Name: Un sistema experimental para estudiar Mecanotransducción en células de pulmón fetal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Aprende a estudiar mecanotransducción en células epiteliales tipo II y fibroblastos de pulmón fetal de ratón mediante un sistema in vitro de estimulación mecánica. Este método permite analizar la diferenciación celular por PCR en tiempo real, western blot e inmunofluorescencia.

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Apoyado por el NIH subvención HD052670.

1. El recubrimiento de placas con las proteínas ECM <ol><li> En condiciones estériles, mezclar 120 g de laminina con 12 ml de PBS estéril 1X frío por placa. </li><li> Tomar Bioflex placas sin tratar y añadir 2 ml de la solución a cada pocillo (concentración final de laminina es 2 mg / cm 2). Alternativamente, otras proteínas ECM podrían ser utilizados, tales como colágeno-1 [10 g / cm 2], la fibronectina [5 g / cm 2], vitronectina [0,5 g / cm 2] o elastina [10 g / cm 2]. La técnica de revestimiento es similar a lo que se ha descrito para laminina-recubrimiento. Asegúrese de que los pozos están completamente cubiertas por la solución. </li><li> Envolver las placas con plástico y poner a 4 ° C sobre una superficie plana durante la noche para permitir la laminina para adsorber al fondo de los pocillos. En estas condiciones, las placas pueden ser almacenados por lo menos una semana al tiempo que conserva una buena función ECM. </li><li> Al día siguiente, bajo condiciones estériles, lavar los pocillos 3 veces con PBS 1X. </li><li&gt; Añadir 1 ml de BSA al 1% en PBS 1X a cada pocillo y se incuba a 37 ° C durante 1 hora para no bloquear sitios de unión específicos en las membranas. </li><li> Lavar las placas 3 veces con PBS 1X para eliminar las proteínas no adsorbidas. </li><li> Mantener las placas a 37 ° C en DMEM hasta que las células se aíslan de paso 2,14. </li></ol> 2. Aislamiento de pulmón fetal roedores células de tipo II epiteliales El día antes del aislamiento que las tazas de pantalla con diferentes mallas de nylon de tamaño autoclave y listo. <ol><li> Obtener los pulmones del feto a partir de disolución-embarazada de ratón / rata en la E17-19 de la gestación. Transferir el tejido en un tubo cónico de 50 ml que contenía medio DMEM y lo coloca en hielo. </li><li> Hacer tampón de digestión en un tubo cónico de 50 ml: (10 ml). Para este volumen, el tejido pulmonar de aproximadamente 20 fetos de ratón / rata se utiliza. 8,5 ml de DMEM 0,5 ml de 500 mM de pH 7,4 HEPES 5 mg de colagenasa 1 5 mg de colagenasa 1A 1 ml de suero de pollo, inactivado por calor </li><li>Mezclar bien hasta que todos los componentes se disuelven y el filtro a través de un filtro de 0,2 micras jeringa dentro de la campana estéril. Se coloca el tubo cónico que contenía el tampón de digestión en un baño de agua a 37 ° C. </li><li> Eliminar el medio DMEM del tubo cónico de paso 2,1 y transferir el tejido en una placa de Petri estéril. </li><li> Picar los pulmones bien con tijeras estériles o cuchilla de afeitar para hacer piezas de tejido inferior a 1 mm y transferir el tejido en el tubo cónico que contenía el tampón de digestión pre-calentado desde el paso 2,3. </li><li> Digerir el tejido pipeteando arriba y abajo: 100 veces con 10 ml de pipeta 100 veces con 5 ml de pipeta 100 veces con pipeta Pasteur </li><li> Centrifugar el homogenado a 1300 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Retirar con cuidado el sobrenadante por aspiración y volver a suspender el precipitado que contiene las células en 15 ml de DMEM más FBS al 20%. </li><li> Saca las copas de pantalla con 100 -, 30 - y 15 micras y mallas de nylon º lugarem en estériles de 150 ml vasos. </li><li> Añadir homogenado de células a partir del paso 2.8 y secuencialmente filtrar a través de 100 -, 30 -, y 15 micras tazas de malla. </li><li> Recoge agrupadas sin filtrar las células de los años 30 - y las mallas de 15 micras después de varios lavados con DMEM más FBS al 10% para facilitar la filtración de células no epiteliales. </li><li> Desechar el filtrado de la malla 15-micras que contiene principalmente los fibroblastos. </li><li> Purificar nuevas células de tipo II mediante la incubación de las células de paso 2,11 cm en 75-2 matraces durante 30 min (approximatelly10 ml de suspensión de células por matraz). </li><li> Recoger el sobrenadante y se centrifuga a 1.300 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente para precipitar las células. </li><li> Retire con cuidado el sobrenadante por aspiración y vuelva a suspender el pellet que contiene las células en DMEM libre de suero. El volumen de resuspensión depende de la cantidad de tejido procesado. Aproximadamente, se placa el equivalente de células obtenidas de un feto en cada pocillo (2 ml) a fin de Achivíspera entre 60-70% de confluencia el día siguiente. </li><li> Placa de suspensión de la celda en Bioflex seis placas recubiertas con laminina y fibronectina. </li></ol> 3. Aislamiento de fibroblastos fetales roedores pulmonares <ol><li> Siga los mismos pasos descritos anteriormente para las células de tipo II de aislamiento de hasta 2,11. </li><li> Tomar el filtrado de la malla 15-micrones (sin lavado previo; volumen aproximado es de 10-15 ml) y la placa a 75 cm de 2 a 37 ° C durante 30-60 minutos para permitir que los fibroblastos de adherirse. </li><li> Aspirar el sobrenadante y reemplazar con DMEM libre de suero y se incuba durante la noche. </li><li> Al día siguiente, cosechar las células con 0,25% (peso / volumen) de tripsina en 0,4 mM EDTA y la placa de ellas en placas recubiertas previamente con fibronectina Bioflex. </li></ol> 4. Sistema experimental para proporcionar la estimulación mecánica a las células pulmonares <ol><li> De semillas de las células (alrededor del 50% confluente) en placas de cultivo de Bioflex en DMEM libre de suero (2 ml / pocillo) y dejar que ellos adhieren y SPREanuncio por lo menos durante 6h antes de los experimentos. En general nuestro laboratorio mantiene células en cultivo de alrededor de 24 horas antes de la aplicación de la tensión mecánica. Si un número determinado de células son necesarios para los experimentos, después del aislamiento, las células de tipo II son mantenidos en DMEM libre de suero de 75 cm 2 frascos y al día siguiente, las células se tripsinizaron, se contaron y sembraron entonces. </li><li> Al día siguiente, los medios se sustituyen con fresco DMEM libre de suero (2 ml / pocillo) y las placas Bioflex están montados en una unidad Flexcell FX-5000 Cepa. Monocapas no debe ser mayor del 80% confluentes antes de la iniciación de los experimentos. </li><li> Cepa Equibiaxial se aplica a las membranas. El régimen de deformación varía en función de simulación de fuerzas mecánicas in vivo (véase la discusión). </li><li> Las células cultivadas en no-estirados membranas cultivadas en paralelo se utilizan como controles. </li><li> Al final de los experimentos, las monocapas se pueden procesar para analizar los cambios en la expresión génica (por ejemplo la proteína C surfactante)por la abundancia de proteínas PCR en tiempo real, por Western blot, etc Además, las monocapas se puede fijar para los experimentos de inmunocitoquímica. Para esta técnica, después de la fijación, las membranas de silastic se cortan a partir de las placas y se montaron en portaobjetos de vidrio utilizando 10-20 l de agua como un agente de montaje antes de permeabilización e incubación con anticuerpos. El sobrenadante puede utilizarse también para investigar la presencia de factores de crecimiento, citoquinas, etc </li></ol> 5. Los resultados representativos Figura 1 y Figura 2 muestra representativa de contraste de fase fotografías de fetos de ratón E18 células tipo II aislado utilizando la técnica descrita en este manuscrito. La Figura 3 demuestra que la tensión mecánica induce la diferenciación de las células de tipo II fetales epiteliales utilizando la proteína surfactante-C como un marcador. <img src="/files/ftp_upload/3543/3543fig1.jpg" /> Figura 1. Repsentante de contraste de fase fotografía tomada justo después de aislamiento que muestra el aspecto de los fetos se agruparon las células tipo II. <img src="/files/ftp_upload/3543/3543fig2.jpg" /> Figura 2. E18 fetales células de tipo II epiteliales se aislaron como se describe aquí y chapada en placas recubiertas con Bioflex laminina. La fotografía fue tomada el día siguiente después de no estirado las células fueron fijadas en paraformaldehído. La pureza de las células se determinó que era de 90 ± 5% por análisis microscópico de la morfología de las células epiteliales y inmunotinción para SP-C. <img src="/files/ftp_upload/3543/3543fig3.jpg" /> Figura 3. Fetal las células tipo II epiteliales fueron expuestos a la cepa cíclico de 5% a 40 ciclos por minuto durante 16 horas. Una mancha) del Norte de la proteína surfactante C (SP-C) que muestra que la expresión del ARNm cepa induce la diferenciación de células de tipo II utilizando diferentes sustratos ECM . Signos + / - representan la exposición o no a la sentrenar, respectivamente. Los datos se presentan como media + / - SEM, n = 3; * P &lt;0,05 B) Imágenes de fluorescencia inmunocitoquímica demuestra la SP-C los niveles de proteína (verde) en las células tipo II fetales expuestos o no (control) a una tensión mecánica.. Los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). Bar, 10 m. C) los resultados de Western blot a partir de tres experimentos que demuestran que el estiramiento mecánico aumenta la proteína SP-C. N = 3; * p &lt;0,05.

<ol><li>Sanchez-Esteban, J., Tsai, S. W., Sang, J., Qin, J., Torday, J. S., Rubin, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+mechanical+forces+on+lung-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med.+Sci%22%5BJournal%5D)">Effects of mechanical forces on lung-specific gene expression.</a> Am. J. Med. Sci. 316, 200-204 (1998).</li>
<li>Sanchez-Esteban, J., Cicchiello, L. A., Wang, Y., Tsai, S. W., Williams, L. K., Torday, J. S., Rubin, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stretch+promotes+alveolar+epithelial+type+II+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mechanical stretch promotes alveolar epithelial type II cell differentiation.</a> J. Appl. Physiol. 91, 589-595 (2001).</li>
<li>Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Cicchiello, L. A., Rubin, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+mechanical+stretch+inhibits+cell+proliferation+and+induces+apoptosis+in+fetal+rat+lung+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung.+Cell.+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cyclic mechanical stretch inhibits cell proliferation and induces apoptosis in fetal rat lung fibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 282, L448-L456 (2002).</li>
<li>Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Cicchiello, L. A., Rubin, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+mechanical+stretch+inhibits+cell+proliferation+and+induces+apoptosis+in+fetal+rat+lung+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung.+Cell.+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cyclic mechanical stretch inhibits cell proliferation and induces apoptosis in fetal rat lung fibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 282, L448-L456 (2002).</li>
<li>Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Gruppuso, P. A., Rubin, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stretch+induces+fetal+type+II+cell+differentiation+via+an+epidermal+growth+factor+receptor-extracellular-regulated+protein+kinase+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanical stretch induces fetal type II cell differentiation via an epidermal growth factor receptor-extracellular-regulated protein kinase signaling pathway.</a> Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 30, 76-83 (2004).</li>
<li>Wang, Y., Maciejewski, B. S., Lee, N., Silbert, O., McKnight, N. L., Frangos, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-induced+fetal+type+II+epithelial+cell+differentiation+is+mediated+via+cAMP-PKA-dependent+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung.+Cell.+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Strain-induced fetal type II epithelial cell differentiation is mediated via cAMP-PKA-dependent signaling pathway.</a> Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 291, L820-L827 (2006).</li>
<li>Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Filardo, E. J., Rubin, L. P., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+%7Bbeta%7D1%2C+%7Balpha%7D6%2C+and+%7Balpha%7D3+contribute+to+mechanical+strain-induced+differentiation+of+fetal+lung+type+II+epithelial+cells+via+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung.+Cell.+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Integrins {beta}1, {alpha}6, and {alpha}3 contribute to mechanical strain-induced differentiation of fetal lung type II epithelial cells via distinct mechanisms.</a> Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 290, L343-L350 (2006).</li>
<li>Wang, Y., Maciejewski, B. S., Soto-Reyes, D., Lee, H. S., Warburton, D., Sanchez-Esteban, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stretch+promotes+fetal+type+II+epithelial+cell+differentiation+via+shedding+of+HB-EGF+and+TGF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mechanical stretch promotes fetal type II epithelial cell differentiation via shedding of HB-EGF and TGF-alpha.</a> J. Physiol. 587, 1739-1753 (2009).</li>
<li>Wang, Y., Maciejewski, B. S., Drouillard, D., Santos, M., Hokenson, M. A., Hawwa, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+caveolin-1+in+mechanotransduction+of+fetal+type+II+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung.+Cell.+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A role for caveolin-1 in mechanotransduction of fetal type II epithelial cells.</a> Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 298, L775-L783 (2010).</li>
<li>Lee, H. S., Wang, Y., Maciejewski, B. S., Esho, K., Fulton, C., Sharma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-10+protects+cultured+fetal+rat+type+II+epithelial+cells+from+injury+induced+by+mechanical+stretch%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung.+Cell.+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Interleukin-10 protects cultured fetal rat type II epithelial cells from injury induced by mechanical stretch.</a> Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 294, L225-L232 (2008).</li>
<li>Hawwa, R. L., Hokenson, M. A., Wang, Y., Huang, Z., Sharma, S., Sanchez-Esteban, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-10+inhibits+inflammatory+cytokines+released+by+fetal+mouse+lung+fibroblasts+exposed+to+mechanical+stretch%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Pulmonology%22%5BJournal%5D)">IL-10 inhibits inflammatory cytokines released by fetal mouse lung fibroblasts exposed to mechanical stretch.</a> Pediatric Pulmonology. , (2011).</li>
<li>Kitterman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+mechanical+forces+on+fetal+lung+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Perinatol%22%5BJournal%5D)">The effects of mechanical forces on fetal lung growth.</a> Clin. Perinatol. 23, 727-740 (1996).</li>
<li>Harding, R. Fetal breathing movements. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarding%2C+R+%22The+Lung%3A+Scientific+Fountations%22">The Lung: Scientific Fountations</a>. Crystal, R. G., West, J. B., Banes, P. J. , 2nd Ed, Lippincott-Raven. Philadelphia. 2093-2104 (1997).</li>
<li>Harding, R., Liggins, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+thoracic+dimensions+induced+by+breathing+movements+in+fetal+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Fertil.+Dev%22%5BJournal%5D)">Changes in thoracic dimensions induced by breathing movements in fetal sheep.</a> Reprod. Fertil. Dev. 8, 117-124 (1996).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

En este manuscrito, se describe un método para aislar células tipo II fetales epiteliales y fibroblastos y exponerlos a la estimulación mecánica utilizando el aparato de tensión Flexcell. Hemos utilizado esta técnica para evaluar la diferenciación de las células epiteliales 1,2 y el estudio de los receptores y las vías de señalización activadas por tramo 3-9. Además, este método también se puede utilizar para investigar las respuestas de células inducidas por lesión mecánica 10,11. El pr...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa 1A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9891</td><td></td></tr><tr><td>Suero de pollo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5405</td><td></td></tr><tr><td>Copas de tamizado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CD1-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de jeringa</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-754-25</td><td></td></tr><tr><td>Malla de nailon de 100 micrones</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>CMN-100-D</td><td></td></tr><tr><td>Malla de 30 micrones</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>CMN-30-D</td><td></td></tr><tr><td>Malla de 15 micrones</td><td>Dynamic Aqua-Supply Ltd.</td><td>NTX15</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno-1</td><td>Collagen Biomed</td><td>PC0701</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V-0132</td><td></td></tr><tr><td>Elastina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-6402</td><td></td></tr><tr><td>Placa Bioflex</td><td>Flexcell International</td><td>BF-3001U</td><td>Sin recubrir</td></tr><tr><td>Unidad de tensión Flexcell</td><td>Flexcell International</td><td>FX-5000</td><td></td></tr></tbody></table>

un sistema experimental para estudiar mecanotransducción en células de pulmón fetal

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

Las fuerzas mecánicas generadas en el útero por la repetición como la respiración, los movimientos y por la distensión del fluido son fundamentales para el desarrollo normal de los pulmones. Un componente clave del desarrollo de los pulmones es la diferenciación de las células alveolares de tipo II epiteliales, la principal fuente de surfactante pulmonar. Estas células también participan en la homeostasis de los líquidos en la luz alveolar, la defensa del huésped, y la reparación de lesiones. Además, las células del parénquima pulmonar distal puede estar directamente expuestos a la extensión exagerada durante la ventilación mecánica después del nacimiento. Sin embargo, los mecanismos moleculares y celulares mediante el cual las células pulmonares detectan los estímulos mecánicos para influir en el desarrollo pulmonar y promover la lesión pulmonar no se conocen. Aquí, se proporciona un método simple y de alta pureza para aislar las células de tipo II y fibroblastos de pulmón fetal de roedores. A continuación, se describe un sistema in vitro, la Unidad de tensión Flexcell, para proporcionar la estimulación mecánica de las células fetales, simulando las fuerzas mecánicas deel desarrollo pulmonar fetal o lesión pulmonar. Este sistema experimental constituye una excelente herramienta para investigar los mecanismos moleculares y celulares en las células del pulmón fetal expuestos a estirar. Con este enfoque, nuestro laboratorio ha identificado varios receptores y las proteínas de señalización que participan en mecanotransducción en el desarrollo pulmonar fetal y la lesión pulmonar.

Las fuerzas mecánicas juegan un papel clave en el desarrollo pulmonar y lesión pulmonar. A continuación, describimos un método para aislar roedores pulmonares fetales células tipo II epiteliales y fibroblastos y exponerlos a la estimulación mecánica mediante un<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema.

Un sistema experimental para estudiar Mecanotransducción en células de pulmón fetal

Las fuerzas mecánicas generadas in utero por los movimientos repetitivos similares a la respiración y por la distensión fluida son fundamentales para el desarrollo pulmonar normal. Un elemento clave...

El objetivo de este procedimiento es describir un sistema experimental para estudiar la transducción mecánica en células pulmonares fetales. Esto se logra codificando placas de cultivo con proteínas de la matriz extracelular. Luego se aíslan células epiteliales tipo II del pulmón fetal de ratón, seguido del aislamiento de fibroblastos fetales de ratón.El paso final describe un sistema in vitro para proporcionar estimulación mecánica a células pulmonares. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran un aumento en la diferenciación de células de tipo dos mediante PCR en tiempo real, inmunotransferencia western y imágenes de inmunoquímica de fluorescencia. Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo de la transducción mecano, como el desarrollo pulmonar fetal y la lesión pulmonar.El procedimiento será demostrado por Julian Gu, un técnico de mi laboratorio. Mientras trabajamos en una cabina de flujo laminar bajo condiciones estériles, preparamos 120 microgramos de laminina con 12 mililitros de PBS 1X frío y estéril por placa. Pueden utilizarse otras proteínas de la matriz extracelular para el recubrimiento. Consulte el protocolo escrito para obtener más detalles, luego tome una placa BioFlex sin tratar y agregue dos mililitros de la solución de laminina a cada pocillo para alcanzar una concentración final de dos microgramos por centímetro cuadrado.Asegúrese de que los pocillos estén completamente cubiertos por la solución. Cubra completamente la placa con una envoltura de plástico y colóquela sobre una superficie plana en un ambiente de cuatro grados Celsius durante la noche para permitir que el laminado se adhiera al fondo de los pocillos. Las placas recubiertas pueden almacenarse en estas condiciones durante al menos una semana, manteniendo una buena función de la MEC al día siguiente.Bajo condiciones estériles, lave los pocillos tres veces con un XPBS. Luego añada un mililitro de 1 % BSA en un XPBS a cada uno. Incube los pocillos a 37 grados Celsius durante una hora para bloquear los sitios de unión no específicos en las membranas.A continuación, lave nuevamente los pocillos tres veces con un XPBS. Para eliminar las proteínas no absorbidas, agregue un mililitro de DMEM a cada pocillo de la placa. Luego, almacene la placa a 37 grados Celsius hasta que se aíslen las células epiteliales de tipo II del pulmón de roedor fetal y estén listas para su siembra.El día anterior al inicio del procedimiento de aislamiento celular, arme las copas con tamices de nailon de 130 y 15 micrones y esterilícelas mediante autoclave. Asimismo, esterilice mediante autoclave el mismo número de picos de vidrio de 150 mililitros el día del cultivo. Obtenga pulmones fetales de ratón preñado controlado entre los días E 17 y 19 de gestación.Transfiera el tejido a un tubo de centrífuga de 50 mililitros que contenga medio DMEA y colóquelo en hielo. Prepare un tampón de digestión fresco en un tubo de centrífuga de 50 mililitros según la receta del protocolo escrito. Y mientras trabaje en una cabina de flujo laminar, esterilice por filtración mediante un filtro de jeringa de 0,2 micrones.10 mililitros de este tampón son suficientes para el tejido pulmonar obtenido de aproximadamente 20 fetos de ratón. Coloque el tubo cónico que contiene el tampón de digestión en un baño de agua a 37 grados Celsius. Ase el dium del tubo cónico que contiene el tejido pulmonar fetal y transfiera el tejido a una placa de Petri estéril utilizando tijeras estériles o una cuchilla de afeitar, y pique el tejido en trozos de menos de un milímetro de tamaño.Luego, transfiera el tejido al tubo cónico que contiene el tampón de digestión precalentado. A continuación, ayude mecánicamente a la digestión del tejido pipeteando la suspensión de células pulmonares fetales arriba y abajo cien veces con pipetas de tamaño de apertura decreciente. Una vez completado el proceso de digestión, centrifugue el homogenizado a 1.300 RPM durante cinco minutos a temperatura ambiente.Luego, retire cuidadosamente el sobrenadante por aspiración y resuspenda el sedimento que contiene las células en 15 mililitros de DMEM más 20 %FBS. A continuación, obtenga las mallas con tamaños de 130 y 15 micrones de nylon y colóquelas encima de los vasos de precipitados estériles de 150 mililitros. Pase el homogenado celular a través de la malla de 100 micrones mediante pipeta.Recolecte el filtrado y pipetee este sobre la malla de 30 micrones. Lave varias veces la malla de 30 micrones con DMEM fresco más 10 % de FBS. La mayoría de las células tipo dos se agrupan y no pasan a través de la malla.Estos lavados eliminan las células no epiteliales que podrían estar adheridas a los agregados. Aplique el filtrado de la malla de 30 micrones a la copa con malla de 15 micrones. Nuevamente, lave varias veces como antes.Este paso recluta las células tipo dos que podrían haber pasado a través del filtro de 30 micrones. Recolecte las células agrupadas no filtradas de los filtros de 30 y 15 micrones para un enriquecimiento adicional de células tipo dos. Retenga el filtrado del filtro de 15 micrones si se van a cultivar fibroblastos pulmonares de roedores fetales.De lo contrario, deseche este filtrado. A continuación, purifique la población de células epiteliales tipo dos añadiendo medio e incubando las células no filtradas provenientes de los tamices de 30 y 15 micrones en un matraz de cultivo tisular de 75 centímetros cuadrados durante 30 minutos. Tras esta incubación, centrifugue el sobrenadante como antes, deseche el sobrenadante, retire el pellet celular y luego resuspenda el pellet en dos mililitros de DMEM libre de suero. Con una pipeta, transfiera un mililitro de la suspensión celular a cada pocillo de las placas BioFlex de seis pocillos recubiertas con laminina. En este punto, las células aparecen en grupos cuando se observan al microscopio. Incube la placa en una incubadora de cultivo tisular ajustada a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono. Una incubación de 24 horas es óptima, y se requiere un mínimo de seis horas de incubación.Antes de comenzar los experimentos de tensión mecánica, tome el filtrado de la malla de 15 micrones y transfiéralo a un matraz de cultivo de tejidos de 75 centímetros cuadrados a 37 grados Celsius durante 30 a 60 minutos para permitir que los fibroblastos se adhieran, aspire y deseche el medio. Luego, reemplace el volumen en el matraz con DMEM libre de suero e incube durante la noche. Al día siguiente, recoga las células con tripsina al 0,25 % en EDTA 0,4 milimolar y siembre las en placas BioFlex recubiertas con fibronectina; incube en un incubador de cultivo de tejidos ajustado a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono, idealmente durante 24 horas antes de comenzar los experimentos de tensión mecánica.Se requiere una incubación mínima de seis horas si se necesita una cantidad específica de células para los experimentos. Las células de tipo dos se mantienen en matraces de DMEM sin suero de 75 centímetros cuadrados después del aislamiento, y al día siguiente las células se tripsinizan, se cuentan y luego se siembran. El monocapa no debe tener una confluencia mayor al 80 % antes del inicio de los experimentos. En el día del experimento de estimulación mecánica, el medio de cultivo celular se reemplaza con dos mililitros de DMEM fresco sin suero por pocillo, y luego la placa se monta en una unidad de tensión Flexcell FX 5,000.A continuación, aplique una deformación biaxial EQU a las membranas. El régimen de deformación varía según la simulación de las fuerzas mecánicas in vivo. Como se discute en el protocolo escrito, las células cultivadas en membranas no estiradas-ST.Los cultivos paralelos se utilizan como controles para el experimento. Al final del experimento, las monocapas pueden procesarse para analizar los cambios en la expresión génica mediante PCR en tiempo real o los cambios en la abundancia de proteínas mediante inmunotransferencia. Además, las monocapas pueden fijarse para experimentos de inmunoquímica con esta técnica.Después de la fijación, se recortan membranas asticas de las placas y se montan sobre portaobjetos de vidrio utilizando de 10 a 20 microlitros de agua como agente de montaje antes de la permeabilización y la incubación con anticuerpos. Los datos súper obtenidos del experimento también pueden utilizarse para investigar la presencia de sustancias liberadas, como factores de crecimiento o citoquinas. Esta imagen muestra células epiteliales fetales tipo dos, fijadas con parmal, de día E 18, que fueron aisladas según este protocolo y sembradas en placas BioFlex recubiertas con laminina.Las células fueron fijadas y se tomó la fotografía. Al día siguiente, las células sin estiramiento no-ST fueron sembradas. La pureza de las células se determinó en un 90 ± 5% mediante análisis microscópico de la morfología de las células epiteliales y tinción inmunológica para la proteína C del surfactante. Las siguientes figuras presentan datos de células epiteliales fetales de tipo II que fueron expuestas a un estrés cíclico del 5% a 40 ciclos por minuto durante 16 horas.Este análisis Northern blot de la expresión del ARNm de la proteína C del surfactante ilustra que la tensión mecánica induce la diferenciación de células de tipo dos utilizando diferentes sustratos de matriz extracelular. Los signos más y menos representan exposición o ausencia de exposición a la tensión mecánica, respectivamente. Los datos de expresión se presentan en el histograma como media más o menos error estándar de la media (SEM), con N igual a tres, y el asterisco indica un valor P menor a 0,05.Estas imágenes de inmunofluorescencia muestran los niveles de la proteína C del surfactante en color verde. En células fetales de tipo II no expuestas a tensión mecánica (a la izquierda) y expuestas a tensión mecánica (a la derecha), los núcleos fueron contrasteñados con DAPI, que aparece en azul. Este histograma cuantifica los resultados de inmunotransferencia por tres experimentos, que muestran que el estiramiento mecánico incrementa los niveles de la proteína C del surfactante.En este experimento, N es igual a tres y el asterisco indica un valor de P inferior a 0,05. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo acelerar células pulmonares fetales y exponerlas a estiramiento mecánico.

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