectivamente, y los gráficos tridimensionales de pseudocolor para el núcleo y la cáscara del núcleo accumbens se indican en la figura B y D, respectivamente. Aquí se muestran los rastreos representativos después de que la sección fue tratada con un agente farmacológico durante 30 minutos, seguido de estimulaciones con un solo pulso para provocar la liberación de dopamina en el putamen caudado.

Los agentes utilizados en los experimentos son quinol, metanfetamina y factor neurotrófico derivado del cerebro. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar cortes coronales cerebrales de ratón para obtener y medir la dinámica dopaminérgica presináptica utilizando telemetría rápida y probablemente.