Análisis de la posición del ciclo celular en células de mamífero

El objetivo de este procedimiento es poder determinar la proporción de células en las diferentes fases del ciclo celular. Esto se logra agregando primero el reactivo de marcaje de proliferación celular BRDU a un cultivo celular viable para su incorporación en la siguiente tinción de ADN recién sintetizado, el BRDU en las células que han incorporado los reactivos, luego el ADN se tiñe con yoduro de propidio. El último paso es evaluar la proporción de células en las diferentes fases del ciclo celular mediante citometría de flujo.

En última instancia, la distribución del ciclo celular de una población de células experimentales se puede visualizar a través del análisis de citometría de flujo de células marcadas con BRDU. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la incorporación de tri a tomillo y el recuento de centelleo, es que con el marcaje BRD se puede determinar la proporción de células en cada fase del ciclo celular. La demostración visual de este mensaje es fundamental, ya que el conjunto de análisis citométrico es difícil de explicar sin imágenes acompañadas de los diferentes parámetros que deben ajustarse.

Demostrando el procedimiento estarán dos estudiantes graduados de mi laboratorio, Matt Chii y yo Miri. AGREGUE BRDU en una dilución de uno a 1000 a los cultivos celulares experimentales, incube durante una hora para cosechar las células, aspire el medio de cultivo y luego lave las células a fondo con PBS dos veces para eliminar todos los rastros de medio. Esta vez, utilizando PBS suplementado con EDTA de tres milimolares, enjuague los cultivos rápidamente una vez más y luego aspire la solución de P-B-S-E-D-T-A a fondo para separar las células.

Agregue alrededor de 0,5 mililitros de P-B-S-E-D-T-A a cada placa de cultivo de seis centímetros e incube las placas a 22 grados centígrados durante aproximadamente cinco minutos. A continuación, transfiera los cultivos celulares de cada placa a tubos cónicos individuales de 15 mililitros. Ahora centrifugue las células a 500 veces la gravedad durante cinco minutos a temperatura ambiente y luego retire el supinato, luego vuelva a suspender las células en 100 microlitros de PBS.

Finalmente, fije las celdas agregando cinco mililitros de etanol al 95% gota a gota mientras centrifusiona las celdas en vórtice a 500 veces la gravedad durante cinco minutos a temperatura ambiente. Una vez más, retire el etanol y vuelva a suspender el pellet en un mililitro de dos HCL normales que contengan 0.5%Triton X 100 agregando la solución a las celdas gota a gota mientras se agita el vórtice y luego incube las celdas a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de peletizar las células, aspire nuevamente el sobrenadante S, teniendo especial cuidado ya que las celdas forman una bolita muy suelta en este paso.

A continuación, vuelva a suspender suavemente el pellet en un mililitro de tetra diámetro sódico 0,1 molar y vuelva a incubar las células. Ahora peletice las células una vez más y esta vez incubelas en 0,5 mililitros de solución de anticuerpos que contiene anticuerpos anti BRDU de ratón diluidos de uno a 50 después de peletizar las células nuevamente reus. Suspenda este pellet en 50 microlitros de solución de anticuerpos que contenga anticuerpos secundarios conjugados anti-US ZI de conejo, diluidos de uno a 25.

A continuación, incube las células en la oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de centrifugar las células de tiempo final, incubarlas en 0,5 mililitros de yoduro de propidio y solución de ARN en la oscuridad a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Finalmente, pase la solución celular digerida a través de un colador celular para eliminar los agregados.

A continuación, transfiera las células individuales a un tubo adecuado para la toma de muestras en el citómetro de flujo para poblaciones celulares que proliferan de forma asíncrona, como la que se muestra. En este ejemplo, coloque una puerta alrededor de los dos picos más abundantes en la gráfica discriminante de doblete para seleccionar eventos de una sola celda para todos los análisis posteriores. A continuación, analice una muestra de cultivo que prolifera de forma asincrónica para que sirva como control positivo para la tinción y la configuración de los parámetros del citómetro de flujo.

Ajuste la sensibilidad del tubo fotomultiplicador para la tinción de yoduro de propidio de modo que los dos picos N y cuatro N de las celdas individuales estén centrados en las unidades arbitrarias de 200 y 400 en el eje x. A continuación, ajuste la sensibilidad del tubo multiplicador de fotos de detección FXI de modo que las celdas negativas FXI estén por encima de los niveles de fondo. Las celdas positivas BRDU deben ser aproximadamente 10 veces más brillantes y el eje x debe mostrarse como una escala logarítmica.

Los eventos individuales que son capturados por el citómetro de flujo forman un arco en forma de herradura desde la fase G uno en la parte inferior izquierda hasta la fase S y luego hacia abajo hasta la fase inferior derecha para la fase G dos M. Como se ve en esta figura representativa, recoja de 5.000 a 10.000 eventos de una sola célula para lograr el rango deseado de contenido de ADN. Después de medir el yoduro de propidio y el contenido de BRDU, asigne las celdas a la fase G uno s o G dos MPH con puertas alrededor de las dos poblaciones negativas de BRDU centradas en 200 para G uno y 400 para G dos M. Incluya todos los eventos por encima de estas dos cajas en una sola puerta para medir la fase S, el porcentaje de celdas en cada puerta representará el número relativo de celdas en las fases G uno s y G dos M, como se muestra aquí en este gráfico de barras para la figura del diagrama de dispersión anterior.

Después de teñir un marcador celular de interés en este ejemplo, CD 20 centrifugue las células a 500 veces la gravedad durante 10 minutos a 22 grados Celsius y luego vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de PBS suplementado con 1% de BSA. Después de peletizar las células nuevamente a 500 veces la gravedad durante cinco minutos a temperatura ambiente, use 0,5 mililitros de la solución de yoduro de propidio y ARN para rehidratar las células. A continuación, tiña y digiere las células como se acaba de mostrar ahora en la puerta de los dos picos de células individuales de n y cuatro extremos, y luego ajusta la sensibilidad del tubo fotomultiplicador para la detección de FXI de modo que las células no teñidas estén por encima de los niveles de fondo.

Idealmente, las células CD 20 FXI positivas estarán de 10 a 100 veces más intensamente teñidas que el fondo. De nuevo, el eje x debe mostrarse como una escala logarítmica. Por último, seleccione las células CD 20 positivas que son 10 veces más brillantes que los niveles de fondo y con tinción de yoduro de propidio entre 200 y 400 para su visualización en un histograma de yoduro de propidio frente a recuentos de células como se muestra aquí en esta figura de muestra, recopile al menos 1000 eventos CD 20 positivos para cada muestra para limitar la variabilidad en esta figura.

Se muestra el análisis tridimensional de citometría de flujo de yoduro de propidio y células de tinción BRDU. Tenga en cuenta que las celdas con dos n y cuatro NDNA están centradas sobre las marcas 200 y 400 en la escala del eje X. Para la intensidad de la tinción con yoduro de propidio, la intensidad de la tinción BRDU se mide en una escala logarítmica.

En el eje Y, observe las posiciones de las puertas utilizadas para cuantificar las celdas en las fases G uno s y G dos M del ciclo celular. Aquí se muestra la proporción relativa de celdas en cada una de las puertas G uno s y G dos M de la figura anterior. Aquí, propidio, yoduro y CD 20.

Se muestra la tinción a partir de una mezcla de células, algunas de las cuales expresan ectópicamente CD 20 y PRB. Tenga en cuenta que las celdas con dos n y cuatro NDNA, las poblaciones más abundantes, están centradas en las marcas 200 y 400 en el eje x. La posición de la marcha positiva CD 20 selecciona las células que están teñidas al menos 10 veces más brillantes que el fondo.

Este histograma representa los recuentos de células frente a la tinción con yoduro de propidio para las células CD 20 negativas del diagrama de dispersión anterior que están proliferando de forma asincrónica en este histograma: se muestran las células CD 20 positivas del diagrama de dispersión CD 20 anterior que han sido inducidas a detenerse con la expresión de p rrb y contienen células con principalmente dos contenidos de NDNA. Estos datos demuestran que una subpoblación detenida puede distinguirse de otras células en el cultivo utilizando esta técnica de tinción. En las siguientes tres figuras, se muestran los datos del análisis citométrico de flujo de la expresión retroviral del inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina P 27 KIP one en fibroblastos embrionarios de ratón.

El análisis de yoduro de propidio, BRDU se utilizó para medir las fases del ciclo celular en una población de células que proliferaban de forma asincrónica y que se transducían con un vector retroviral P babe vacío, como se muestra aquí. Pocos eventos positivos de BRDU fueron evidentes en la puerta de la fase S en respuesta a P 27. Obsérvese también la mayor intensidad de los eventos en las puertas G uno y G dos M.

Del mismo modo, el porcentaje de células en fase S para las células que expresan P 27 es bastante bajo, como se muestra en el diagrama de esta figura. Este tipo de análisis ha sido muy eficaz para caracterizar los déficits de control del ciclo celular en células derivadas de varias cepas de ratones con genes específicos. En las dos figuras siguientes, las células epiteliales de memoria no formadas se trataron con la citocina inhibidora del crecimiento TGF beta one durante 24 horas.

Como se muestra en esta primera figura, el marcaje de BRDU en las células de fase S se ve disminuido en gran medida por la señalización de TGF beta uno. Obsérvese la acumulación de células principalmente en la fase G uno del ciclo celular, como se puede ver en el panel central. La cuantificación de las diferentes fases del ciclo celular confirma que el TGF beta uno inhibe principalmente la proliferación en la fase G uno del ciclo celular, lo que conduce a una acumulación en esta fase.

En esta última serie de análisis experimentales, se transfectaron dos células con deficiencia de PRB, SAS con vector de expresión CMV CD 20 y CMV RB o CMV beta GAL como control. Esta primera figura muestra la distribución del ciclo celular de las células transfectadas con control negativo en comparación con su distribución después de 72 horas de expresión de PRB. Obsérvese que la presencia casi exclusiva de un pico de dos N en el panel de la derecha en el ajuste de la curva de la figura final mediante software multiciclo reveló que las células se acumularon principalmente en la fase G uno después de la expresión de PRB.

Mientras que las poblaciones en las fases S y G dos M estaban relativamente diezmadas. Una vez dominada, esta técnica se puede adaptar para estudiar otros marcadores del ciclo celular, como las histonas de fosforilato en mph. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo determinar la distribución del ciclo celular de una población de células.

No olvide que los dos normales ácido clorhídrico son cáustico y propidio. El yoduro es un carcinógeno potencial. Pueden ser peligrosos en.

Siempre se deben tomar precauciones al usar estos productos químicos.