Name: El aislamiento y estudio biofísico de las cutículas de fruta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 53 s
Description: Aprende a aislar cutículas de tomate y evaluar su capacidad de reticulación mediante RMN de estado sólido y microscopía de fuerza atómica. Este protocolo permite caracterizar biopolímeros cuticulares y mejorar la resiliencia de cultivos.

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Este trabajo fue apoyado por EE.UU. concede la National Science Foundation # MCB-0741914 y 0843627 MCB-, el apoyo de infraestructura adicional fue proporcionada en el City College de Nueva York por los Institutos Nacionales de Salud 2 RR03060 G12-26 del Centro Nacional para Recursos de Investigación. Agradecemos la JKC Rose grupo en el Departamento de Biología Vegetal de la Universidad de Cornell para proporcionar M82 (tipo salvaje) y CM15 (mutante) las cutículas de tomate. Agradecemos al Dr. Spyros Monastiriotis del grupo de Ingeniería Química CCNY del Prof. Alexander Couzis por su generosa ayuda con los experimentos de AFM. Agradecemos a la Sra. Laura Gohara de apoyo de diseño gráfico.

1. Aislamiento enzimática de las cutículas de tomate 5 <ol><li> Coloque los tomates varios comerciales o cultivadas en un recipiente. Pelar la piel de las frutas en grandes secciones; descartar el tejido del pericarpio interior. Lavar las pieles de tomate con agua desionizada y preservar ellos bajo el agua en un vaso de precipitados. </li><li> Preparar un 50 mM pH 4,0 tampón acetato de sodio (a 31 ° C) poniendo 1,22 g de acetato de sodio trihidratado (M r. 136,08 g / mol) y 2,34 ml de ácido acético glacial (17.485 M) en un vaso de precipitados, añadiendo 200 ml de agua desionizada, y luego ajustando el pH a 4,0 a 31 ° C. Preparar una mezcla que contiene 4 ml de pectinasa (EC 3.2.1.15; 10 U ml -1, TCI América), 0,2 g de celulasa (CE 232.734.4; 1,3 unidades / mg de sólido, Sigma Aldrich), y 13 mg de NaN 3, y luego añadir 196 ml de tampón acetato de sodio a la mezcla de enzimas para obtener 200 ml del cóctel de enzimas final. 5 Sumerja completamente la piel de tomate pelado en el cóctel de enzimas e incubara 31 ° C durante 24 horas con agitación constante (G24 Ambiental Incubadora de Shaker, New Brunswick Scientific Co.). </li><li> Recoge las cáscaras de tomate con un colador de cocina, o el embudo Büchner y se lava con agua desionizada. Posteriormente, los coloca en una estufa de vacío a temperatura ambiente durante una hora. Preservar las pieles secas de tomate en una botella etiquetada y tapada para los procedimientos de desparafinado subsiguientes. </li></ol> 2. Desparafinado exhaustiva por extracción Soxhlet 6 <ol><li> El equipo utilizado para desparafinado exhaustiva consta de una fuente de calor (calefacción manto y el controlador Variac), matraz de fondo redondo de un depósito de disolvente, extractor Soxhlet, dedal de vidrio sinterizado o cartucho de extracción desechable, los chips anti-golpes y un condensador (ver fig. 1). Observe que el brazo sifón estrecho (partes 6 y 7 en la figura. 1) es muy delicado y propenso a la rotura, lo que requiere un manejo cuidadoso. </li><li> Ponga 0.5-1 g de piel de tomate (obtenido en elel paso 1.) en un mortero, y moler la muestra a un polvo grueso con un mortero a menos que las muestras se van a utilizar para las mediciones de AFM (Sección 5). Llenar un dedal de vidrio sinterizado o desechables aproximadamente hasta la mitad con la muestra y utilizar pinzas para colocar cuidadosamente en la base de la columna de extracción. </li><li> Poner el condensador y se envuelve con papel de aluminio. Calentar el disolvente de metanol (grado ACS) en presencia de unos pocos anti-bumping virutas hasta que hierva suavemente y reflujos en las paredes del matraz. Cubrir el depósito de disolvente con lana de vidrio tanto y papel de aluminio. Ver el proceso para una hora, ajustar el voltaje Variac manera que el depósito se acumula sobre una gota por segundo y sifón se produce dentro del aparato Soxhlet cuando el dedal está lleno. </li><li> Continuar el proceso de extracción durante 12 h, luego baje la manta calefactora y permitir que el aparato se enfríe. Quitar el extractor y el depósito como una sola unidad para disponer del disolvente. Utilice pinzasrs para elevar el dedal a justo por debajo del cuello de la columna de extracción, drenar el exceso de disolvente a partir de ella, y colocar el cartucho en una superficie limpia. Incline la columna de extracción para permitir sifón en el matraz a continuación. Desconecte el frasco y verter los residuos en un recipiente de desperdicio etiquetado solvente. </li><li> Repetir los pasos 2.3 y 2,4 para los disolventes sucesivas de polaridad disminuyendo progresivamente, por ejemplo, cloroformo y hexano durante 12 h en cada caso. </li><li> Permitir la muestra cutina tomate para secar el interior del dedal, ya sea por soplado de una corriente de gas nitrógeno sobre él o colocándolo en un horno de vacío a temperatura ambiente. Por último, medir la masa de la muestra seca y almacenar a temperatura ambiente en un frasco con tapa de rosca sellado con parafilm. </li></ol> 3. Aislamiento selectivo de ceras epicuticulares y Intracuticular 3,4 <ol><li> En primer lugar, lavar los tomates enteros (un lote por separado de los tomates de los descritos en 1.) Con agua destilada. Seque con paper y toallas Kimwipes, y el lugar que se derivan a la baja sobre un pedazo de papel de aluminio. </li><li> Pinte los tomates enteros, con un 120% (w / w, la relación de masa) de las encías árabe solución acuosa de arriba hacia abajo de la moda y permitir que alrededor de una hora para la goma árabe que se seque sobre la piel de la fruta, dejando una capa delgada. Retire esta película con unas pinzas, teniendo cuidado de no perforar la piel de tomate. Repita el procedimiento una vez más. </li><li> Añadir las películas a viales que contienen 1:1 (v / v) de cloroformo-agua y se mezcla durante tres minutos. Después de una agitación vigorosa y separación de fases, pipetear las fracciones de cloroformo y se evapora en viales separados cubierto, dejando cera epicuticular. Los tomates se mantendrán intactos físicamente. Sumergir ellos en cloroformo durante dos minutos a temperatura ambiente y recoger la cera intracuticular después de evaporar el disolvente. Ahora, la cáscara de los tomates y tratarlos enzimáticamente (con celulasa y pectinasa en tampón acetato de sodio) para eliminar la celulosa y pectina, respectivamente (como se describe en <li> Si se desea, realizar desparafinado exhaustiva sobre estas cutículas enzimáticamente aislados por extracción Soxhlet (ver paso 2), utilizando tres disolventes de polaridad variable (metanol, cloroformo, y hexano, respectivamente). </li></li></ol> 4. Caracterización molecular de cutina del fruto de tomate por polarización cruzada de ángulo mágico de Spinning de estado sólido de Resonancia Magnética Nuclear (CPMAS ssNMR) 6 <ol><li> Lugar 4.6 mg de cutículas de tomate totalmente desparafinada (las entrada) en un 1,6 mm fastMAS zirconia del rotor utilizando el suministrado por el proveedor de herramientas de embalaje. (Cualquiera de las cutículas de tierra desparafinados tomate o piezas muy pequeñas de las cutículas parcialmente desparafinados son adecuados.) Asegúrese de que la muestra está llena de manera uniforme, pero no con demasiada fuerza, en el rotor. Después de poner en la tapa superior, pintar la mitad de la tapa con un rotulador negro de tinta para facilitar la medición de la velocidad de giro. </li><li> Ajuste el número de calces del espectrómetro de RMN para el ancho mínimo de línea espectral a la mitad de la altura de unND calibrar el protón (1 H) y carbono (13 C) 90 ° anchuras de impulso utilizando un compuesto estándar tales como adamantano. </li><li> Uso de glicina o la glutamina como compuestos modelo, obtener la máxima intensidad de la señal mediante la optimización de todos los parámetros (Hartmann-Hahn emparejan los niveles de potencia, 1 H-13 C tiempo de contacto, heteronuclear 1 H fuerza disociación) de la polarización cruzada de ángulo mágico-hilado (CPMAS) experimento. Para espectros adquiridos en una frecuencia de 1 H, de 600 MHz, las condiciones recomendadas incluyen 10 kHz o 15 kHz de frecuencia hilado, un retardo de 3-sec entre las adquisiciones, y el protón ESPINAL heteronucleares desacoplamiento 7 a una intensidad de campo magnético equivalente a una frecuencia de 185 kHz. </li><li> Insertar el rotor cutina compacta en la sonda. Luego, coloque la sonda en el imán. Aumentar la velocidad de hilatura hasta 10 kHz gradualmente para comprobar si hay buena muestra de embalaje y la estabilidad del rotor. Verificar la estabilidad final hilatura del rotor dentro± 20 Hz. </li><li> Ajustar la puesta a punto y hacer coincidir los condensadores de la sonda de forma iterativa para lograr la reflexión de potencia mínima, tanto en 1 H y 13 C RMN frecuencias. Ajuste la temperatura experimental a 25 ° C (o temperatura ambiente). </li><li> Comienzo del experimento de pre-optimizado CPMAS correspondiente a la condición de Hartmann-Hahn coincidente determina en la frecuencia de 10 kHz hilatura. </li><li> Adquirir los transitorios de 4096, la condición del espectro con la exponencial (Lorentz) línea de ampliación de 50 a 100 Hz, y hacer una transformada de Fourier para generar un espectro de RMN de la intensidad de la señal frente a productos químicos de protección (ppm). </li><li> Referencia del producto químico C 13 turnos de forma externa mediante conjunto adamantano al 38,4 ppm (-CH 2 - grupo) 8 como estándar. </li><li> Aumentar la frecuencia del rotor girando a 15 kHz y repetir la medición CPMAS (pasos 4,6-4,8) correspondiente a la condición de Hartmann-Hahn coincidente determinado a esta frecuencia último girando. </li><li> Repeen los experimentos CPMAS (pasos 4.1-4.9) con muestras cutícula naturales (ceroso) y desparafinado parcialmente la fruta. </li></ol> 5. Sondeo de la superficie de la cutícula de tomate con Microscopía de Fuerza Atómica (Digital Instruments Nanoscope IIIa, los procedimientos pueden variar ligeramente entre microscopios) 6 <ol><li> Encienda el microscopio de sonda de barrido (SPM) (Fig. 2) y asegúrese de que el interruptor de modo de microscopio toggle se establece como la Microscopía de contacto Fuerza Atómica (AFM) de modo. </li><li> Manual de levantar la cabeza SPM girando sus dos ajustables por el usuario mandos frontales. Separe la tipholder AFM de la cabeza del SPM, girando el tornillo de sujeción en la parte posterior de la cabeza. </li><li> Use unas pinzas para quitar la existente cantilever de AFM de la tipholder, luego, con cuidado agarra una palanca de silicio nitruro de nuevo (Sonda de AFM) de su paquete e instalarlo en el lugar de la viga de edad. Utilice un microscopio de luz para comprobar que el recién instalado en voladizo AFM no está roto. </li><li> Adjuntar ºde tomate e la cutícula de la muestra (una sección de la cutícula de tomate parcialmente desparafinados ~ 10 mm x 10 mm) en un disco de acero inoxidable (muestra puck) con cinta de doble cara. Utilizar un microscopio de luz para verificar que la superficie de la cutícula permanece plana y lisa después de la colocación de la muestra sobre el disco. </li><li> Coloque el disco con la muestra cutícula tomate en la región magnético en la parte superior del escáner SPM. </li><li> Ajuste los dos tornillos delanteros de ajuste manual del escáner de alta girando las perillas, establecer el tornillo posterior ajuste motorizado de aproximadamente el mismo nivel que los otros dos tornillos delanteros. Asegúrese de que los tres tornillos están lo suficientemente alto para evitar que se rompa la punta del AFM al colocar la tipholder en la cabeza del SPM. </li><li> Vuelva a insertar el tipholder en la cabeza del SPM y fijarlo apretando el tornillo de sujeción en la parte posterior de la cabeza. </li><li> Después de encender el láser, alinee el punto láser en el cantilever de AFM con la central (y) y derecha (x) perillas de ajuste del láser en la parte superior de la cabeza.Controlar el haz láser reflejado en un trozo de papel para colocar el punto láser exactamente en el extremo del voladizo AFM. </li><li> Ajustar la posición del espejo móvil iterativamente utilizando los botones de ajuste fotodetector para lograr la máxima señal (señal SUM), asegurando así que el haz de láser reflejado se está recibiendo uniformemente por los cuatro cuadrantes del fotodetector. </li><li> Bajo la punta del AFM por retracción de los tornillos de ajuste manual del frente y el tornillo posterior ajuste motorizado del escáner SPM, visualmente supervisar el enfoque de la punta del AFM hacia la superficie de la muestra con un microscopio invertido. Asegúrese de que los tres tornillos en el mismo nivel para evitar los artefactos de la imagen de una muestra inclinada. Llevar la punta hacia la muestra, pero no tan cerca que los toques de punta o se rompe a través de la superficie de la muestra. </li><li> En este punto, la luz láser reflejada por el cantilever de AFM rebotará en el espejo móvil de la célula fotoeléctrica. Para el modo de contacto AFM con una siliconaCon nitruro de punta de AFM, establezca la señal de salida (desviación vertical) de tensión a -2 V para un punto de ajuste de 0 V y la señal de DIF (vertical / horizontal de diferencia) a 0 V mediante el ajuste de la posición del espejo. </li><li> Usando el software de Nanoscope, haga clic en el icono de microscopio y seleccionar el perfil adecuado (modo de contacto AFM). </li><li> Uso de la "Configuración de la exploración Controles" del panel, configurar la velocidad de barrido y, por ejemplo tamaño de escaneado, de 10 micras de tamaño de exploración y 2 Hz frecuencia de barrido. </li><li> Permita que la punta del AFM para enganchar la superficie de la muestra haciendo clic en el icono de participar de punta. Al controlar el tornillo posterior motorizado de la base de SPM, el programa ahora bajará la punta hasta que se acopla a la superficie de la muestra. El proceso de exploración se iniciará automáticamente una vez que la punta ha participado con éxito. </li><li> Supervisar el proceso de exploración utilizando ambos modos de imagen y el alcance del software, el ajuste de parámetros como consigna, ganancia integral, la ganancia proporcional, tamaño de escaneado, velocidad de exploración, las líneas y las muestras por línea iterativa para alcanzar el más altoimágenes de alta resolución. Inicie la exploración con un gran eje z rango (escala de datos); luego cuidadosamente reducir el valor de la escala de datos para observar el mejor contraste de características de la superficie sobre la imagen. Minimizar la aparición de zonas blancas en la imagen escaneada, los cuales indican que la altura de las características de la superficie superior a la disponible eje z rango. </li><li> Para capturar la imagen para guardar el archivo de datos, y luego procesar los datos utilizando las funciones de aplanamiento para eliminar artefactos de la imagen debido al desplazamiento vertical del escáner (Z), los arcos de la imagen, y el desplazamiento vertical entre las líneas de exploración, 9, finalmente calcular la rugosidad media. Después de guardar los datos, retraer la punta del AFM mediante la inversión de la acción del motor del tornillo controlado por computadora que se utilizó para participar. El procesamiento de imágenes puede realizarse en modo fuera de línea de análisis de imagen y / o utilizar un equipo diferente. </li><li> Utilice los mandos frontales inferiores grises de metal de la titular de la punta para cambiar las posiciones x e y de la zona de exploración, y luego repetir la operación en la muestra cinco ubicaciónciones para comprobar la reproducibilidad, en sustitución del cantilever de AFM, si la calidad de imagen se deteriora. </li></ol> 6. Los resultados representativos El análisis químico desplazamiento de la CPMAS 13 espectros RMN de C (Fig. 3) identificaron los principales grupos funcionales presentes en la cutícula tomate exhaustivamente desparafinado (cutina). Los restos de carbono clave en la biopolyester cutina resultaron ser alifáticos de cadena larga (0-45 ppm), alifáticos oxigenados (45-110 ppm), se multiplican unidos-y aromáticos (110-160 ppm), y carbonilos (160-220 ppm). Los restos alquilo oxigenados (CHO + CH 2 O) juegan un papel crucial en el establecimiento de conexiones covalentes entre las unidades monoméricas del biopolímero cutina, formando de este modo la arquitectura molecular de la matriz de cutina. Las diferencias en áreas de los picos relativos observados en la región espectral entre 45 ppm y 100 indican que la cutina mutante tiene una proporción relativamente grande de conformación structura reticulación CHO fracciones l en comparación con el tipo salvaje cutina, cuidadosas mediciones cuantitativas, mediante la polarización directa (DPMAS) RMN 5 métodos de apoyar esta inferencia (datos no mostrados). CPMAS 13 C espectros de RMN también mostró un pico de cera disminuyendo progresivamente a 31 ppm (fig. 4), lo que indica la eliminación secuencial de epi-y ceras intracuticular del compuesto cutina-cera mientras que conserva la arquitectura química principal del biopolímero cutina. Análisis paralelo imagen AFM (fig. 5) reveló irregularidades de la superficie debido a la extracción gradual de epi-y ceras intracuticular de la cutícula de fruta, lo que significa alteraciones en la organización del conjunto cuticular. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig1.jpg"> . Figura 1 extractor Soxhlet (origen de la imagen: Wikipedia). "/&gt; Figura 2. Un microscopio de barrido) de la sonda. B) SPM cabeza (adaptado del manual de capacitación AFM proporcionada por Digital Instruments). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig3.jpg"> Figura 3. 150 MHz CPMAS 13 C espectros de RMN de manera exhaustiva desparafinados rojos cutículas maduras del fruto de tomate (las entrada) de tipo salvaje (M82) y mutante (CM15) muestran resonancias con los desplazamientos químicos correspondientes a los grupos funcionales de un ácido hydroxyfatty reticulado basado en poliéster y también algunos restos multiplican unidos. Todos los espectros fueron adquiridos con una frecuencia de 10 kHz girando. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig4.jpg"> Figura 4. 150 MHz 13 CCPMAS espectros de RMN de los comerciales de tomate rojo maduro cutículas fruta exhiben cambios en la composición sobre la eliminación secuencial de las ceras y epicuticulares intracuticular por la goma de mecánica de extracción árabe y un two minutos de inmersión en el cloroformo, respectivamente. Todos los espectros fueron adquiridos con una frecuencia de 15 kHz girando. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig5.jpg"> Figura 5. Imágenes AFM y estimaciones de rugosidad para el tomate parcialmente desparafinados comercial cutículas descrito en la Figura 4 después de la eliminación gradual de epicuticulares (izquierda) y intracuticular (derecha) las ceras.

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<li>Last, J. A., Russell, P., Nealey, P. F., Murphy, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Applications+of+Atomic+Force+Microscopy+to+Vision+Science%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The Applications of Atomic Force Microscopy to Vision Science.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 6083-6094 (2010).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Los protocolos descritos aquí permiten la caracterización molecular detallada y microescala de un material vegetal intratable complejo sin la necesidad de descomposición química destructiva. Para investigar la fusión de la biopolyester cutina con diversos lípidos (ceras) que controlan la estructura orgánica de la asamblea cuticular, 10 llevamos a cabo y supervisar los procedimientos para la eliminación selectiva de las ceras y epicuticulares intracuticular partir de la mezcla heterogénea cuticular. De estado sólido 13 C RMN se utilizó para medir la extracción de los componentes de cera moleculares, y microscopía de fuerza atómica sirve para examinar los cambios concomitantes en la rugosidad superficial. 6,11 Para comparar las capacidades de reticulación de las entrada de cultivo de tipo salvaje y de un solo gen las frutas mutantes de tomate, de estado sólido de 13 C RMN también se utilizó para estimar el número relativo de CHO y CH 2 O restos de productos químicos. Una serie de característica de diseños de este protocolo son notables. Como los materiales de cera abarcar una amplia gama de lípidos, el tratamiento de la cutícula fruta con una serie de disolventes que tienen polaridades divergentes es esencial para lograr desparafinado exhaustiva. Además, el tiempo de desparafinado puede variar de 8 horas a 24 horas dependiendo de la naturaleza de las muestras de la cutícula. Para extraer las ceras epicuticulares consistentemente de la cutícula de frutas intactos, es imperativo para aplicar el revestimiento adhesivo de manera uniforme a la superficie. De estado sólido CPMAS 13 C RMN 12 es un método rápido cualitativo para la identificación de diferentes componentes estructurales de biopolímeros vegetales altamente heterogéneas e insoluble preservando al mismo tiempo sus características físicas nativas; 13 tradicional solución RMN en estado también se puede utilizar para caracterizar las mezclas de cera extraídos. Si estimación cuantitativa de los grupos funcionales se desea para los polímeros de plantas intactas, 5 de alta fidelidad directa de polarización de ángulo mágico de hilatura (DPMAS) 13 C RMN 5,14 se debe utilizar como un método complementario. Cuantificación exacta de los grupos funcionales requiere la optimización cuidadosa de los tiempos de reciclado, las longitudes de excitación del pulso y la fuerza de la disociación heteronuclear. 15 La desvinculación heteronuclear se pueden establecer para una intensidad de campo H 1 que van desde 50 kHz a 185 kHz utilizando el TPPM 16 o LA COLUMNA VERTEBRAL 7 metodologías. Además de estos parámetros, la sensibilidad de las mediciones CPMAS depende del tiempo de giro de bloqueo y Hartmann-Hahn condición coincidente. 15 En lugar de CPMAS tradicionales, una rampa de amplitud CP (RAMP-CP) técnica puede ser implementada para maximizar la cruz -polarización eficiencia mediante la variación de la amplitud 1 H linealmente (~ 20-50%) o tangencialmente, manteniendo la amplitud de intensidad de campo 13 C constante durante el periodo de giro de bloqueo (o viceversa). 17,18 Realización de las mediciones en CPMAS un mínimo de dos ro diferentetor de hilado de frecuencias es imprescindible para distinguir bandas laterales giratorios de los picos espectrales principales. Simultáneas llevadas a cabo mediciones de AFM en el modo de contacto permiten la imagen directa de la condición de superficie de la cutícula con velocidades de escaneo de alta resolución y alta, 19 por ejemplo, durante la eliminación secuencial de los componentes de cera. Operando AFM en tapping (sin contacto) modo se puede utilizar como una alternativa para la caracterización de la superficie de delicados materiales &quot;blandos&quot; de plantas, evitando posibles daños debido a laterales (corte) fuerzas y raspado de la superficie de la muestra. 5,20 En cualquier caso , la adquisición secuencial de múltiples imágenes del mismo lugar en la superficie sirve para identificar cualquier daño en la superficie debido a la &quot;superficie de la sonda de interacciones&quot; en las mediciones de AFM. 6,21 Para la reproducibilidad óptima, las sondas de AFM con constantes de resorte adecuado para superficies blandas cuticulares debe ser utilizado, y la constancia de la temperatura y la humedad debe mantenerse. 6,15,20 </sa&gt; Considerando RMN en estado sólido ofrece un perfil molecular del conjunto de la media (a granel) en las propiedades de las cutículas de la fruta del tomate, la imagen de fuerza atómica proporciona una sonda complementaria no invasiva 22,23 para el seguimiento de la topografía de la superficie de estas asambleas macromoleculares exquisitamente complejas. 1,2

<table><tbody><tr><td>Acetato de sodio trihidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8625-500G</td><td></td></tr><tr><td>Pectinasa</td><td>TCI America</td><td>P0026</td><td>EC 3.2.1.15; 10 U ml&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;, almacenar en refrigerador</td></tr><tr><td>Cellulasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1184-100KU</td><td>EC232.734.4; 1.3 unidades/mg, almacenar en refrigerador</td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9967</td><td></td></tr><tr><td>Azida de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002-100G</td><td>Extremadamente peligroso</td></tr><tr><td>Incubadora/agitador</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>N.º de modelo G24</td><td>N.º de fabricación M1036-000G</td></tr><tr><td>Horno al vacío</td><td>Precision Scientific</td><td>31566</td><td></td></tr><tr><td>Controlador Variac</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cartucho de vidrio sinterizado (85 mm/25 mm)</td><td>VWR international</td><td>89056</td><td></td></tr><tr><td>Cartucho de extracción desechable (80 mm/25 mm)</td><td>VWR international</td><td>28320</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>VWR international</td><td>EMD-MX0485-7</td><td></td></tr><tr><td>Lana de vidrio</td><td>VWR international</td><td>RK20789</td><td></td></tr><tr><td>Foil de aluminio</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-100</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers</td><td>VWR international</td><td>82027-452</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>VWR international</td><td>EM-CX1050-1</td><td></td></tr><tr><td>Hexano</td><td>Fisher Scientific</td><td>H302-4</td><td></td></tr><tr><td>Gas de nitrógeno</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR international</td><td>52858</td><td></td></tr><tr><td>Toallas de papel</td><td>VWR international</td><td>89002-984</td><td></td></tr><tr><td>Kim wipes</td><td>VWR international</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>Goma arábiga</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9752</td><td></td></tr><tr><td>Rotador de circona 1,6 mm fastMAS</td><td>Varian Inc., Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espectrómetro de RMN</td><td>Varian Inc., Agilent</td><td>imán de diámetro estándar</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50046</td><td>Compuesto modelo para CPMAS</td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49419</td><td>Compuesto modelo para CPMAS</td></tr><tr><td>Adamantano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>100277</td><td>Para calibrar el pulso de 90&amp;#x00B0; en RMN</td></tr><tr><td>Microscopio multifunción de sonda de exploración (Nanoscope IIIA)</td><td>Digital Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software Nanoscope</td><td>Digital Instruments</td><td></td><td>Versión 5.30r3sr3 (2005)</td></tr><tr><td>Sonda de AFM (punta de nitruro de silicio no conductivo)</td><td>Veeco Instruments, Inc.</td><td>Modelo NP-20</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio óptico</td><td>Digital Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disco magnético</td><td>Digital Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cinta de doble cara</td><td>VWR international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pelador de frutas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Embudo B&amp;#252;chner</td><td>VWR international</td><td>89038</td><td></td></tr></tbody></table>

el aislamiento y estudio biofísico de las cutículas de fruta

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

La cutícula, una capa hidrofóbica de protección en las partes aéreas de las plantas terrestres, funciona como una barrera defensiva versátil a varios estreses bióticos y abióticos, y también regula el flujo de agua desde el ambiente externo. 1 A biopolyester (cutina) y largas cadenas de ácidos grasos ceras) forman el marco estructural principal de la cutícula; la integridad funcional de la capa cuticular depende del exterior &#39;epicuticular&#39; capa, así como la mezcla que consiste en el biopolímero cutina y ceras de intracuticular de 2 Aquí, se describe un protocolo integral. para extraer de forma exhaustiva las ceras de tomate comercial (Solanum lycopersicum) de frutas o las cutículas para eliminar las ceras y epicuticulares intracuticular secuencialmente y de forma selectiva del compuesto de la cutícula. El método de la máquina y su Schäffer (2001) fue adaptada para la extracción gradual de las ceras y epicuticulares intracuticular de la cutícula de la fruta. 3,4 Para controlar laproceso de eliminación de la cera secuencial, de estado sólido de polarización cruzada magia de ángulo de giro (CPMAS) 13 C RMN se utiliza en paralelo con la microscopía de fuerza atómica (AFM), que proporciona a nivel molecular perfiles estructurales de los materiales a granel, complementadas con información sobre la topografía microescala y la rugosidad de las superficies cuticulares. Para evaluar la capacidad de reticulación de las cutículas desparafinados de frutos de tomate cultivadas de tipo salvaje y de un solo gen mutante, el MAS RMN de 13 C se utilizó para comparar las proporciones relativas de los hidrocarburos alifáticos oxigenada (CHO y CH 2 O), restos químicos. Desparafinado exhaustiva por extracción Soxhlet en etapas con un panel de disolventes de polaridad variable proporciona un medio eficaz para aislar restos de cera sobre la base de las características hidrofóbicas de su alifáticos y compuestos aromáticos, mientras que preserva la estructura química de la biopolyester cutina. La extracción mecánica de ceras epicuticulares y Seleeliminación de ceras ctive intracuticular, cuando son supervisados ​​por metodologías complementarias físicas, proporciona un medio sin precedentes para investigar el conjunto cutícula: este enfoque revela que la organización supramolecular y la integración estructural de varios tipos de ceras, la arquitectura de la matriz de cutina-cera, y la química la composición de cada componente. Además, de estado sólido de 13 C RMN revela diferencias en los números relativos de CHO y CH 2 O restos químicos de tipo salvaje y mutante frutas rojas maduras de tomate. Las técnicas de RMN ofrecen herramientas excepcionales para huella de la estructura molecular de los materiales que son insolubles cuticulares, amorfo, y heterogéneo químicamente. Como una técnica de imagen no invasiva de superficie selectiva, AFM proporciona un medio eficaz y directo para sondear la estructura orgánica de la asamblea cuticular en la escala de longitud de nm-m.

Órganos aéreos de las plantas están protegidos por la cutícula, una supramolecular biopolyester la cera de montaje. Se presentan los protocolos para controlar la eliminación selectiva de epi-y las ceras de la cutícula intracuticular fruta de tomate en las escalas moleculares y micro por la RMN en estado sólido y la microscopía de fuerza atómica, respectivamente, y para evaluar la capacidad de entrecruzamiento de ingeniería biopolyesters cuticulares.

El aislamiento y estudio biofísico de las cutículas de fruta

La cutícula, una capa protectora hidrofóbica en las partes aéreas de las plantas terrestres, funciona como una barrera defensiva versátil frente a diversos agentes bióticos y...

Este experimento utiliza técnicas biofísicas para evaluar la capacidad de reticulación del polímero cuticular protector y atractivo del tomate, y para monitorear la eliminación selectiva de ceras epicuticulares e intracuticulares de las cutículas de los frutos. El aislamiento de la cutícula a partir del fruto entero se logra mediante tratamiento enzimático de las pieles de tomate y de las paredes celulares adyacentes. En una segunda etapa, se utiliza extracción con éter para desparafinar exhaustivamente la cutícula del fruto, con el fin de obtener la caracterización molecular de la cutina aislada.El biopolímero de poliéster se analiza mediante resonancia magnética nuclear en estado sólido. El análisis espectral de RMN en estado sólido revela que en la cutina de cutículas de frutos de tomate de tipo silvestre e ingenierados, existen diferencias en las proporciones relativas de los grupos alifáticos oxigenados capaces de formar enlaces cruzados. Alternativamente, se pinta todo el fruto y se pela con goma arábiga para eliminar las ceras epicuticulares, y luego se sumerge en cloroformo para extraer las ceras intracuticulares de la cutícula del fruto.Luego, se examinan las cutículas parcialmente desparafinadas, aisladas mediante el mismo tratamiento enzimático que las pieles de tomate, utilizando resonancia magnética nuclear en estado sólido y microscopía de fuerza atómica. En última instancia, la eliminación secuencial de las ceras epicuticulares e intracuticulares es evidente mediante la observación de un pico de cera progresivamente decreciente en los espectros de RMN y alteraciones en el perfil superficial de la cutícula del fruto observadas mediante imágenes simultáneas de microscopía de fuerza atómica. Los órganos aéreos de las plantas están protegidos por un ensamblaje de cera poliéster bio-bio llamado cutícula. Presentaremos protocolos para evaluar la eliminación selectiva de ceras internas y externas de las cutículas de frutos de tomate utilizando resonancia magnética nuclear en estado sólido y microscopía de fuerza atómica.Estos métodos también pueden utilizarse para evaluar la capacidad de reticulación de materiales cuticulares diseñados. Los procedimientos serán demostrados por tres miembros del grupo Stark: el Dr. Ishish Chatterjee, la candidata al doctorado Shantani Sarkar y la antigua estudiante de secundaria Julia Tik. Un demostrador adicional es la Dra. Olivia Nisau, asociada posdoctoral en el laboratorio de nuestro colega de ingeniería química, el Dr. Alexander S. Para iniciar el aislamiento enzimático de la piel del tomate, coloque tres frutos comerciales o cultivados en un recipiente, retire la piel en secciones grandes y deseche el tejido interno del pericarpio.Luego lave las pieles de tomate con agua desionizada y consérvelas sumergidas en un vaso de precipitados, inmersa completamente la piel de tomate pelada en un cóctel enzimático preparado como se describe en el protocolo escrito. Incube a 31 grados Celsius durante 24 horas con agitación continua. Recoja las pieles de tomate utilizando un embudo Büchner o un colador de cocina y lávelas con agua desionizada.Después de colocar las pieles en un horno al vacío a temperatura ambiente durante una hora, las pieles secas pueden almacenarse en un frasco etiquetado y con tapa. Para procedimientos posteriores de desparafinado, llene un tímpano de vidrio centrado o desechable aproximadamente hasta la mitad con la muestra de cutícula de tomate; utilice pinzas para colocarla cuidadosamente en la base de la columna de extracción que se usará en la extracción sólida. Continúe preparando el equipo de extracción sólida utilizando metanol como disolvente, tal como se describe en el protocolo escrito.Supervise el proceso durante una hora, ajustando el voltaje del variac de modo que el depósito acumule aproximadamente una gota por segundo y se produzca el sifonamiento dentro de los calcetines del aparato. Cuando el cartucho esté lleno, tras una extracción de 12 horas, deje que el aparato se enfríe, luego baje el manto calefactor y retire el extractor y el depósito como una unidad para desechar el disolvente tras la extracción. Incline la columna para permitir el sifonamiento hacia el matraz inferior.Utilice pinzas para elevar el cartucho hasta justo debajo del cuello de la columna de extracción. Drene el disolvente en exceso y coloque el cartucho sobre una superficie limpia. Desconecte el matraz y vierta el residuo en un recipiente para disolvente etiquetado.Repita el procedimiento de extracción con disolventes sucesivos de polaridad progresivamente decreciente, como cloroformo y taxano, durante 12 horas cada uno. Una vez que la muestra de cutícula de tomate esté seca, mida la masa y almacénela a temperatura ambiente en un frasco con tapa roscada sellada con parafina. Para preparar la muestra para RMN, coloque de cuatro a seis miligramos de cutículas de tomate completamente desparafinadas, denominadas cutina, en un rotor de circonia de 1,6 milímetros para MAS rápido utilizando la herramienta de empaque suministrada por el fabricante.Después de instalar la tapa superior, pinte la mitad de la tapa con un rotulador de tinta negra para permitir la medición de la velocidad de giro. La configuración inicial del experimento de RMN en estado sólido es un proceso técnicamente exigente y se realiza bajo la supervisión de personal experimentado. Comience ajustando la homogeneidad del campo magnético y optimizando los parámetros experimentales utilizando un compuesto modelo, tal como se describe en el protocolo escrito. Inserte el rotor compacto y colocado en la sonda y luego coloque la sonda dentro del imán.Aumente gradualmente la velocidad de rotación hasta 10 kilohercios para verificar un buen empaquetado de la muestra y la capacidad del rotor para girar de forma estable con una variación inferior a 20 hercios. Ajuste iterativamente los condensadores de sintonización y adaptación de la sonda para lograr una reflexión mínima de potencia en las frecuencias de resonancia magnética nuclear del protón y del carbono 13. Establezca la temperatura experimental en 25 grados Celsius.Inicie el experimento de CPMA preoptimizado correspondiente a la condición de coincidencia de protones y carbono de Hartman-Hahn determinada a una frecuencia de giro de 10 kilohercios. Después de adquirir 4.096 transitorios, condicione el espectro con ensanchamiento exponencial de línea de 50 a 100 hercios y realice una transformada de Fourier para generar un espectro de RMN de intensidad de señal versus desplazamiento químico en partes por millón. Referencie los desplazamientos químicos de carbono-13 como se describe en el texto.Aumente la frecuencia de giro del rotor a 15 kilohercios y repita la medición C-P-M-A-S correspondiente a la condición de ajuste Hartman Han determinada en el análisis del desplazamiento químico por frecuencia de giro escalonada del carbono C-P-M-A-S. Los espectros de resonancia magnética nuclear de carbono-13 identificaron los grupos funcionales principales presentes en la cutícula de tomate cera DW exhaustiva, PHA de cadena larga, PHA oxigenados, múltiples enlaces y compuestos aromáticos, así como los rendimientos de carbono. Los almo oxigenados desempeñan un papel crucial en el establecimiento de conexiones covalentes entre las unidades monoméricas del biopolímero cutina, formando así la arquitectura molecular de la matriz de cutina.Diferencias en las áreas relativas de los picos observadas en la región espectral entre 45 y 100 partes por millón sugieren que la cutina mutante tiene una proporción relativamente mayor de unidades estructurales CHO formadoras de enlaces cruzados en comparación con la cutina del tipo silvestre. Para comenzar el aislamiento selectivo de ceras epicuticulares y cuticulares internas.Lave un segundo lote de tomates enteros con agua destilada. Séquelos con toallas de papel y toallitas Kim y colóquelos con el tallo hacia abajo sobre un trozo de papel de aluminio. Pinte los tomates enteros de arriba hacia abajo con una solución acuosa de goma arábiga al 120%.Deje secar el goma arábiga sobre la piel del fruto durante una hora, dejando una película delgada. Retire esta película usando pinzas, pero evite perforar la piel del tomate. El tratamiento adicional de la película, como se describe en el texto, produce la cera cuticular epi.Los tomates permanecerán físicamente intactos. Súmérjalos en cloroformo durante dos minutos. A temperatura ambiente, la cera intracuticular se puede recolectar después de evaporar el disolvente; pela los tomates y trátelos enzimáticamente con celulasa y pectinato y tampón de acetato de sodio para eliminar la celulosa y la pectina, respectivamente.Se puede realizar entonces una extracción con sali como se describió anteriormente para desparafinar exhaustivamente los tomates. Los experimentos C-P-M-A-S pueden repetirse con muestras de cutícula de frutos naturales y parcialmente desparafinadas como se describe en el texto. La configuración del microscopio de fuerza atómica es un proceso complicado y se logra mejor bajo la supervisión inicial de personal técnico experimentado. Una FM comienza encendiendo el microscopio de sonda de barrido, abreviado SPM, y asegurándose de que el interruptor selector del modo del microscopio esté configurado en el modo de microscopía de fuerza atómica de contacto.A continuación, eleve manualmente la cabeza del MSP girando sus dos perillas frontales ajustables por el usuario. Desconecte un portaconsejo de punta FM de la cabeza del MSP girando el tornillo de sujeción en la parte trasera de la cabeza. Utilice pinzas para retirar el voladizo FM existente de su portaconsejo.Luego, tome cuidadosamente un nuevo cantiléver con punta de nitruro de silicio de su empaque e instálelo en lugar del cantiléver viejo. Utilice un microscopio óptico para verificar que el cantiléver FM recién instalado no esté roto. Sujete la muestra de cutícula de tomate a una placa de muestra mediante cinta adhesiva de doble cara.Utilice un microscopio óptico para verificar que la muestra de cutícula permanezca plana y lisa. Después de colocar la muestra sobre la platina, coloque la muestra de cutícula de tomate, que está unida a la platina, sobre la región magnética en la parte superior del escáner de MSP. Gire los mandos para ajustar los dos tornillos manuales frontales del escáner lo suficientemente alto como para evitar romper la punta de MF-A.Cuando se coloque el portapuntas en la cabeza del microscopio de fuerza atómica (SPM), ajuste el tornillo trasero motorizado a aproximadamente el mismo nivel que los otros dos tornillos frontales. Vuelva a insertar el portapuntas en la cabeza del SPM y fíjelo apretando el tornillo de sujeción trasero de la cabeza. Después de encender el láser, alinee el punto del láser sobre el cantiléver de frecuencia modulada (FM) utilizando los controles central y derecho de ajuste del láser situados en la parte superior de la cabeza.Observe el haz láser reflejado sobre un trozo de papel para posicionar el punto láser exactamente en el extremo de un cantiléver FM. Ajuste la posición del punto láser para lograr la señal de suma máxima. Regule la posición del punto láser reflejado en el detector fotónico ajustando la posición del espejo móvil horizontal y verticalmente, para asegurar que la luz incidente sea recibida de manera uniforme por los cuatro cuadrantes.El detector baja la punta de FM al retraer los tornillos frontales controlados por el usuario y el tornillo trasero motorizado del escáner de MSP. Monitoree visualmente el acercamiento de la punta de FM hacia la superficie de la muestra mediante un microscopio invertido. Asegúrese de que los tres tornillos estén al mismo nivel.Para evitar artefactos al obtener imágenes de una muestra inclinada, acerque la punta a la muestra pero no tanto como para que toque o atraviese la superficie de la muestra. La luz láser reflejada desde el cantiléver de FM rebotará en un espejo móvil hacia un detector fotosensible para el modo de contacto de FM con una sonda de nitruro de silicio. Ajuste el voltaje de la señal de salida a menos dos voltios para un punto de ajuste de cero voltios y la señal diferencial a cero voltios mediante el ajuste de la posición del espejo.Utilizando el software del nano scope. Haga clic en el icono del microscopio y seleccione el perfil adecuado. Mediante el panel de configuraciones de control de escaneo, ajuste la velocidad de escaneo y el tamaño de escaneo.Permita que la punta de FM-A entre en contacto con la superficie de la muestra haciendo clic en el icono de aproximación de la punta. Al controlar el tornillo trasero motorizado de la base del MSP, el programa bajará ahora la punta hasta que haga contacto con la superficie de la muestra. El proceso de escaneo comenzará automáticamente una vez que la punta se haya acoplado con éxito.Supervise el proceso de escaneo utilizando tanto el modo de imagen como el modo de alcance del software; ajuste los parámetros de forma iterativa para obtener imágenes de la máxima resolución, tal como se describe en el protocolo escrito. Por ejemplo, comience el escaneo con un valor elevado de escala de datos en el eje Z. Luego, reduzca cuidadosamente el valor de escala de datos en Z para obtener el mejor contraste de las características superficiales en la imagen.Capture la imagen para guardar el archivo de datos. Procese los datos utilizando funciones de aplanamiento para eliminar artefactos de imagen debidos a la deriva vertical del escáner, curvaturas de la imagen y desplazamiento vertical entre líneas de escaneo. Finalmente, calcule la rugosidad media del carbono.Los espectros de RMN de 13 C-P-M-A-S-N-M mostraron una disminución progresiva del pico de cera a 31 partes por millón, lo que indica la eliminación secuencial de las ceras epi e intracuticulares del compuesto de cutícula y cera, manteniendo al mismo tiempo la arquitectura química principal del biopolímero de cutina en paralelo. Un análisis de imágenes de MF reveló irregularidades superficiales debidas a la extracción escalonada de la cera epicuticular y la cera intracuticular de la cutícula del fruto, lo que señala alteraciones en la organización del ensamblaje cuticular. Una vez dominada esta técnica, la eliminación secuencial de las ceras epi e intracuticulares de las cutículas de frutos de tomate puede realizarse en dos horas.Al realizar la extracción con disolvente para la eliminación exhaustiva de las cutículas de los frutos, es importante utilizar un panel de disolventes de polaridad variable tras emplear el nodo de contacto. Aquí se ilustra un protocolo de MF. Se pueden utilizar experimentos adicionales de MF para medir la elasticidad superficial de la cutícula.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar sistemáticamente componentes del compuesto WAX de cutina y realizar la caracterización molecular y el examen rápido de la superficie de los materiales de cutícula utilizando RM en estado sólido y FM, respectivamente. Las técnicas ilustradas en este video permiten a los investigadores en biología vegetal determinar la composición molecular y la arquitectura supramolecular de tejidos vegetales naturales e ingenierizados.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

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