Anotación de la función de genes de plantas a través de la genómica, la metabolómica combinados e Informática

El objetivo general del siguiente experimento consiste en descubrir y caracterizar nuevas funciones genéticas mediante la anotación de genes a través del análisis combinado del perfilado de metabolitos y del análisis de coexpresión. Esto se logra mediante la consideración del diseño experimental con un enfoque en rutas metabólicas específicas y en especies vegetales. Como segundo paso, se utilizan enfoques analíticos para construir la ruta metabólica completa basándose en las estructuras químicas de los compuestos detectados.

A continuación, la estructura de la vía predicha se integra con el análisis de coexpresión para delimitar los genes candidatos, que indican putativamente los genes clave del metabolismo. Finalmente, se obtienen los resultados mediante un número mínimo de experimentos con un uso eficiente de diversos recursos biológicos, con el fin de caracterizar la identificación funcional de los genes. Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando encontramos una correlación muy alta entre los genes quísticos Abosi OID en la base de datos de coexpresión denominada ate.

Consideramos que esta estrategia es una de las formas más rápidas de encontrar funciones de nuevos genes mediante el uso de datos disponibles públicamente en bases de datos y el aprovechamiento eficiente de recursos biológicos. Para iniciar la extracción, recolecte los materiales vegetales y congélelos inmediatamente en nitrógeno líquido. Una vez convertidos en polvo congelado, triture los materiales vegetales utilizando un molino mezclador, alícuote el material vegetal congelado en un tubo EOR de dos mililitros y luego agregue una bola de metal al tubo.

Añada 250 microlitros de tampón de extracción por cada 50 miligramos de muestra. El tampón de extracción contiene el estándar interno para normalización. Después, homogenice el polvo congelado con el molino mezclador durante dos minutos.

Con una frecuencia de 25, centrifugue la muestra a 12.000 RPM durante 10 minutos. Luego, transfiera el sobrenadante a un filtro centrífugo. Después de realizar una segunda ronda de centrifugación, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo einor.

A continuación, prepare el HPLC verificando primero que la temperatura del horno de columna sea de 35 grados Celsius y que la de la bandeja de muestras sea de 10 grados Celsius. Configure las condiciones de espectrometría de masas y verifique el estado del vacío y del capilar de calentamiento. Realice una calibración de masa sobre carga del detector de MS mediante inyección por infusión de la mezcla de solución de calibración.

Utilizando la aplicación de calibración automática en el software. Luego, transfiera 50 microlitros de los extractos a un vial de vidrio. Para HPLC, realice al menos cinco inyecciones de tampón de extracción antes de llevar a cabo el análisis de la primera muestra, según se describe en el procedimiento escrito.

Después de configurar una herramienta de análisis de espectrometría de masas, seleccione los datos que se procesarán. Prepare una tabla con los picos detectados de interés de acuerdo con la clase de compuesto indicada en el protocolo escrito. Identifique los picos mediante coevolución con compuestos patrón e identifique los picos detectados mediante análisis Ms.Ms, literatura, revisión y búsqueda en bases de datos de metabolitos en este paso.

La predicción de la vía debe basarse en las estructuras químicas mediante la vinculación de la función enzimática en la vía metabólica. Por lo tanto, estos pasos deben realizarse mediante la identificación precisa de los compuestos detectados. Las bases de datos de vías metabólicas generales, como la base de datos KEGG y PlantCyc, son muy efectivas para la predicción de la vía metabólica de interés.

Para preparar una lista de genes con genes ortólogos de Arabidopsis, primero descargue una lista de identificadores de genes desde la base de datos genómica. Agregue el identificador de genes de Arabidopsis de los genes ortólogos en caso de que la planta objetivo no sea Arabidopsis. Luego, prepare una lista de genes en la vía de interés.

La anotación de datos de vías de Arabidopsis y datos de familias de genes está disponible en el sitio web de TAAR. Posteriormente, se pueden combinar listas de genes ortólogos de Arabidopsis. Realice un análisis de red de coexpresión utilizando la lista de identificadores de genes preparada para buscar en la mejor base de datos la vía predicha.

Comprobación de la correlación de pares de genes ampliamente conocidos en la vía de interés. Si no están disponibles bases de datos de coexpresión o de expresión génica. En el plan de interés, debe utilizarse la base de datos de coexpresión de Arabidopsis junto con una lista de genes ortólogos de Arabidopsis.

A continuación, construya el marco para la red de coexpresión objetivo. Basándose en las conexiones de los genes bien conocidos en la vía de interés, agregue los genes candidatos correlacionados y verifique su anotación genética en las familias predichas respecto a las conexiones de esta red para encontrar el mejor candidato.

El umbral de genes del valor del coeficiente debe coordinarse según la estructura de la red y la densidad de genes correlacionados. Ahora, elabore una lista de genes que puedan reducirse como especializados en la vía objetivo. Con esta lista, revise la expresión génica de las especificidades orgánicas y las respuestas al estrés de los genes candidatos.

Comience la integración de la información agregando genes bien caracterizados que se hayan utilizado como consulta para análisis de coexpresión a la vía metabólica predicha. Realice una búsqueda bibliográfica para verificar si las partes no caracterizadas de esta vía son novedosas, incluyendo pasos enzimáticos, proteínas de transporte y factores de transcripción no caracterizados. En este punto, prediga la anotación génica más adecuada para estos pasos faltantes no caracterizados.

Combinar los resultados del perfilado de metabolitos y los genes candidatos de expresión génica in silico basados en la vía predicha. A continuación, organice los genes candidatos en la vía predicha de acuerdo con la función del gen. Por ejemplo, acetil transferasa para el metabolito acetilado, glucosil transferasa para el glucósido y P cuatro 50 para el compuesto oxidado.

Verifique la consistencia de las especificidades tisulares o las respuestas al estrés entre la acumulación de metabolitos y el nivel de expresión génica de los genes candidatos. Asimismo, examine las conexiones con otros metabolismos para proporcionar sustratos y genes responsivos al estrés. Como paso final, realice un experimento para la identificación de la función génica utilizando bio-recursos, tales como bibliotecas de mutantes con deleción génica y bibliotecas de ADNc de longitud completa. Mostrado.

A continuación se muestra un ejemplo de análisis de red de co-regulación de la vía de las antocianinas. Los análisis de co-expresión se realizaron utilizando el índice de co-expresión PRAM basado en el conjunto de datos de la versión tres adicional, con el programa PX mostrado como nodos rojos; se utilizaron 12 genes enzimáticos de antocianinas y dos factores de transcripción para la producción de antocianinas en la búsqueda de genes candidatos. Una red de co-expresión que incluye 68 genes candidatos correlacionados y 14 genes de consulta se reconstruyó mediante la interconexión de búsquedas utilizando la base de datos Prime, lo que resultó en archivos de salida T net que se representaron gráficamente usando el software PX.

Los nodos azules indican los genes candidatos que se correlacionaron con los genes de antocianinas tras su desarrollo. Esta estrategia nos dará una buena indicación para predecir funciones genéticas novedosas en los metabolismos vegetales.