Name: Imagen intravital del timo de ratón utilizando 2-Photon Microscopy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Aprende a realizar imagen intravital del timo en ratones utilizando microscopía de dos fotones. Este protocolo permite observar la dinámica de timocitos durante el desarrollo de células T in vivo.

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Nos gustaría agradecer al Dr. David Olivieri para la revisión crítica de este manuscrito, el Dr. Nuno Moreno por la ayuda logística para construir nuestro titular de los animales y las almohadillas térmicas y el Dr. Vijay K. Kuchroo para la donación tipo de Foxp3-KI GFP / GFP ratones. Este trabajo es apoyado por la &quot;Fundação párrafo Ciência e Tecnologia&quot; (FCT, Portugal), subvención # PTDC/EBB-BIO/115514/2009.

1. Animal preparación Notas importantes: BM suspensiones celulares y trasplantes de timo se han realizado en condiciones asépticas. Las suspensiones se prepararon BM dentro de las campanas de la sala de cultivo celular, mientras que el trasplante de timo se llevó a cabo en la sala de operaciones ubicado dentro de nuestras instalaciones para animales. A fin de mantener y garantizar estas condiciones asépticas, no se nos permitió grabar nuestro video en esos lugares. Sin embargo, todo el material quirúrgico se autoclave y el banco quirúrgica fue limpiada previamente con Virkon (Pharmacal Research Laboratories, Inc.) y el 70% de etanol. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional y el empleo Comisión (IACUC) y que estaban de acuerdo con la Federación Europea de Asociaciones de Ciencia Animal de Laboratorio (FELASA) directivas. El número de identificación de aprobación es AO10/2010. Todos los experimentos de imagen fueron los procedimientos terminales y los animales fueron sacrificados inmediatamente después del final de la imagenadquisición. El procedimiento detallado es el siguiente: <ol><li> Irradiar (con γ-irradiador) 8 semanas de edad ratones atímicos con 900 rads para destruir los precursores hematopoyéticos endógena dentro del hueso calabacines (BM). Después de la irradiación, el retorno de los animales a sus jaulas hasta que preparar las células del donante BM para inyección intravenosa y la reconstitución BM más. Esta transferencia se realizó BM 1 h después de la irradiación. </li><li> Separar los animales donantes BM. Tibias y fémures de las patas traseras de un animal son generalmente suficientes para reconstituir hasta 3 animales receptores. Después de la eutanasia con CO 2, quite las patas traseras y luego retire la piel y los músculos de los huesos. </li><li> Corte el extremo cerrado de cada hueso y enjuague con PBS (o RPMI) o aplastar a todos en un mortero, usando una mano de mortero, con 2 ml de PBS (o RPMI) para eliminar el BM. </li><li> Alterar la estructura BM en una suspensión de una sola célula por la repetición de la aspiración vigorosa using una pipeta P1000. Si lo prefiere, también puede pasar el BM a través de una aguja de la jeringa 21G en varias ocasiones. Se centrifuga (400 g, 5 min, RT), volver a suspender las células en PBS, y se inyecta por vía intravenosa en el nude-irradiados destinatarios. En nuestros experimentos hemos utilizado BM de Foxp3-KI GFP / GFP ratones en todas las células T reguladoras (Tregs) se expresan GFP 1. </li><li> La aceptación de la BM de los donantes se produce en los primeros días después de la transferencia, ya que no-BM-reconstituido animales no pueden sobrevivir más de 14 días. Sin embargo, se debe esperar de 4 a 6 semanas para permitir la recuperación plena de todos los compartimentos BM. Bactrim (Roche) fue introducido en el agua (2 mg / ml) durante la primera semana después de la irradiación para disminuir el riesgo de infecciones bacterianas. </li><li> Timo embrionario trasplante ya ha sido descrito 2. En pocas palabras, empezar a criar pares de ratones isogénicas y comprobar para conectar (pruebas del coito) todos los días. Mujeres por separado y conectado a CO 2-eutanasia en el día 15 de pregnAncy (observación de enchufe es el día 1 de embarazo). La toma de embriones y timos de la. Coloque los timos de embriones en PBS frío hasta que la transferencia. </li><li> Para llevar a cabo el trasplante de timo, anestesiar BM-receptor ratones desnudos con ketamina (120 mg / g de peso del ratón) / xilazina (16 mg / g de peso del ratón) y mantenerlos en la cima de una almohadilla térmica a 37 ° C hasta que se inconsciente. </li><li> Exponer quirúrgicamente el riñón para realizar el trasplante de los timos. Primero frote la piel con ChloraPrep (CareFusion Inc.) y el 70% de etanol. Entonces, hacer un corte de 1 cm en la piel de la parte del cuerpo posterior-lateral del animal, de 2 mm por debajo de la costilla torácica anterior. </li><li> Cortar la cavidad peritoneal y sacar el riñón de esta cavidad. Hacer un pequeño corte superficial en la cápsula renal con una hoja de bisturí. El uso de pinzas con una punta muy fina que una bolsa debajo de la cápsula del riñón del ratón receptor y añadir hasta 4 lóbulos del timo en esta bolsa. </li><li> Coloque la b riñón acuse de recibo a su lugar, la sutura de la cavidad peritoneal con uno o dos puntos de sutura y cierre de la piel del ratón usando el método de sutura mismo. Por otra parte, las suturas se puede hacer usando pegamento quirúrgico. </li><li> Inyectar analgésico (butorfanol a 5 mg / kg) por vía subcutánea justo después de terminar la cirugía para evitar el dolor de los animales y mantener a los animales en un cojín de la calefacción hasta que empiezan a recuperarse de la anestesia. Los ratones son alojados en jaulas individuales para los 3 primeros días después del trasplante para evitar que sus compañeros de jaula de la eliminación de los puntos de sutura. Quitar puntos de sutura después de 1 semana. </li><li> Ratones desnudos no tienen células T. Por lo tanto, se puede evaluar la aceptación del trasplante de timo mediante el control del porcentaje de células CD4 + o linfocitos T CD8 + en la sangre. Una vez por semana, 2 semanas después de trasplante de timo, sangrar a los animales y la mancha de sangre con anticuerpos anti-CD4 y CD8 anti-anticuerpos monoclonales (MAb). Cuando los CD4: CD8 es de aproximadamente 2:1, el timo trasplantado es totalmente funcional (Figura 1). </li></ol>"&gt; 2. Adquisición de la imagen intravital Prepare todos los materiales que se necesitan por adelantado y puso a un lado. <ol><li> Anestesiar a los animales con ketamina / xilazina (mismas dosis descritos en el punto 1.5) y colocarlos en la parte superior de un cojín de la calefacción a 37 º C. Inyectar 100 l de rodamina B isotiocianato de dextrano (20 mg / ml en PBS) por vía intravenosa para permitir la visualización de futuro, el flujo de sangre. </li><li> Exponer el riñón que contiene el timo trasplantados de acuerdo con el protocolo previamente descrito en el punto 1.6. </li><li> Para evitar que los riñones vuelvan a su posición original, cerca de las caras laterales de la incisión de la piel con puntos de sutura. </li><li> Coloque un trozo de algodón empapado de PBS en la parte superior del órgano para mantenerlo húmedo. </li><li> Ponga la almohadilla en la parte superior de la etapa de titular de animales (Figura 2). </li><li> El sacrificio del animal en la parte superior de la almohadilla en el soporte de los animales, por órgano (Figura 2B). </li><li> Pellizcar el órgano en ambos lados con una abrazadera de mADE de papel de aluminio delgado (Fig. 2C). </li><li> Cierre el soporte de los animales y el lugar de la sonda de calor superior lo más cerca posible a los tejidos (Figura 2). Esta sonda de calor mide constantemente la temperatura de órganos y envía esta información al calentador para ajustar la corriente eléctrica, manteniéndolo a 37 ° C. </li><li> Retire el algodón empapado en PBS y añadir bajo punto de fusión de agarosa (2% en PBS) a 30 ° C en la parte superior de su preparación. </li><li> Cubrir toda la preparación con el calentador superior (Figura 2E). En la apertura de este calentador hay un cubreobjetos aislar la agarosa del objetivo (Figura 2F). Monitor de la anestesia del ratón e inyectar un impulso a mitad de dosis cada 40 minutos. Después de la adquisición de la imagen, la eutanasia de los animales con CO 2. </li></ol> Nota: las imágenes del clip de papel de aluminio y el calentador superior se presentan en la Figura 3. 3. De dos fotones de imagen de adquisición Se utilizó un pie "Prairie Ultima XY" microscopio de dos fotones. Nuestro sistema está equipado con un Ti: Sapphire láser, cuatro PMT parte superior de traducción simultánea de hasta 4 canales de adquisiciones y un objetivo de inmersión en agua 20x. <ol><li> Encienda el Ti: Zafiro con láser y el sistema de microscopio conjunto. </li><li> Añadir espejos dicroicos y juegos de filtros de acuerdo a las longitudes de onda deseada. En nuestro caso hemos utilizado un titular de Chroma-Olympus BX2 que contiene un espejo de 565 nm dicroicos, un 525/50 nm filtro (para la señal de Foxp3-GFP), y un 595/50 nm filtro (por Dextran-Rodamina-B de la señal dentro de los vasos sanguíneos ). El rango de longitud de onda de láser utilizado fue entre 880 a 900 nm. </li><li> Añadir el titular de los animales al microscopio, conectar y encender todas las estufas, se añade agua en el calentador de la apertura superior, baje cuidadosamente el objetivo en el agua, y se centran en un buque o algún Tregs GFP. </li><li> Con el microscopio de x, y, z de control externo, de forma rápida encuesta el tejido para localizar una región de interés. </li><li> Ajustar la ganancia de la PMT para optimizar la separación de colores y minimizar la cantidad de láser necesarios para lograr suficiente señal más de fondo. Trate de usar la mínima cantidad de láser para evitar la foto-daño de los tejidos. </li><li> Una vez que la región de interés se encuentra, hora de inicio de imágenes a intervalos. En nuestro caso, un típico 5D (x, y, z, t, y el color) protocolo de adquisición consiste en la adquisición de imágenes secuenciales de un volumen de 50 micras de tejido profundo, divididos en 4,0 m z-pasos, x y la longitud y de 140 micras cada uno. Cada volumen es de unos 30 segundos para ser adquiridos. Por lo tanto, 60 adquisiciones se realizan alrededor de 30 minutos de la adquisición de imágenes. </li><li> Transferir los datos al servidor institucional y el uso de ImageJ, Imaris o software Volocity para llevar a cabo la representación multi-dimensional y el seguimiento de la célula. </li></ol> 4. Resultados representante g1.jpg "/&gt; Figura 1. . Embrionarias aceptación del timo y la función BM Después de recuperarse, timos embrionarias fueron trasplantadas a animales BM reconstituido, dos semanas después del trasplante de timo, estos ratones fueron sangrados una vez por semana para supervisar los porcentajes de los subtipos de células T mediante la tinción con anti-CD4 o anti-CD8 los anticuerpos monoclonales. Se consideró que el timo fue aceptado con éxito en animales con CD4: CD8 alrededor 1.5-2.0:1 (A). Para confirmar su funcionalidad, que sacrificó algunos animales timo-trasplante y en comparación el porcentaje de las diferentes subpoblaciones de timocitos de ratones WT (B). Los porcentajes de doble negación (DN; CD4 - CD8 - timocitos) subpoblaciones (por tinción con anti-CD25 y anticuerpos monoclonales anti-CD44), haga doble positivo (DP; CD4 + CD8 + timocitos) y de un solo positivo (SP) CD4 + o CD8 + timocitos fueron similares entre estos animales. ig2.jpg "/&gt; Figura 2. Conjunto de animales titular. Después profundamente anestesiados, el animal se pone encima de una almohadilla eléctrica, previamente montada en la parte superior de la etapa de titular de animales (A). El riñón trasplantado que contiene el timo es hacia arriba (B). Una pinza de papel de aluminio con delicadeza aprieta todo el riñón (C) para mantener en su lugar. Fig. 1C insertar muestra en detalle la abrazadera. La parte superior del soporte de los animales se pone en el lugar (D). El algodón empapado en PBS se retira de la parte superior del órgano, sustituido por el cálido bajo punto de fusión de agarosa, y el calentador superior se añade (E). Finalmente, toda la asamblea se transfiere al microscopio, en este caso representado por el objetivo (F). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3504/3504fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Detalles de las piezas soporte. Estas imágenes muestran la abrazadera de papel de aluminio (A) la celebración de los riñones (B). Tenga en cuenta también la región donde se encuentra el timo trasplantado. Esto indica aproximadamente la regiónpara cortar la cápsula del timo y hacer que el bolsillo para poner el timo embrionario. El cubre calentador superior (C) se fija con pegamento de silicona en su parte inferior (D). Movie 1. Intravital imagen de GFP-Foxp3 + timocitos en el interior del timo, donde los niveles fisiológicos de la oxigenación y la temperatura (37 ° C) se mantuvieron durante todo el proceso. Tenga en cuenta el flujo de sangre y el movimiento de células T reguladoras. Estas velocidades pueden ser medidos y comparados con los datos publicados. <a href="/files/ftp_upload/3504/3504movie1.avi">Haga clic aquí para ver la película.</a> Movie 2. Intravital de imágenes de células T reguladoras dentro de un timo, donde las imágenes fueron adquiridas a 30 ° C. Nótese la ausencia de movimiento y de la forma redonda de las células a pesar del mantenimiento del flujo sanguíneo. <a href="/files/ftp_upload/3504/3504movie2.avi">Haga clic aquí para ver la película.</a>

<ol><li>Bettelli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+developmental+pathways+for+the+generation+of+pathogenic+effector+TH17+and+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells.</a> Nature. 441, 235-238 (2006).</li>
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<li>Tang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+regulatory+T+cell+control+of+autoimmune+responses+in+nonobese+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Visualizing regulatory T cell control of autoimmune responses in nonobese diabetic mice.</a> Nat. Immunol. 7, 83-92 (2006).</li>
<li>Le Borgne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+negative+selection+on+thymocyte+migration+in+the+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla.</a> Nature immunology. 10, 823-830 (2009).</li>
<li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+research%22%5BJournal%5D)">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvascular research. 5, 384-394 (1973).</li>
<li>Wang, B., Zinselmeyer, B. H., McDole, J. R., Gieselman, P. A., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+Imaging+of+Leukocyte+Homing+and+Migration+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo.</a> J. Vis. Exp. (46), e2062-e2062 (2010).</li>
<li>Barretto, R. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+imaging+of+disease+progression+in+deep+brain+areas+using+fluorescence+microendoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy.</a> Nature medicine. 17, 223-228 (2011).</li>
</ol>

No tenemos nada que revelar.

En este trabajo hemos demostrado los procedimientos de dos fotones de imágenes de los timocitos en el interior de un animal vivo. También se describen algunos de los parámetros que uno debe cuidadosamente controlar, como la continuación del flujo sanguíneo y el mantenimiento de la temperatura de órganos durante los procedimientos de imagen. Sin embargo, a pesar de los esfuerzos de cuidado de mantener el órgano estable, los artefactos de movimiento, como &quot;órgano a la deriva&quot; pueden ocurrir. Corrección de la imagen posterior se puede realizar por el desarrollo de algoritmos especialmente diseñados para este propósito. Análisis de las imágenes más también podrían ser el origen del desarrollo de nuevos protocolos que trata de minimizar los errores. El timo es el órgano donde todas las células T son producidas y, por tanto, es el órgano donde inmunólogos interesados ​​en comprender la generación de γδ, CD4, CD8 o células T se centrará su atención. La mayoría de los estudios sobre las células T se basan en las diferencias en los números y / o la estabilidad de los canas después de diferentes in vitro / in vivo manipulaciones. Sin embargo, sólo después de la visualización en vivo se pudo observar la interacción entre las células del sistema inmune involucradas en el mantenimiento de la homeostasis de 3-7. Por lo tanto, la observación en vivo de los timocitos es probablemente uno de la información más importante que falta para entender mejor la biología de las células T. Intravital TPM proporciona una imagen detallada de los movimientos de las células T y las interacciones y demostramos aquí cómo puede ser utilizado para estudios detallados de los timocitos. Sin embargo, cada técnica tiene sus limitaciones. Mientras intravital adquisición de imágenes es el sistema más preciso para reflejar el comportamiento de las células dentro del cuerpo, también es cierto que la adquisición explantados imagen de los órganos es menos laborioso y ha sido utilizado para recopilar información importante sobre el sistema inmunológico 8,9. Por otra parte, no se puede negar métodos intravital de imágenes requieren cirugía para exponer los tejidos y los vasos sanguíneos en los animales anestesiados,que de por sí puede causar una alteración en la totalidad del órgano fisiología 10. Sin embargo, existen métodos no invasiva que la abolición de los artefactos causados ​​por la intervención quirúrgica 11 y los nuevos métodos están siendo desarrollados para mejor prepararse con anticipación a los animales que se utilizarán 12. Por lo tanto, los nuevos procedimientos quirúrgicos y los peajes reducirá al mínimo o evitar las limitaciones reales de adquisición de imágenes intravital y cada vez más accesibles a la comunidad científica. Hemos demostrado que el método que hemos descrito es factible y que los informes de todas las manipulaciones in vivo sistémico, la administración de estos fármacos, que hemos utilizado. Por lo tanto, se sugiere el uso de este método, junto con técnicas ex vivo ya están disponibles con el fin de complementar y fortalecer aún más los estudios sobre el desarrollo de los timocitos.

<table border="1"><thead><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr></thead><tbody><tr><td> Rodamina B ishothiocyanate-dextrano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R9379 </td><td> preparar acciones a 20 mg / ml </td></tr><tr><td> Microscopio de dos fotones </td><td> Pradera Technologies Inc. </td><td> Pradera Ultima XY </td><td></td></tr><tr><td> Ti: Sapphire láser </td><td> Coherente, Inc. </td><td> Camaleón de la familia Ultra </td><td></td></tr><tr><td> 20x/1.00 NA objetivo de inmersión </td><td> Olympus Inc. </td><td> XLUMPLFLN 20XW </td><td></td></tr><tr><td> Titular (Filtros / dicroico) </td><td> Chroma Technology Corp. </td><td> 91018 BX2 (U-MF2) </td><td></td></tr><tr><td> 525 nm/50 filtro </td><td> Chroma Technology Corp. </td><td> ET525/50m </td><td></td></tr><tr><td> 595 nm/50 filtro </td><td> Chroma Technology Corp. </td><td> ET595/50m </td><td&gt; </td></tr><tr><td> 565 nm dicroico </td><td> Chroma Technology Corp. </td><td> 565dcxr </td><td></td></tr><tr><td> Imaris software </td><td> Bitplane AG Inc. </td><td> Imaris </td><td></td></tr><tr><td> Volocity </td><td> PerkinElmer Inc. </td><td> Volocity </td><td></td></tr><tr><td> ImageJ </td><td> NIH, EE.UU. </td><td> ImageJ </td><td></td></tr></tbody></table>

imagen intravital del timo de ratón utilizando 2-photon microscopy

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

De dos fotones de Microscopía (TPM) proporciona la adquisición de imágenes en las zonas más profundo de los tejidos y órganos. En combinación con el desarrollo de herramientas nuevas estereotáctica y procedimientos quirúrgicos, el TPM se convierte en una poderosa técnica para identificar &quot;nichos&quot; dentro de los órganos y documentar celular &quot;comportamientos&quot; de animales vivos. Mientras imagen intravital proporciona información que mejor describa el comportamiento real de celulares dentro del órgano, que es tanto más laborioso y técnicamente exigente en términos de equipo necesario / procedimientos alternativos de adquisición ex vivo de imágenes. Por lo tanto, se describe un procedimiento quirúrgico y la novela &quot;estereotácticos&quot; titular del órgano que nos permite seguir los movimientos de Foxp3 + células en el timo. Foxp3 es el regulador maestro para la generación de células T reguladoras (Tregs). Además, estas células se pueden clasificar según su origen: es decir. timo diferenciados Tregs se les llama &quot;de origen natural Tregs&quot; (nTregs), o comopposed a la periferia convertida Tregs (pTregs). A pesar de gran cantidad de investigación ha sido reportado en la literatura sobre el fenotipo y la fisiología de las células T, se conoce muy poco acerca de sus interacciones in vivo con otras células. Esta deficiencia puede ser debido a la ausencia de técnicas que permitan tales observaciones. El protocolo se describe en este documento se ofrece un remedio para esta situación. Nuestro protocolo consiste en el uso de ratones nude que carecen de un timo endógeno, ya que tienen una mutación puntual en la secuencia de ADN que compromete la diferenciación de algunas células epiteliales, como células epiteliales del timo. Ratones desnudos fueron irradiados con rayos gamma y se reconstituyó con médulas ósea (MO) de KI Foxp3-GFP / GFP ratones. Después de la recuperación BM (6 semanas), cada animal recibió el trasplante de timo embrionario dentro de la cápsula renal. Después de la aceptación del timo (6 semanas), los animales fueron anestesiados, el riñón que contiene eltimo trasplantado fue expuesto, fijo en nuestro titular del órgano, y se mantiene bajo condiciones fisiológicas de imágenes in vivo de TPM. Hemos estado utilizando este método para estudiar la influencia de drogas en la generación de células T reguladoras.

Hemos desarrollado nuevas herramientas de laboratorio y protocolos para la adquisición de imágenes intravital del timo. Nuestra técnica debería ayudar en la identificación de &quot;nichos&quot; en el timo en el desarrollo de células T se produce.

Imagen intravital del timo de ratón utilizando 2-Photon Microscopy

La microscopía de dos fotones (TPM) permite la adquisición de imágenes en áreas profundas del interior de tejidos y órganos. En combinación con el desarrollo de nuevos sistemas estereotáxicos...

La microscopía de dos fotones permite la adquisición de imágenes en zonas profundas dentro de los órganos. La excitación de proteínas fluorescentes en la microscopía de dos fotones se logra cuando dos fotones de energía aproximadamente igual interactúan con la molécula, produciendo una excitación equivalente a la absorción de un solo fotón con el doble de energía. Por lo tanto, en un microscopio de dos fotones se utilizan láseres infrarrojos, lo que permite la adquisición de imágenes en tejidos gruesos, minimizando el fotoblanqueo y el daño fotónico.Además, dado que la excitación se restringe al plano focal, no hay fluorescencia fuera de foco. Junto con nuevas herramientas estereotácticas y procedimientos quirúrgicos, se convierte en una técnica potente para documentar los comportamientos celulares en animales vivos. En este artículo, se utilizó microscopía de dos fotones para obtener imágenes intravital del timo.En este órgano ocurre la maduración de los linfocitos T y, por lo tanto, esta técnica puede ser útil en estudios que involucran el desarrollo de timocitos. Ahora comencemos con los protocolos. Primero, para preparar los animales, irradie animales desnudos de ocho semanas de edad con 900 rads. Después de la irradiación, devuelva los animales a la jaula hasta el trasplante de médula ósea.Para preparar la suspensión de médula ósea, tras la eutanasia con dióxido de carbono de los ratones donantes y la eliminación de las extremidades traseras, se retiran la piel y el músculo de los huesos y se reservan en PBS. Transfiera los huesos a una nueva placa de Petri que contenga PBS. Corte los extremos de los huesos.Llene una jeringa con PBS y lave los huesos utilizando una aguja de 25 gauge. Alternativamente, transfiera los huesos a un mortero y tritúrelos con un pistilo, homogenizando la médula ósea con pipeteo vigoroso. Centrifugue la suspensión durante cinco minutos a 400 G. Resuspenda.Suspenda las células en PBS e inyéctelas por vía intravenosa en su ratón irradiado. Aparece una cierta fragilidad de la médula ósea durante los primeros días tras la transferencia. Dado que no se reconstituye con 10 pl, los ratones comienzan a morir a los 10 días de la radiación.Sin embargo, esperamos de seis a ocho semanas para considerar que nuestros animales están completamente reconstituidos. Para continuar con la preparación de los animales, cuatro a seis semanas después de la transferencia de médula ósea, se realizará un trasplante de timo embrionario para permitir la observación de timocitos in vivo.Primero, tras sacrificar hembras preñadas del día 15 con dióxido de carbono y recolectar los embriones, retire el timo de cada embrión y colóquelos en una placa con PBS frío hasta su uso. Anestesie los animales receptores con ketamina y xilacina, y manténgalos sobre una almohadilla calefactora. Cuando el animal esté profundamente anestesiado, lave la zona con etanol. Corte la piel, corte la membrana peritoneal, localice y exponga el riñón.Una vez expuesto el riñón, realice un pequeño corte en la cápsula renal y cree un bolsillo debajo de ella. Introduzca los timos embrionarios dentro de este bolsillo. Finalmente, coloque el riñón de nuevo en su posición original y cierre la cavidad peritoneal y la piel.Con puntos, el animal debe recibir analgésicos y colocarse sobre una almohadilla calefactora hasta que comience a recuperarse de los anestésicos. La proporción entre células CD cuatro positivas y células CD ocho positivas puede seguirse semanalmente mediante análisis de muestras sanguíneas. Los animales con una proporción alrededor de 1.521 aceptaron el timo.Los porcentajes de poblaciones de linfocitos T en el timo trasplantado son similares a los porcentajes encontrados en el timo endógeno de los animales control. La imagenología intravital del timo trasplantado requerirá una nueva cirugía en el animal y el uso de nuestro dispositivo de sujeción para animales. Primero, inyecte ketamina, xilacina y anestésicos.Una vez que el animal esté inconsciente, colóquelo encima de una almohadilla calefactora por vía intravenosa. Inyecte dextrano de isotiocianato de Rodina para permitir la observación futura del flujo sanguíneo en su tejido. Abra la piel y la cavidad peritoneal para exponer el riñón que contiene el timo trasplantado y evitar que el riñón regrese a su posición original.Cierre el lado lateral de la incisión cutánea con puntos de sutura. Transfiera el animal a la almohadilla calefactora colocada encima de la plataforma del soporte para animales. Pince ambas partes del riñón.Utilizando una pinza hecha de papel de aluminio. Cierre el soporte del animal y coloque el calentador superior. Coloque la sonda lo más cerca posible del tejido.Agregue agarosa de punto de fusión baja encima de su preparación. Cubra toda la preparación con el calentador superior. Monitoree la anestesia y administre refuerzos anestésicos cada 40 minutos.Después de finalizar la cirugía, todo el montaje se transfiere ahora al microscopio de dos fotones para la adquisición de imágenes adicionales. En nuestro caso, utilizamos un microscopio de dos fotones Prairie Ultima equipado con un láser de zafiro sintonizable, cuatro PMT superiores y un objetivo de inmersión en agua de 20x. Primero encienda el láser y el microscopio.Luego agregue espejos RIC y juegos de filtros según las longitudes de onda deseadas. Coloque el animal en el microscopio. Conecte todas las almohadillas calefactoras a sus controladores.Agregue agua sobre la abertura del calentador superior y baje cuidadosamente el objetivo hasta introducirlo en el agua. Enfóquese en los vasos sanguíneos o en las regiones GFPT utilizando el controlador externo XY, Z. Localice rápidamente la región de interés.Ajuste la ganancia en los PMT para optimizar la separación de colores y minimizar el láser necesario para obtener una señal suficiente sobre el fondo. Una vez localizada la región de interés, inicie la adquisición de imágenes de lapso de tiempo adquiriendo imágenes secuenciales de un volumen de tejido de 50 micrómetros de profundidad en nuestra configuración básica. Cada volumen tarda 30 segundos en adquirirse.Por lo tanto, se alcanza una adquisición de imágenes de 30 minutos tras 60 repeticiones secuenciales de este volumen. Este video muestra células positivas para GFP dentro del timo. Observe el movimiento celular y el flujo sanguíneo dentro de los vasos.Sin embargo, si la preparación no es adecuada, en este caso la temperatura del órgano es baja. Las células dejan de moverse incluso cuando el flujo sanguíneo continúa. El método aquí descrito permite la observación en vivo de timocitos.Estos métodos deberían ser muy útiles para cualquier inmunólogo interesado en observar la distribución y las interacciones de los timocitos durante el desarrollo de linfocitos T, aunque sean bastante simples; se deben tener en cuenta algunos pasos para evitar artefactos experimentales. Por ejemplo, debe tenerse cuidado de no dañar ningún vaso sanguíneo porque esto disminuirá la oxigenación dentro del tejido. Asimismo, la temperatura debe mantenerse constantemente a 37 grados Celsius.Finalmente, los resultados aquí obtenidos deberían ser muy útiles para validar cualquier otro resultado obtenido mediante técnicas x vivo.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

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Este video muestra el procedimiento de craneotomía que permite obtener imágenes crónicas de neuronas en la corteza retroesplenial de ratón utilizando microscopía in vivo de dos fotones en la línea transgénica Thy1-GFP. Este enfoque se combina con la inyección de virus adenoasociados que expresan mCherry en el hipocampo dorsal. Estas técnicas permiten el seguimiento a largo plazo de la plasticidad estructural dependiente de la experiencia en RSC.

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