La detección de la hipoxia Microrregional en corteza cerebral de ratón por la imagen de dos fotones de fluorescencia endógena NADH

El objetivo general de este procedimiento es visualizar directamente la hipoxia tisular microrregional en la corteza del ratón in vivo. Esto se logra preparando primero una ventana craneal abierta del cráneo en un ratón anestesiado. A continuación, se inyecta un tinte fluorescente por vía intravenosa para marcar los vasos sanguíneos cerebrales.

Finalmente, se realizan imágenes concurrentes a los fotones de la fluorescencia intrínseca de NADH y la microvasculatura cortical marcada con fluorescencia. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran hipoxia funcional en micro regiones del parénquima cerebral a través de la visualización de la presencia de la forma reducida de nicotinamida, dinucleótido de adenina. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como los electrodos estilo Clark, es que proporciona una alta resolución especial sobre el gran campo de visión y también es menos invasiva.

Este método se puede llevar a cabo en un sistema de dos fotos de aplicación estándar con dos canales fluorescentes. Hola, soy Steve Hurst, profesor y presidente de microbiología e inmunología en la Universidad de Rochester, demostrando el procedimiento de hoy será el hijo de Anita del Laboratorio Kishka, así como Oxana Paulka, profesora asistente de investigación de mi laboratorio, el Dr. Kishka, quien fue pionero en la técnica de imágenes NADH, no puede estar aquí hoy porque se mudó recientemente a Alemania. Después de preparar el sitio quirúrgico con los instrumentos necesarios que han sido esterilizados en autoclave o desinfectados con 70% de etanol y el ratón ha sido anestesiado con 5% de flúor, colóquelo sobre una almohadilla térmica y aplique una mascarilla facial para administrar 1.3 a 1.5% de flúor en el aire.

Verifique el nivel de anestesia realizando un pellizco en la cola. A continuación, inserte una sonda rectal y mida continuamente la temperatura corporal del animal durante todo el procedimiento. Aplica gel lagrimal artificial en los ojos del ratón para evitar que se sequen.

Luego retire el vello de la cabeza y ambos muslos aplique depilador en el muslo durante dos minutos para eliminar el vello restante, el muslo se utilizará para la oximetría. Por último, desinfectar el cuero cabelludo con una solución de povidona yodada al 10% y etanol al 70%. Para hacer una ventana craneal empezando por cinco milímetros mimada hasta el cráneo con unas tijeras.

Haz una incisión en el cuero cabelludo y avanza un centímetro. Mueva la piel hacia los lados para exponer el cráneo Para quitar las membranas de la parte superior del cráneo. Aplique una solución de cloruro férrico al 10%.

Limpie el exceso de solución y raspe las membranas con un ángulo de 45 grados. Número cinco, pinzas Usando un microscopio de disección, identifique el área de interés. Aplique una capa delgada de pegamento rápido alrededor de los bordes de la ventana de la placa principal.

Coloque la placa principal de tal manera que el área de interés quede expuesta en la ventana y aplique una ligera presión sobre la placa principal. Aplique una pequeña cantidad de cemento dental para polimerizar el pegamento rápidamente. Sostén durante 10 segundos mientras el pegamento se polimeriza.

Aplica una pequeña cantidad de pegamento rápido en los bordes de la ventana para sellar la placa de la cabeza y la calavera. A continuación, atornille la placa de la cabeza al soporte para animales situado debajo del visor de disección. Utilizando el juego de dos brocas de micro par a 6, 000 RPM y la broca IRF 0 0 5.

Retira todo el pegamento extra de la calavera y de la placa de la cabeza. Luego configure el taladro a mil RPM y comience a perforar el cráneo haciendo un círculo dentro de la ventana de la placa principal con un diámetro de aproximadamente cinco milímetros. Usa movimientos ligeros de barrido como si estuvieras dibujando con un lápiz muy suave.

Deje de perforar cada 20 a 30 segundos y use aire comprimido para eliminar el polvo óseo. A medida que avanza la perforación, se forma una madriguera alrededor del cráneo intacto en el centro. Tenga cuidado de no hurgar a través del cráneo delgado, pero asegúrese de que esta madriguera tenga el grosor uniforme.

Además, tenga mucho cuidado alrededor de los vasos sanguíneos grandes. No deben comprometerse y, si es posible, ni siquiera tocarse Con una punta de pinza, levante el hueso en el centro de la ventana y aplique una gota de líquido cefalorraquídeo artificial en la ventana. Con la esquina de una toallita Kim, limpie suavemente el líquido cefalorraquídeo artificial con un ángulo de 45 grados.

Número cinco, pinzas. Localiza una región de duramadre dañada a lo largo del borde de la ventana y levántala para extraerla. Si se produce sangrado, aplique una gota de líquido cefalorraquídeo artificial y espere de dos a tres minutos para que se detenga el sangrado menor.

A continuación, prepare 10 mililitros de aerodinámica de bajo punto de fusión al 0,07% disuelto en líquido cefalorraquídeo artificial. Lleva los aeros derretidos a la temperatura corporal. Limpie el exceso de líquido cefalorraquídeo artificial de la superficie del cerebro.

Vierta los aeros en la ventana y cúbrala con un portaobjetos de vidrio. A continuación, presione el cristal suavemente para hacer contacto entre el cristal y la placa principal y espere de 10 a 20 segundos hasta que la aerodinámica esté sólida. Con pinzas y papel de seda suave, retire el exceso de aerodinámica de la cubierta de vidrio.

Coloque una pequeña cantidad de pegamento rápido alrededor del vidrio para pegarlo a la placa principal. A continuación, aplique una pequeña cantidad de cemento dental para solidificar el pegamento e inyectarlo en la vena femoral. Voltee al animal parcialmente para exponer el interior del muslo izquierdo.

Use cinta adhesiva para asegurar al animal. En esta posición, aplique un exfoliante antiséptico y luego etanol al cien por cien sobre la piel. A continuación, haga una incisión a lo largo de la parte medial del muslo desde la rodilla hasta la síntesis púbica.

Si es necesario, separar los tejidos blandos mediante disección roma. Llene una jeringa de un mililitro con 130 microlitros de rojo Texas. Coloque una nueva aguja de calibre 30 y dóblela con cuidado en un ángulo de 30 grados, manteniendo el bisel hacia arriba.

Llene la aguja con Texas Red Solution bajo un microscopio de disección, inserte la aguja en la vena femoral e inyecte cien microlitros de Texas red. Retire la aguja y presione ligeramente la vena con una gasa para detener el sangrado. Cierre la piel con cuatro suturas para un control continuo de la saturación de oxígeno en sangre.

Coloque la sonda del oxímetro en el muslo derecho del que se extrajo previamente el vello. Para comenzar la obtención de imágenes, transfiera el ratón preparado quirúrgicamente a la etapa del microscopio. Tome una fotografía inicial del sitio de la ventana craneal utilizando iluminación de campo claro con un aumento de cuatro x para usarla como mapa de referencia para el registro con mayor aumento a los aníes de fotones.

Acérquese al área de interés con un aumento de 10x. Seleccione un área de interés en las capas corticales. Uno o dos comienzan a registrar las series temporales.

Recomendamos utilizar una media de tres a cinco fotogramas para aumentar la calidad de la imagen. A continuación, induce la hipoxemia añadiendo un 50% de nitrógeno al aire que respira el animal. Esto llevará el nivel de oxígeno al 10%Verifique la hipoxemia monitoreando los datos del oxímetro.

Continúe registrando la serie de tiempo a través de la hipoxemia durante unos 30 segundos y después de que se restablezca el nivel normal de oxígeno. Recopilar datos para el cálculo de la distribución de oxígeno mediante la detección, medición y cuantificación del área de hipoxia y los cilindros de tejido oxigenado alrededor de los vasos sanguíneos. Para determinar el radio del cilindro de tejido croak R, mida la distancia entre el centro del vaso sanguíneo y el límite en el que se detecta una fluorescencia alta de NADH.

Consulte el protocolo escrito para conocer los métodos de procesamiento de datos. Esta figura muestra imágenes concurrentes de NADH y geografía de video grabadas durante la hipoxemia transitoria, la concentración de oxígeno inspirada se redujo del 21% al 10% durante un período de tres minutos. Este nivel de hipoxemia inducida experimentalmente es suficiente para inducir hipoxia severa en la corteza cerebral.

La hipoxia condujo a un aumento en la fluorescencia del NADH que se muestra en verde inicialmente en las áreas más alejadas del suministro de sangre arterial. Obsérvense los límites tisulares nítidos del NADH, que representan los límites tisulares observables de la difusión de oxígeno desde la microcirculación cortical que se muestran en rojo. Aquí hay una imagen concurrente de los microvasos marcados con fluorescencia de la corteza en rojo, y la fluorescencia intrínseca de NADH de la materia gris de la corteza en verde, la distribución de la intensidad de fluorescencia de NADH es binaria.

Hay áreas con fluorescencia de NADH uniformemente baja y áreas con fluorescencia de NADH uniformemente alta. Las líneas amarillas representan los límites tisulares entre las áreas con fluorescencia de NADH baja y alta. Estos límites tisulares exhiben una relación espacial con los microvasos cercanos.

Esta relación está determinada por la difusión de oxígeno desde los microvasos al tejido. En algunos casos, la naturaleza cilíndrica o el cilindro de tejido CRO de estos límites de tejido se pueden reconocer directamente, como lo indican las líneas azules. Aquí, el límite del tejido es de forma circular con un vaso sanguíneo central concéntrico una vez dominado.

Esta técnica se puede realizar en 1,5 horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar pegar el cubreobjetos a la placa metálica para evitar el movimiento vertical de la superficie cortical debido al edema. Después de este procedimiento, se pueden realizar análisis adicionales, como mediciones de la hiperemia funcional, con el objetivo de abordar cuestiones adicionales, como la relación entre la hipoxia tisular y el acoplamiento cerebrovascular.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo visualizar la hipoxia tisular microrregional en la corteza del ratón.