Name: Inmunotinción de Disección del corazón embrionario de pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: Aprende inmunotinción de corazones embrionarios de Danio rerio para biología del desarrollo. Este método mejora la penetración de anticuerpos y reduce el tiempo de procesamiento respecto a técnicas tradicionales de montaje completo.

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Damos las gracias a Beninio Jomok por su ayuda en la cría de pez cebra. Este trabajo está financiado por el NIH HL81753.

1. Preparación de las placas y cámara húmeda <ol><li> La cámara húmeda se puede hacer de una caja como una caja vacía punta. Envuelva tanto la cámara y la tapa con papel de aluminio para proteger las muestras de la luz. </li><li> Dentro de la cámara, poner un montón de toallas de papel húmedo para mantener la humedad dentro de la cámara, lo que evitará que las muestras de corazón de secado. Establecer una microplaca pequeña en la parte superior de la toalla de papel en un estante para las diapositivas. </li><li> Dibujar líneas o círculos en la superficie de un portaobjetos de microscopio utilizando el lápiz immEdge hacer pozos para las muestras de corazón con una dimensión de 5x5 mm. Deje que los portaobjetos secos. </li><li> Poner los portaobjetos en la cámara húmeda y añadir 50 ul formaldehído fresco 4% en cada pocillo. </li></ol> 2. La disección del corazón embrionario <ol><li> Anestesiar a los embriones de pez en el agua de huevo E3 7, que contiene 0,4% tricaína de 1 minuto hasta que el movimiento del cuerpo de peces, pero todavía tienen parada normal del corazónpaliza. </li><li> Ponga un portaobjetos cóncavo en el escenario de un microscopio de disección. Transferir los embriones al pozo cóncavo. </li><li> Ajustar la combinación de la luz del microscopio de disección para revelar claramente el corazón. Dependiendo de la preferencia personal, podría ser cualquiera de campo oscuro o CID-como condición de la luz polarizada. </li><li> Limpiar dos jeringas de insulina con un 75% de etanol, luego se seca. </li><li> Ajustar el microscopio de disección a un aumento mayor y se centran en el corazón. Para fijar físicamente un embrión mediante la inserción de una aguja en el límite con la yema somite cerca de la cabeza. Insertar otra aguja cerca de la región del corazón y tirar el centro hacia fuera rápidamente. Si el corazón no está totalmente separada del embrión, cortar el tejido que ha quedado conectado entre el corazón y la yema. </li><li> Ajustar el microscopio para reducir la ampliación y se centran en el corazón separado. Use un pipetteman 10μl y configurarlo para que el volumen 1μl. Aplicar la punta de la pipetteman Para dibujar o tocar elcorazón de la muestra, de manera que el corazón aislado será dentro o adjunto a la superficie de la punta. </li><li> Sumerja la punta de la pipeta en la solución de formaldehído al 4% en portaobjetos preparados y bajar el pistón de la pipeta para liberar el corazón en la solución. La tensión de la superficie del agua también ayuda a liberar el corazón de la punta de la pipeta a la solución. Con menos del 3 corazones en cada pocillo. </li></ol> 3. Inmunotinción <ol><li> Cerrar la cubeta y lo puso en la coctelera con un movimiento de vaivén. Fijar la muestra del corazón durante 20 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Limpie el agua en la parte posterior de las diapositivas y poner las diapositivas en el escenario de un microscopio de disección para el intercambio de buffer. </li><li> Que moje la punta de un pipetteman 10μl en una región vacía en cada pozo y mantener la punta de la medida de lo posible a partir de muestras de corazón. Tomar precauciones para evitar que el corazón inherentes a la punta, ya que los corazones puedan moverse con el flujo de agua cuando la solución se introduce en la punta. Cambiola localización de la punta, si es necesario. </li><li> Deseche la solución en un pañuelo y evitar la producción de las burbujas en la punta ya que la muestra del corazón se pierde fácilmente en la presencia de burbujas de aire. Mantener las muestras de corazón parcialmente seco por un corto tiempo puede ayudar a los corazones de permanecer conectados a las diapositivas. </li><li> Añadir 50μl PBST para cubrir la muestra y se incuba en el corazón de la cámara húmeda en un movimiento de balanceo lento durante 5 minutos. Repita el enjuague una vez más. Después de este paso, las muestras del corazón pueden ser almacenados en la cámara húmeda hasta 1 semana a 4 ° C. </li><li> Bloque de la muestra de corazón con suero de oveja 10% en PBST durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Incubar la muestra de corazón con los anticuerpos primarios, tales como dilución 1:200 de la β-catenina de anticuerpos y la dilución 1:200 de MEF2 anticuerpo específico, en el 10% suero de oveja / PBST durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Lavar la muestra con el corazón PBST tres veces (5 min. Cada uno) a temperatura ambiente. </li><li> Incubar la muestra con la secundariaanticuerpos, tales como dilución 1:1000 de Alexa-etiquetados anti-ratón y / o anticuerpos anti-conejo, en PBST durante 0,5 horas. </li><li> Lavado de las muestras de corazón con PBST tres veces (5 min. Cada uno) a temperatura ambiente. </li></ol> 4. Imágenes <ol><li> Quitar PBST y se añaden 10 l medio de montaje en cada pocillo. Rocas de la cámara durante varios minutos hasta que la solución se aclare. </li><li> Eliminar la mayor parte del medio de montaje y cubrir todos los pozos en una diapositiva con una cubierta de cristal de microscopio (24x50). </li><li> Corazón la imagen de peces utilizando Zeiss Axioplan 2 microscopio equipado con ApoTome (Carl Zeiss). </li></ol> 5. Resultados representante Un ejemplo de una imagen que revela la membrana y el núcleo de todos los cardiomiocitos del pez cebra se muestra en la fig. 1. anticuerpos MEF2C y β-catenina se utiliza junto a manchar las muestras de corazón disecado de 52 HPF embrión de pez cebra. Mientras que las manchas de MEF2C anticuerpos de los núcleos de cardiomiocitos, β-cateninaanticuerpos revela el borde de cada celda de 8.10. Mediante el ajuste de la platina del microscopio compuesto, las imágenes de las muestras de corazón se puede ajustar a la misma orientación, lo que permitirá la observación de la curvatura exterior y la curvatura interna en el corazón 11. El número de cardiomiocitos total, tamaño de la celda de cardiomiocitos, y la circularidad se puede medir. Otro ejemplo que revela la estructura del sarcómero de un corazón embrionario se muestra en la fig. 2. Se realizó inmunotinción con F59, un anticuerpo miosina, en un corazón disecado embrionarias. La red de miofibrillas en el corazón embrionario completo puede ser revelado claramente a un menor aumento, mientras que la banda estriada del filamento grueso se puede revelar a mayor aumento (Fig. 2) 6. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3510/3510fig1.jpg"> Figura 1. Inmunotinción de MEF2 (rojo) y β-catenina (verde) para mostrar los núcleos y outlines de los cardiomiocitos en un ventrículo del pez cebra. Barra de escala = 10μm <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3510/3510fig2.jpg"> Figura 2. Immnostaining de la miosina para mostrar el filamento grueso en un ventrículo del pez cebra en cualquiera de bajo aumento (A) o aumento (B). Barra de escala = 10μm

<ol><li>Shin, J. T., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Zebrafish+to+human%3A+modular+medical+models%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genomics+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">From Zebrafish to human: modular medical models.</a> Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3, 311-340 (2002).</li>
<li>Beis, D., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cell+biology%3A+following+the+zebrafish+trend%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo cell biology: following the zebrafish trend.</a> Trends. Cell. Biol. 16, 105-112 (2006).</li>
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<li>Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+zebrafish+essential+and+regulatory+myosin+light+chains+reduces+cardiac+function+through+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Depletion of zebrafish essential and regulatory myosin light chains reduces cardiac function through distinct mechanisms.</a> Cardiovasc. Res. 79, 97-108 (2008).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

En comparación con los métodos clásicos de todo el montaje inmunoticción, nuestro método tiene las siguientes ventajas. En primer lugar, mucho más fuertes señales fluorescentes pueden ser obtenidos consistentemente, debido a una mejor penetración. En el método de tinción de montaje conjunto, el denso tejido de la piel que rodea el corazón reduce significativamente la penetración de muchos anticuerpos, lo que resulta en el fondo de alto en todo el cuerpo. Este problema es especialmente grave para los embriones de más de ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> tricaína </td><td> Orgánicos de investigación </td><td> 3007T </td></tr><tr><td> Formaldehído </td><td> Polysciences </td><td> 04018 </td></tr><tr><td> La insulina jeringa </td><td> Becton Dickinson </td><td> 329461 </td></tr><tr><td> Triton-X-100 </td><td> Sigma </td><td> T8532 </td></tr><tr><td> Anti-β-catenina de anticuerpos </td><td> Sigma </td><td> C7207 </td></tr><tr><td> Anticuerpos anti-MEF2C </td><td> Santa Cruz Biotech </td><td> SC313 </td></tr><tr><td> F59 </td><td> Zfin </td><td></td></tr><tr><td> Anti-α-actinina anticuerpos </td><td> Sigma </td><td> A7811 </td></tr><tr><td> Anticuerpo anti-calaña </td><td> Señalización celular </td><td> # 3862 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 568 cabra anti IgG de conejo </<html> td&gt; <td> Invitrogen </td><td> A11011 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 cabra anti IgG1 de ratón </td><td> Invitrogen </td><td> A21121 </td></tr><tr><td> Medio de montaje para fluorescencia </td><td> Vector </td><td> H-1200 </td></tr><tr><td> ImmEdge pluma </td><td> Vector </td><td> H-4000 </td></tr><tr><td> Poli-L-lisina portaobjetos recubiertos </td><td> Electrónica de ciencias de la microscopía </td><td> 63410-01 </td></tr><tr><td> Microscopio cubierta de vidrio </td><td> Pescador </td><td> 12 a 543-D </td></tr><tr><td> Diapositivas cóncavo microscopio </td><td> Pescador </td><td> 7-1305-8 </td></tr><tr><td> Disección microscopio </td><td> Leica MZ95 </td><td></td></tr><tr><td> Compuesto microscopio </td><td> Zeiss </td><td> Axioplan2 </td></tr><tr><td> ApoTome </td><td> Zeiss </td><td></td></tr></tbody></table> PBST: 1 x PBS 0,5% Triton X-100 ent &quot;&gt; 25X tricaína: 400 mg tricaína 97.9 mL ddH2O 2,1 ml (1M Tris pH 9) Ajustar el pH a 7.0

inmunotinción de disección del corazón embrionario de pez cebra

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart 

Embrión de pez cebra se convierte en un popular modelo de vertebrados vivo para el estudio de desarrollo cardiaco y las enfermedades del corazón humano, debido a su ventajosa embriología y la genética 1,2. Unos 100-200 embriones están disponibles todas las semanas de un par de peces adultos. Los embriones transparentes que se desarrollan fuera del útero lo hacen ideal para la evaluación de defectos cardíacos 3. La expresión de cualquier gen pueden ser manipulados a través de la tecnología morpholino o ARN de inyección 4. Por otra parte, hacia las pantallas de genética ya han generado una lista de mutantes que afectan a las diferentes perspectivas de la cardiogénesis 5. Toda la inmunotinción de montaje es una técnica importante en este modelo animal para revelar el patrón de expresión de la proteína dirigida a un determinado tejido 6. Sin embargo, las imágenes de alta resolución que pueden revelar las estructuras celulares o subcelulares han sido difíciles, debido principalmente a la física location del corazón y de la escasa penetración de los anticuerpos. A continuación, presentamos un método para hacer frente a estos cuellos de botella mediante la disección de corazón y luego llevar a cabo el proceso de tinción de la superficie de un portaobjetos de microscopio. Para evitar la pérdida de las muestras de corazón pequeño y para facilitar el manejo de la solución, que limita las muestras de corazón dentro de un círculo en la superficie del portaobjetos dibujado por una pluma immEdge. Después de la tinción, las señales de fluorescencia puede ser observada directamente por un microscopio compuesto. Nuestro nuevo método mejora significativamente la penetración de los anticuerpos, ya que un corazón de un pez de embriones sólo se compone de capas de células de unos pocos. Imágenes de alta calidad de los corazones intactos se pueden obtener en un plazo muy reducido para la procesión de embriones de pez cebra edades comprendidas entre los día 2 al día 6. Nuestro método puede ser potencialmente extenderse a otros órganos disecados mancha de cualquiera de pez cebra y otros animales pequeños.

Una forma rápida para llevar a cabo la inmunotinción del corazón embrionario del pez cebra se describe. En comparación con el enfoque de montaje inmunotinción todo, este método aumenta considerablemente la penetración de los anticuerpos, lo que permite obtener imágenes de alta resolución que revelan la estructura celular / subcelular en el corazón dentro de un tiempo de procesamiento muy reducida.

Inmunotinción de Disección del corazón embrionario de pez cebra

El embrión de pez cebra se ha convertido en un modelo vertebrado in vivo muy popular para estudiar el desarrollo cardiaco y las enfermedades cardiacas humanas debido a su embriología ventajosa...

El objetivo general de este procedimiento es realizar tinción inmunohistoquímica en corazones de embriones de pez cebra disecados para revelar estructuras celulares o subcelulares con alta resolución. Esto se logra primero preparando portaobjetos en una cámara humedecida para la tinción inmunohistoquímica. A continuación, se disecciona el corazón de un embrión de pez cebra anestesiado, seguido de la tinción inmunohistoquímica del corazón embrionario con un anticuerpo específico.Luego, se documentan imágenes de corazones de peces con un microscopio equipado con un aome. Finalmente, se revelan estructuras celulares o subcelulares en el corazón embrionario de pez cebra mediante microscopía de inmunofluorescencia debido a una penetración mucho mayor. La ventaja de esta técnica sobre métodos existentes como la tinción inmunohistoquímica en portaobjetos, es la capacidad de obtener imágenes de alta calidad del corazón estándar de pez cebra. Para preparar una cámara humectada y proteger las muestras de la luz, use papel de aluminio para envolver la cámara y la tapa de una caja de puntas vacía.Evite que las muestras se sequen colocando una pila de toallas de papel húmedas en el fondo de la cámara, y coloque una pequeña placa de microtitulación encima de las toallas de papel como soporte para los portaobjetos. Utilice un rotulador para imágenes para dibujar pozos, ya sean círculos o líneas con dimensiones de aproximadamente cinco por cinco milímetros sobre la superficie de un portaobjetos. Deje secar los portaobjetos.Coloque las laminillas en la cámara humidificada y agregue 50 microlitros de formaldehído a cada pocillo. Para diseccionar el corazón embrionario, anestesie el embrión de pez en agua de huevo E3 que contiene 0,4 % de trica hasta que el pez deje de mover todo el cuerpo, pero aún mantenga los latidos cardíacos normales. Aproximadamente un minuto.Transfiera los embriones a un pozo cóncavo. Coloque un portaobjetos microscópico cóncavo en la platina de un microscopio de disección utilizando luz polarizada tipo campo oscuro o contraste de interferencia diferencial (DIC). Ajuste la iluminación del microscopio para revelar claramente el corazón.A continuación, limpie dos jeringas de insulina con etanol al 75 %. Luego seque y aumente el aumento del microscopio para enfocar el corazón. A continuación, fije físicamente un embrión insertando la punta de una aguja en la yema, de modo que el límite del ácaro quede cerca de la cabeza.Luego inserte otra aguja cerca de la región del corazón y extraiga rápidamente el corazón. Si el corazón no está completamente separado del embrión, corte el tejido restante que lo conecta con la yema. Enfóquese en el corazón con una ampliación menor.Con un pipetaman de 10 microlitros ajustado a un volumen de un microlitro, acerque la punta del pipetaman para aspirar o tocar la muestra cardíaca, de modo que el corazón aislado quede dentro o adherido a la superficie de la punta. Sumerja la punta del pipetaman en la solución de formaldehído sobre portaobjetos preparados y presione el émbolo de la pipeta para liberar el corazón en la solución.Con los corazones en formaldehído sobre las laminillas de depresión, cierre la cámara y colóquela en un agitador con movimiento suave durante 20 minutos a temperatura ambiente, limpie el agua de la parte posterior de las laminillas y coloque las laminillas sobre la platina de un microscopio de disección para el intercambio de tampón. Utilice un pipetaman de 10 microlitros para aspirar cuidadosamente el formaldehído de la laminilla, dejando los corazones intactos. Añada 50 microlitros de PBST para cubrir las muestras de corazón e incube en la cámara humedecida durante cinco minutos.Lave los corazones una segunda vez en PBST. A continuación, bloquee la muestra de corazón con suero de oveja al 10% en PBST durante una hora a temperatura ambiente. Luego incube las muestras de corazón con una dilución de uno a 200 de las anticuerpos primarios específicos beta catenina y F dos en PBST con suero de oveja al 10% durante una hora a temperatura ambiente.Lave las muestras de corazón con PBST tres veces durante cinco minutos cada una a temperatura ambiente. Incube las muestras con una dilución uno a 1000 de un marcador Alexa, anticuerpos secundarios anti ratón y/o anti conejo en PBST durante 30 minutos. Lave nuevamente las muestras tres veces con PBST para obtener imágenes de las mismas.Retire el PBST y agregue un microlitro de medio de montaje a cada uno. Agite suavemente la cámara durante varios minutos hasta que la solución se vuelva clara. Observe el corazón del pez mediante un microscopio Zes Axio plan dos equipado con un aome. En esta imagen, los núcleos y las membranas celulares de los cardiomiocitos de pez cebra procedentes de un embrión de pez cebra a las 52 horas post-fecundación se identifican mediante anticuerpos contra MEF dos C y betaina, respectivamente.Al ajustar la platina del microscopio compuesto, es posible alinear las imágenes de las muestras cardíacas en la misma orientación, lo que permite observar la curvatura externa y la curvatura interna del corazón. Luego, se puede medir el número total de cardiomiocitos, el tamaño celular de los cardiomiocitos y la circularidad. Aquí, se muestra la estructura sarcomérica de un corazón embrionario diseccionado utilizando el anticuerpo contra la miosina F 59. La red Myo fial en un ventrículo completo de corazón embrionario es claramente visible a menor aumento, mientras que la banda estriada de filamentos gruesos se observa a mayor aumento.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar tinción inmunológica en corazones de pez cebra disecados, especialmente cómo diseccionar el corazón del pez cebra April y cómo manipular el corazón durante el proceso de inmunotinción.

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Investigación

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Biología

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