Un sistema experimental para estudiar Mecanotransducción en células de pulmón fetal

Las fuerzas mecánicas juegan un papel clave en el desarrollo pulmonar y lesión pulmonar. A continuación, describimos un método para aislar roedores pulmonares fetales células tipo II epiteliales y fibroblastos y exponerlos a la estimulación mecánica mediante un

El objetivo de este procedimiento es describir un sistema experimental para estudiar la transducción mecánica en células pulmonares fetales. Esto se logra codificando placas de cultivo con proteínas de la matriz extracelular. A continuación, se aíslan las células epiteliales de tipo dos del pulmón del ratón fetal, seguidas del aislamiento de los fibroblastos del ratón fetal.

El paso final describe un sistema in vitro para proporcionar estimulación mecánica a las células pulmonares. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran un aumento de la diferenciación de células de tipo dos a través de imágenes de PCR en tiempo real, Western blot e inmunoquímica de fluorescencia. Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo de la transducción mecánica, como el desarrollo pulmonar fetal y la lesión pulmonar.

La demostración del procedimiento estará a cargo de Julian gu, un técnico de mi laboratorio Mientras trabajamos en una campana de flujo laminar en condiciones estériles produce 120 microgramos de laminina con 12 mililitros de estéril en frío un XPBS por placa. Otras proteínas de la matriz extracelular se pueden utilizar para el recubrimiento. Consulte el protocolo escrito para obtener más detalles, luego tome una placa BioFlex sin tratar y agregue dos mililitros de la solución laminada a cada pocillo hasta una concentración final de dos microgramos por centímetro cuadrado.

Asegúrese de que los pozos estén completamente cubiertos por la solución. Cubra completamente la placa con una envoltura de plástico y colóquela sobre una superficie plana en un ambiente de cuatro grados centígrados durante la noche para permitir que el laminado se absorba hasta el fondo de los pocillos. Las placas recubiertas se pueden almacenar en estas condiciones durante al menos una semana mientras conservan un buen funcionamiento de la ECM al día siguiente.

En condiciones estériles, lave los pocillos tres veces con un XPBS. A continuación, añada un mililitro de 1%BSA en un XPBS a cada uno. Incubar bien a 37 grados centígrados durante una hora para bloquear los sitios de unión inespecíficos en las membranas.

Por otra parte, lave los pozos tres veces con un XPBS. Para eliminar las proteínas no absorbidas, agregue un mililitro de DMEM a cada pocillo del plato. A continuación, almacene la placa a 37 grados centígrados hasta que las células epiteliales fetales de tipo pulmón de roedor dos estén aisladas y listas para la colocación en placa.

El día antes de comenzar el procedimiento de aislamiento celular, ensamble las copas de pantalla con mallas de nailon de 130 y 15 micras y esterilícelas en autoclave. También se esteriliza en autoclave el mismo número de picos de vidrio de 150 mililitros el día del cultivo. Obtener pulmones fetales de ratones preñados cronometrados en E 17 a 19 de gestación.

Transfiera el tejido a un tubo de centrífuga de 50 mililitros que contenga medio DMEA y colóquelo en hielo. Prepare un tampón de digestión fresco en un tubo de centrífuga de 50 mililitros de acuerdo con la receta del protocolo escrito. Y mientras trabaja en un filtro de campana de flujo laminar, esterilice a través de un filtro de jeringa de 0,2 micras.

10 mililitros de este tampón son suficientes para el tejido pulmonar obtenido de aproximadamente 20 fetos de ratón. Coloque el tubo cónico que contiene el tampón de digestión en un baño de agua a 37 grados centígrados. Extraer el dium del tubo cónico que contiene el tejido pulmonar fetal y transferir el tejido a una placa de Petri estéril con unas tijeras estériles o una hoja de afeitar, picar el tejido en trozos de menos de un milímetro de tamaño.

A continuación, transfiera el tejido al tubo cónico que contiene el tampón de digestión precalentado. A continuación, ayuda mecánicamente a la digestión del tejido pipeteando la suspensión de células pulmonares fetales hacia arriba y hacia abajo cien veces cada una utilizando pipetas de tamaño de apertura decreciente. Una vez completado el proceso de digestión, centrifugar el homogeneizado a 1.300 RPM durante cinco minutos a temperatura ambiente.

A continuación, retire con cuidado el decúbito supino por aspiración y vuelva a suspender el pellet que contiene las células en 15 mililitros de DMEM más un 20% de FBS. A continuación, recupere los vasos de pantalla con mallas de nailon de 130 y 15 micras y colóquelos encima de los vasos de precipitados estériles de 150 mililitros. Pipetear el homogeneizado celular en la malla de 100 micras.

Recoja el filtrado y plételo en la malla de 30 micras. Lave la malla de 30 micras varias veces con DMEM fresco más 10% FBS. La mayoría de las células de tipo dos se agrupan y no atraviesan la malla.

Estos lavados eliminan las células no epiteliales que pueden estar adheridas a los grupos. Aplique el filtrado de la malla de 30 micras al vaso de malla de 15 micras. De nuevo, lávese varias veces como antes.

Este paso recluta las células de tipo dos que pueden haber pasado a través de la malla de 30 micras. Recoja las células agrupadas no filtradas de las mallas de 30 y 15 micras para un mayor enriquecimiento de células de tipo dos. Retenga el filtrado de la malla de 15 micras si se van a cultivar fibroblastos pulmonares de roedores fetales.

De lo contrario, deseche este filtrado. Más lejos. Purifique la población de células epiteliales de tipo dos agregando medios e incubando las células no filtradas de las tazas de malla de 30 y 15 micras en un matraz de cultivo de tejidos de 75 centímetros cuadrados durante 30 minutos después de esta incubación, centrifugar el súper nombre como antes, despegue las células y luego vuelva a suspender el pellet en dos mililitros de pipeta DMEM pro fetus sin suero un mililitro de la suspensión celular en cada pocillo del laminado recubierto BioFlex placas de seis pocillos en este punto, las células aparecen en grupos cuando se observan bajo el microscopio, incuban la placa en una incubadora de cultivo de tejidos establecida a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Una incubación de 24 horas es óptima y se requiere un mínimo de seis horas de incubación.

Antes de comenzar los experimentos de deformación mecánica, tome el filtrado de la malla de 15 micras y transfiéralo a un matraz de cultivo de tejidos de 75 centímetros cuadrados a 37 grados Celsius durante 30 a 60 minutos para permitir que el fibroblasto se adhiera, aspire y deseche el sate. A continuación, sustituya el volumen del matraz con DMEM sin suero e incube durante la noche. Al día siguiente, recoja las células con 0,25 % de tripsina en EDTA de 0,4 milimolares y colóquelas en placas BioFlex recubiertas de fibronectina e incube en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 grados centígrados y 5 % de dióxido de carbono, idealmente durante 24 horas antes de comenzar los experimentos de deformación mecánica.

Se requiere un mínimo de seis horas de incubación si se requiere un número específico de células para los experimentos. Las células de tipo dos se mantienen en matraces de 75 centímetros cuadrados DMEM libres de suero después del aislamiento, y al día siguiente se cuentan las células tripas inizadas, y luego la monocapa sentada no debe tener más del 80% de confluente antes del inicio de los experimentos. El día del experimento de estimulación mecánica, los medios de cultivo celular se sustituyen por dos mililitros de DMEM libre de suero fresco por pocillo, y la placa se monta en una unidad de deformación flex cell FX 5.000.

A continuación, aplique la tensión biaxial EQU a las membranas. El régimen de deformación varía en función de la simulación de las fuerzas mecánicas in vivo. Como se discutió en el protocolo escrito, las células crecieron en membranas estiradas no ST.

Los cultivados en paralelo se utilizan como controles para el experimento. Al final del experimento, las monocapas se pueden procesar para analizar los cambios en la expresión génica mediante PCR en tiempo real o los cambios en la abundancia de proteínas mediante Western blot. Además, se pueden fijar monocapas para experimentos de inmunoquímica con esta técnica.

Después de la fijación, las membranas ásticas se cortan de las placas y se montan en portaobjetos de vidrio utilizando de 10 a 20 microlitros de agua como agente de montaje antes de la permeación y la incubación con anticuerpos. El superdatina del experimento también se puede utilizar para investigar la presencia de sustancias liberadas, como factores de crecimiento o citoquinas. Esta imagen muestra células epiteliales parmal fijas E 18 fetales tipo dos que fueron aisladas como en este protocolo y plateadas en placas BioFlex codificadas con laminina.

Se fijaron las celdas y se tomó la fotografía. Al día siguiente se colocó la placa con las células de estiramiento no ST. Se determinó que la pureza de las células era de 90 más o menos 5% mediante análisis microscópico de la morfología de las células epiteliales e inmunotinción para la proteína surfactante C. Las siguientes figuras presentan datos de células epiteliales fetales de tipo dos que fueron expuestas a una deformación cíclica del 5% a 40 ciclos por minuto durante 16 horas.

Esta transferencia septentrional de la expresión de ARNm de la proteína C surfactante ilustra que la cepa induce la diferenciación celular de tipo dos utilizando diferentes sustratos de ECM. Los signos más menos representan la exposición a la tensión o la no exposición a la tensión, respectivamente. Los datos de expresión se presentan en el histograma como media más o menos SEM, N igual a tres y el asterisco indica un valor de P inferior a 0,05.

Estas imágenes de inmunoquímica de fluorescencia muestran los niveles de proteína C surfactante en verde. En el tipo fetal, dos células no expuestas a la tensión mecánica en el núcleo izquierdo y expuestas a la tensión mecánica en el núcleo derecho se contratinieron con dapi, que aparece de color azul. Este histograma cuantifica los resultados de Western blot de tres experimentos que muestran que el estiramiento mecánico aumenta los niveles de proteína C surfactante.

En este experimento, N igual a tres y el asterisco indican un valor de P inferior a 0,05. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo acelerar las células pulmonares fetales y exponerlas al estiramiento mecánico.