El aislamiento y estudio biofísico de las cutículas de fruta

Este experimento utiliza técnicas biofísicas para evaluar la capacidad de reticulación del polímero cuticular protector y atractivo del tomate, y para monitorear la eliminación selectiva de ceras epicuticulares e intracuticulares de las cutículas de los frutos. El aislamiento de la cutícula a partir del fruto entero se logra mediante tratamiento enzimático de las pieles de tomate y de las paredes celulares adyacentes. En una segunda etapa, se utiliza extracción con éter para desparafinar exhaustivamente la cutícula del fruto, con el fin de obtener la caracterización molecular de la cutina aislada.

El biopolímero de poliéster se analiza mediante resonancia magnética nuclear en estado sólido. El análisis espectral de RMN en estado sólido revela que en la cutina de cutículas de frutos de tomate de tipo silvestre e ingenierados, existen diferencias en las proporciones relativas de los grupos alifáticos oxigenados capaces de formar enlaces cruzados. Alternativamente, se pinta todo el fruto y se pela con goma arábiga para eliminar las ceras epicuticulares, y luego se sumerge en cloroformo para extraer las ceras intracuticulares de la cutícula del fruto.

Luego, se examinan las cutículas parcialmente desparafinadas, aisladas mediante el mismo tratamiento enzimático que las pieles de tomate, utilizando resonancia magnética nuclear en estado sólido y microscopía de fuerza atómica. En última instancia, la eliminación secuencial de las ceras epicuticulares e intracuticulares es evidente mediante la observación de un pico de cera progresivamente decreciente en los espectros de RMN y alteraciones en el perfil superficial de la cutícula del fruto observadas mediante imágenes simultáneas de microscopía de fuerza atómica. Los órganos aéreos de las plantas están protegidos por un ensamblaje de cera poliéster bio-bio llamado cutícula. Presentaremos protocolos para evaluar la eliminación selectiva de ceras internas y externas de las cutículas de frutos de tomate utilizando resonancia magnética nuclear en estado sólido y microscopía de fuerza atómica.

Estos métodos también pueden utilizarse para evaluar la capacidad de reticulación de materiales cuticulares diseñados. Los procedimientos serán demostrados por tres miembros del grupo Stark: el Dr. Ishish Chatterjee, la candidata al doctorado Shantani Sarkar y la antigua estudiante de secundaria Julia Tik. Un demostrador adicional es la Dra. Olivia Nisau, asociada posdoctoral en el laboratorio de nuestro colega de ingeniería química, el Dr. Alexander S. Para iniciar el aislamiento enzimático de la piel del tomate, coloque tres frutos comerciales o cultivados en un recipiente, retire la piel en secciones grandes y deseche el tejido interno del pericarpio.

Luego lave las pieles de tomate con agua desionizada y consérvelas sumergidas en un vaso de precipitados, inmersa completamente la piel de tomate pelada en un cóctel enzimático preparado como se describe en el protocolo escrito. Incube a 31 grados Celsius durante 24 horas con agitación continua. Recoja las pieles de tomate utilizando un embudo Büchner o un colador de cocina y lávelas con agua desionizada.

Después de colocar las pieles en un horno al vacío a temperatura ambiente durante una hora, las pieles secas pueden almacenarse en un frasco etiquetado y con tapa. Para procedimientos posteriores de desparafinado, llene un tímpano de vidrio centrado o desechable aproximadamente hasta la mitad con la muestra de cutícula de tomate; utilice pinzas para colocarla cuidadosamente en la base de la columna de extracción que se usará en la extracción sólida. Continúe preparando el equipo de extracción sólida utilizando metanol como disolvente, tal como se describe en el protocolo escrito.

Supervise el proceso durante una hora, ajustando el voltaje del variac de modo que el depósito acumule aproximadamente una gota por segundo y se produzca el sifonamiento dentro de los calcetines del aparato. Cuando el cartucho esté lleno, tras una extracción de 12 horas, deje que el aparato se enfríe, luego baje el manto calefactor y retire el extractor y el depósito como una unidad para desechar el disolvente tras la extracción. Incline la columna para permitir el sifonamiento hacia el matraz inferior.

Utilice pinzas para elevar el cartucho hasta justo debajo del cuello de la columna de extracción. Drene el disolvente en exceso y coloque el cartucho sobre una superficie limpia. Desconecte el matraz y vierta el residuo en un recipiente para disolvente etiquetado.

Repita el procedimiento de extracción con disolventes sucesivos de polaridad progresivamente decreciente, como cloroformo y taxano, durante 12 horas cada uno. Una vez que la muestra de cutícula de tomate esté seca, mida la masa y almacénela a temperatura ambiente en un frasco con tapa roscada sellada con parafina. Para preparar la muestra para RMN, coloque de cuatro a seis miligramos de cutículas de tomate completamente desparafinadas, denominadas cutina, en un rotor de circonia de 1,6 milímetros para MAS rápido utilizando la herramienta de empaque suministrada por el fabricante.

Después de instalar la tapa superior, pinte la mitad de la tapa con un rotulador de tinta negra para permitir la medición de la velocidad de giro. La configuración inicial del experimento de RMN en estado sólido es un proceso técnicamente exigente y se realiza bajo la supervisión de personal experimentado. Comience ajustando la homogeneidad del campo magnético y optimizando los parámetros experimentales utilizando un compuesto modelo, tal como se describe en el protocolo escrito. Inserte el rotor compacto y colocado en la sonda y luego coloque la sonda dentro del imán.

Aumente gradualmente la velocidad de rotación hasta 10 kilohercios para verificar un buen empaquetado de la muestra y la capacidad del rotor para girar de forma estable con una variación inferior a 20 hercios. Ajuste iterativamente los condensadores de sintonización y adaptación de la sonda para lograr una reflexión mínima de potencia en las frecuencias de resonancia magnética nuclear del protón y del carbono 13. Establezca la temperatura experimental en 25 grados Celsius.

Inicie el experimento de CPMA preoptimizado correspondiente a la condición de coincidencia de protones y carbono de Hartman-Hahn determinada a una frecuencia de giro de 10 kilohercios. Después de adquirir 4.096 transitorios, condicione el espectro con ensanchamiento exponencial de línea de 50 a 100 hercios y realice una transformada de Fourier para generar un espectro de RMN de intensidad de señal versus desplazamiento químico en partes por millón. Referencie los desplazamientos químicos de carbono-13 como se describe en el texto.

Aumente la frecuencia de giro del rotor a 15 kilohercios y repita la medición C-P-M-A-S correspondiente a la condición de ajuste Hartman Han determinada en el análisis del desplazamiento químico por frecuencia de giro escalonada del carbono C-P-M-A-S. Los espectros de resonancia magnética nuclear de carbono-13 identificaron los grupos funcionales principales presentes en la cutícula de tomate cera DW exhaustiva, PHA de cadena larga, PHA oxigenados, múltiples enlaces y compuestos aromáticos, así como los rendimientos de carbono. Los almo oxigenados desempeñan un papel crucial en el establecimiento de conexiones covalentes entre las unidades monoméricas del biopolímero cutina, formando así la arquitectura molecular de la matriz de cutina.

Diferencias en las áreas relativas de los picos observadas en la región espectral entre 45 y 100 partes por millón sugieren que la cutina mutante tiene una proporción relativamente mayor de unidades estructurales CHO formadoras de enlaces cruzados en comparación con la cutina del tipo silvestre. Para comenzar el aislamiento selectivo de ceras epicuticulares y cuticulares internas.

Lave un segundo lote de tomates enteros con agua destilada. Séquelos con toallas de papel y toallitas Kim y colóquelos con el tallo hacia abajo sobre un trozo de papel de aluminio. Pinte los tomates enteros de arriba hacia abajo con una solución acuosa de goma arábiga al 120%.

Deje secar el goma arábiga sobre la piel del fruto durante una hora, dejando una película delgada. Retire esta película usando pinzas, pero evite perforar la piel del tomate. El tratamiento adicional de la película, como se describe en el texto, produce la cera cuticular epi.

Los tomates permanecerán físicamente intactos. Súmérjalos en cloroformo durante dos minutos. A temperatura ambiente, la cera intracuticular se puede recolectar después de evaporar el disolvente; pela los tomates y trátelos enzimáticamente con celulasa y pectinato y tampón de acetato de sodio para eliminar la celulosa y la pectina, respectivamente.

Se puede realizar entonces una extracción con sali como se describió anteriormente para desparafinar exhaustivamente los tomates. Los experimentos C-P-M-A-S pueden repetirse con muestras de cutícula de frutos naturales y parcialmente desparafinadas como se describe en el texto. La configuración del microscopio de fuerza atómica es un proceso complicado y se logra mejor bajo la supervisión inicial de personal técnico experimentado. Una FM comienza encendiendo el microscopio de sonda de barrido, abreviado SPM, y asegurándose de que el interruptor selector del modo del microscopio esté configurado en el modo de microscopía de fuerza atómica de contacto.

A continuación, eleve manualmente la cabeza del MSP girando sus dos perillas frontales ajustables por el usuario. Desconecte un portaconsejo de punta FM de la cabeza del MSP girando el tornillo de sujeción en la parte trasera de la cabeza. Utilice pinzas para retirar el voladizo FM existente de su portaconsejo.

Luego, tome cuidadosamente un nuevo cantiléver con punta de nitruro de silicio de su empaque e instálelo en lugar del cantiléver viejo. Utilice un microscopio óptico para verificar que el cantiléver FM recién instalado no esté roto. Sujete la muestra de cutícula de tomate a una placa de muestra mediante cinta adhesiva de doble cara.

Utilice un microscopio óptico para verificar que la muestra de cutícula permanezca plana y lisa. Después de colocar la muestra sobre la platina, coloque la muestra de cutícula de tomate, que está unida a la platina, sobre la región magnética en la parte superior del escáner de MSP. Gire los mandos para ajustar los dos tornillos manuales frontales del escáner lo suficientemente alto como para evitar romper la punta de MF-A.

Cuando se coloque el portapuntas en la cabeza del microscopio de fuerza atómica (SPM), ajuste el tornillo trasero motorizado a aproximadamente el mismo nivel que los otros dos tornillos frontales. Vuelva a insertar el portapuntas en la cabeza del SPM y fíjelo apretando el tornillo de sujeción trasero de la cabeza. Después de encender el láser, alinee el punto del láser sobre el cantiléver de frecuencia modulada (FM) utilizando los controles central y derecho de ajuste del láser situados en la parte superior de la cabeza.

Observe el haz láser reflejado sobre un trozo de papel para posicionar el punto láser exactamente en el extremo de un cantiléver FM. Ajuste la posición del punto láser para lograr la señal de suma máxima. Regule la posición del punto láser reflejado en el detector fotónico ajustando la posición del espejo móvil horizontal y verticalmente, para asegurar que la luz incidente sea recibida de manera uniforme por los cuatro cuadrantes.

El detector baja la punta de FM al retraer los tornillos frontales controlados por el usuario y el tornillo trasero motorizado del escáner de MSP. Monitoree visualmente el acercamiento de la punta de FM hacia la superficie de la muestra mediante un microscopio invertido. Asegúrese de que los tres tornillos estén al mismo nivel.

Para evitar artefactos al obtener imágenes de una muestra inclinada, acerque la punta a la muestra pero no tanto como para que toque o atraviese la superficie de la muestra. La luz láser reflejada desde el cantiléver de FM rebotará en un espejo móvil hacia un detector fotosensible para el modo de contacto de FM con una sonda de nitruro de silicio. Ajuste el voltaje de la señal de salida a menos dos voltios para un punto de ajuste de cero voltios y la señal diferencial a cero voltios mediante el ajuste de la posición del espejo.

Utilizando el software del nano scope. Haga clic en el icono del microscopio y seleccione el perfil adecuado. Mediante el panel de configuraciones de control de escaneo, ajuste la velocidad de escaneo y el tamaño de escaneo.

Permita que la punta de FM-A entre en contacto con la superficie de la muestra haciendo clic en el icono de aproximación de la punta. Al controlar el tornillo trasero motorizado de la base del MSP, el programa bajará ahora la punta hasta que haga contacto con la superficie de la muestra. El proceso de escaneo comenzará automáticamente una vez que la punta se haya acoplado con éxito.

Supervise el proceso de escaneo utilizando tanto el modo de imagen como el modo de alcance del software; ajuste los parámetros de forma iterativa para obtener imágenes de la máxima resolución, tal como se describe en el protocolo escrito. Por ejemplo, comience el escaneo con un valor elevado de escala de datos en el eje Z. Luego, reduzca cuidadosamente el valor de escala de datos en Z para obtener el mejor contraste de las características superficiales en la imagen.

Capture la imagen para guardar el archivo de datos. Procese los datos utilizando funciones de aplanamiento para eliminar artefactos de imagen debidos a la deriva vertical del escáner, curvaturas de la imagen y desplazamiento vertical entre líneas de escaneo. Finalmente, calcule la rugosidad media del carbono.

Los espectros de RMN de 13 C-P-M-A-S-N-M mostraron una disminución progresiva del pico de cera a 31 partes por millón, lo que indica la eliminación secuencial de las ceras epi e intracuticulares del compuesto de cutícula y cera, manteniendo al mismo tiempo la arquitectura química principal del biopolímero de cutina en paralelo. Un análisis de imágenes de MF reveló irregularidades superficiales debidas a la extracción escalonada de la cera epicuticular y la cera intracuticular de la cutícula del fruto, lo que señala alteraciones en la organización del ensamblaje cuticular. Una vez dominada esta técnica, la eliminación secuencial de las ceras epi e intracuticulares de las cutículas de frutos de tomate puede realizarse en dos horas.

Al realizar la extracción con disolvente para la eliminación exhaustiva de las cutículas de los frutos, es importante utilizar un panel de disolventes de polaridad variable tras emplear el nodo de contacto. Aquí se ilustra un protocolo de MF. Se pueden utilizar experimentos adicionales de MF para medir la elasticidad superficial de la cutícula.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar sistemáticamente componentes del compuesto WAX de cutina y realizar la caracterización molecular y el examen rápido de la superficie de los materiales de cutícula utilizando RM en estado sólido y FM, respectivamente. Las técnicas ilustradas en este video permiten a los investigadores en biología vegetal determinar la composición molecular y la arquitectura supramolecular de tejidos vegetales naturales e ingenierizados.