Un sistema experimental para estudiar Mecanotransducción en células de pulmón fetal

El objetivo de este procedimiento es describir un sistema experimental para estudiar la transducción mecánica en células pulmonares fetales. Esto se logra codificando placas de cultivo con proteínas de la matriz extracelular. Luego se aíslan células epiteliales tipo II del pulmón fetal de ratón, seguido del aislamiento de fibroblastos fetales de ratón.

El paso final describe un sistema in vitro para proporcionar estimulación mecánica a células pulmonares. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran un aumento en la diferenciación de células de tipo dos mediante PCR en tiempo real, inmunotransferencia western y imágenes de inmunoquímica de fluorescencia. Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo de la transducción mecano, como el desarrollo pulmonar fetal y la lesión pulmonar.

El procedimiento será demostrado por Julian Gu, un técnico de mi laboratorio. Mientras trabajamos en una cabina de flujo laminar bajo condiciones estériles, preparamos 120 microgramos de laminina con 12 mililitros de PBS 1X frío y estéril por placa. Pueden utilizarse otras proteínas de la matriz extracelular para el recubrimiento. Consulte el protocolo escrito para obtener más detalles, luego tome una placa BioFlex sin tratar y agregue dos mililitros de la solución de laminina a cada pocillo para alcanzar una concentración final de dos microgramos por centímetro cuadrado.

Asegúrese de que los pocillos estén completamente cubiertos por la solución. Cubra completamente la placa con una envoltura de plástico y colóquela sobre una superficie plana en un ambiente de cuatro grados Celsius durante la noche para permitir que el laminado se adhiera al fondo de los pocillos. Las placas recubiertas pueden almacenarse en estas condiciones durante al menos una semana, manteniendo una buena función de la MEC al día siguiente.

Bajo condiciones estériles, lave los pocillos tres veces con un XPBS. Luego añada un mililitro de 1 % BSA en un XPBS a cada uno. Incube los pocillos a 37 grados Celsius durante una hora para bloquear los sitios de unión no específicos en las membranas.

A continuación, lave nuevamente los pocillos tres veces con un XPBS. Para eliminar las proteínas no absorbidas, agregue un mililitro de DMEM a cada pocillo de la placa. Luego, almacene la placa a 37 grados Celsius hasta que se aíslen las células epiteliales de tipo II del pulmón de roedor fetal y estén listas para su siembra.

El día anterior al inicio del procedimiento de aislamiento celular, arme las copas con tamices de nailon de 130 y 15 micrones y esterilícelas mediante autoclave. Asimismo, esterilice mediante autoclave el mismo número de picos de vidrio de 150 mililitros el día del cultivo. Obtenga pulmones fetales de ratón preñado controlado entre los días E 17 y 19 de gestación.

Transfiera el tejido a un tubo de centrífuga de 50 mililitros que contenga medio DMEA y colóquelo en hielo. Prepare un tampón de digestión fresco en un tubo de centrífuga de 50 mililitros según la receta del protocolo escrito. Y mientras trabaje en una cabina de flujo laminar, esterilice por filtración mediante un filtro de jeringa de 0,2 micrones.

10 mililitros de este tampón son suficientes para el tejido pulmonar obtenido de aproximadamente 20 fetos de ratón. Coloque el tubo cónico que contiene el tampón de digestión en un baño de agua a 37 grados Celsius. Ase el dium del tubo cónico que contiene el tejido pulmonar fetal y transfiera el tejido a una placa de Petri estéril utilizando tijeras estériles o una cuchilla de afeitar, y pique el tejido en trozos de menos de un milímetro de tamaño.

Luego, transfiera el tejido al tubo cónico que contiene el tampón de digestión precalentado. A continuación, ayude mecánicamente a la digestión del tejido pipeteando la suspensión de células pulmonares fetales arriba y abajo cien veces con pipetas de tamaño de apertura decreciente. Una vez completado el proceso de digestión, centrifugue el homogenizado a 1.300 RPM durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Luego, retire cuidadosamente el sobrenadante por aspiración y resuspenda el sedimento que contiene las células en 15 mililitros de DMEM más 20 %FBS. A continuación, obtenga las mallas con tamaños de 130 y 15 micrones de nylon y colóquelas encima de los vasos de precipitados estériles de 150 mililitros. Pase el homogenado celular a través de la malla de 100 micrones mediante pipeta.

Recolecte el filtrado y pipetee este sobre la malla de 30 micrones. Lave varias veces la malla de 30 micrones con DMEM fresco más 10 % de FBS. La mayoría de las células tipo dos se agrupan y no pasan a través de la malla.

Estos lavados eliminan las células no epiteliales que podrían estar adheridas a los agregados. Aplique el filtrado de la malla de 30 micrones a la copa con malla de 15 micrones. Nuevamente, lave varias veces como antes.

Este paso recluta las células tipo dos que podrían haber pasado a través del filtro de 30 micrones. Recolecte las células agrupadas no filtradas de los filtros de 30 y 15 micrones para un enriquecimiento adicional de células tipo dos. Retenga el filtrado del filtro de 15 micrones si se van a cultivar fibroblastos pulmonares de roedores fetales.

De lo contrario, deseche este filtrado. A continuación, purifique la población de células epiteliales tipo dos añadiendo medio e incubando las células no filtradas provenientes de los tamices de 30 y 15 micrones en un matraz de cultivo tisular de 75 centímetros cuadrados durante 30 minutos. Tras esta incubación, centrifugue el sobrenadante como antes, deseche el sobrenadante, retire el pellet celular y luego resuspenda el pellet en dos mililitros de DMEM libre de suero. Con una pipeta, transfiera un mililitro de la suspensión celular a cada pocillo de las placas BioFlex de seis pocillos recubiertas con laminina. En este punto, las células aparecen en grupos cuando se observan al microscopio. Incube la placa en una incubadora de cultivo tisular ajustada a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono. Una incubación de 24 horas es óptima, y se requiere un mínimo de seis horas de incubación.

Antes de comenzar los experimentos de tensión mecánica, tome el filtrado de la malla de 15 micrones y transfiéralo a un matraz de cultivo de tejidos de 75 centímetros cuadrados a 37 grados Celsius durante 30 a 60 minutos para permitir que los fibroblastos se adhieran, aspire y deseche el medio. Luego, reemplace el volumen en el matraz con DMEM libre de suero e incube durante la noche. Al día siguiente, recoga las células con tripsina al 0,25 % en EDTA 0,4 milimolar y siembre las en placas BioFlex recubiertas con fibronectina; incube en un incubador de cultivo de tejidos ajustado a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono, idealmente durante 24 horas antes de comenzar los experimentos de tensión mecánica.

Se requiere una incubación mínima de seis horas si se necesita una cantidad específica de células para los experimentos. Las células de tipo dos se mantienen en matraces de DMEM sin suero de 75 centímetros cuadrados después del aislamiento, y al día siguiente las células se tripsinizan, se cuentan y luego se siembran. El monocapa no debe tener una confluencia mayor al 80 % antes del inicio de los experimentos. En el día del experimento de estimulación mecánica, el medio de cultivo celular se reemplaza con dos mililitros de DMEM fresco sin suero por pocillo, y luego la placa se monta en una unidad de tensión Flexcell FX 5,000.

A continuación, aplique una deformación biaxial EQU a las membranas. El régimen de deformación varía según la simulación de las fuerzas mecánicas in vivo. Como se discute en el protocolo escrito, las células cultivadas en membranas no estiradas-ST.

Los cultivos paralelos se utilizan como controles para el experimento. Al final del experimento, las monocapas pueden procesarse para analizar los cambios en la expresión génica mediante PCR en tiempo real o los cambios en la abundancia de proteínas mediante inmunotransferencia. Además, las monocapas pueden fijarse para experimentos de inmunoquímica con esta técnica.

Después de la fijación, se recortan membranas asticas de las placas y se montan sobre portaobjetos de vidrio utilizando de 10 a 20 microlitros de agua como agente de montaje antes de la permeabilización y la incubación con anticuerpos. Los datos súper obtenidos del experimento también pueden utilizarse para investigar la presencia de sustancias liberadas, como factores de crecimiento o citoquinas. Esta imagen muestra células epiteliales fetales tipo dos, fijadas con parmal, de día E 18, que fueron aisladas según este protocolo y sembradas en placas BioFlex recubiertas con laminina.

Las células fueron fijadas y se tomó la fotografía. Al día siguiente, las células sin estiramiento no-ST fueron sembradas. La pureza de las células se determinó en un 90 ± 5% mediante análisis microscópico de la morfología de las células epiteliales y tinción inmunológica para la proteína C del surfactante. Las siguientes figuras presentan datos de células epiteliales fetales de tipo II que fueron expuestas a un estrés cíclico del 5% a 40 ciclos por minuto durante 16 horas.

Este análisis Northern blot de la expresión del ARNm de la proteína C del surfactante ilustra que la tensión mecánica induce la diferenciación de células de tipo dos utilizando diferentes sustratos de matriz extracelular. Los signos más y menos representan exposición o ausencia de exposición a la tensión mecánica, respectivamente. Los datos de expresión se presentan en el histograma como media más o menos error estándar de la media (SEM), con N igual a tres, y el asterisco indica un valor P menor a 0,05.

Estas imágenes de inmunofluorescencia muestran los niveles de la proteína C del surfactante en color verde. En células fetales de tipo II no expuestas a tensión mecánica (a la izquierda) y expuestas a tensión mecánica (a la derecha), los núcleos fueron contrasteñados con DAPI, que aparece en azul. Este histograma cuantifica los resultados de inmunotransferencia por tres experimentos, que muestran que el estiramiento mecánico incrementa los niveles de la proteína C del surfactante.

En este experimento, N es igual a tres y el asterisco indica un valor de P inferior a 0,05. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo acelerar células pulmonares fetales y exponerlas a estiramiento mecánico.