Modificado levadura sistema híbrido de dos para identificar proteínas que interactúan con el factor de crecimiento progranulina
17 de enero de 2012
Hemos modificado la levadura de dos híbridos convencionales de detección, una herramienta eficaz en la identificación genética interacción de proteínas. Esta modificación notable acorta el proceso, reduce la carga de trabajo, y lo más importante, reduce el número de falsos positivos. Además, este método es reproducible y confiable.
Este sistema MY dos H mejora el protocolo convencional de dos híbridos en levadura al reducir notablemente el número de falsos positivos. Primero, prepare una transformación a pequeña escala del plásmido cebo en levadura. Después de validar el constructo cebo mediante una pantalla con inhibidor competitivo, analice la biblioteca de ADNc en placas menos cuatro.
Proceda a verificar los clones positivos mediante ensayos de XGL y reacción. Luego identifique las proteínas interaccionantes potenciales mediante secuenciación de ADN y análisis bioinformáticos. En última instancia, este sistema modificado de doble híbrido en levadura aumenta significativamente la eficacia y el éxito del proceso de cribado.
El sistema convencional de doble híbrido en levadura es notorio por generar falsos positivos. Este mensaje muestra el procedimiento de cribado modificado que mejora significativamente la detección de interacciones específicas. Así que comencemos.
Inocule 50 mililitros de YPD con un cultivo nocturno de cinco mililitros de MAV 2 0 3. Incube de dos a cuatro horas a 30 grados Celsius. Luego, recolecte la levadura por centrifugación, después de un lavado resuspenda los pellet en dos mililitros de solución uno e incube a temperatura ambiente durante 10 minutos.
Preparar la mezcla de ADN para la transformación. Añadir 100 microlitros de células de levadura y mezclar bien. Luego añadir 700 microlitros de la solución dos y mezclar bien.
Primero incubar a 30 grados Celsius durante 30 minutos y luego aplicar choque térmico. Ahora, cosechar las células por centrifugación y resuspender el precipitado en 200 microlitros de agua destilada esterilizada en autoclave. Extender diluciones seriadas de la suspensión sobre placas SD LU e incubar a 30 grados Celsius durante dos o tres días. Este paso confirma que el plásmido cebo activa la transcripción y que esta autoactivación puede ser neutralizada por inhibidores como tres, un inhibidor competitivo del producto del gen hiss tres.
Primero, transforme el plásmido cebo en levadura MAV 2 0 3. Extienda la reacción sobre placas SD LU e incube a 30 grados Celsius. Con el fin de seleccionar colonias para tres en activación autoinducida, utilice palillos de dientes autoclavados para transferir colonias de cada transformación a placas SD LU hiss que contengan concentraciones crecientes de tres; incube las placas a 30 grados Celsius.
Elimine las cepas reclamo que crecen en placas que contienen 100 milimolares de tres en tanto que no son adecuadas para su uso en la pantalla de híbrido dual para re. Para los reclamos restantes, seleccione la concentración más baja de tres en que inhiba el crecimiento celular para su uso en el cribado de la biblioteca de ADNc, suspenda varias colonias aisladas de levadura que contengan el plásmido reclamo en 100 microlitros de agua destilada autoclavada. Dispérselas sobre dos placas SD LU de 10 centímetros.
Incube ambas placas a 30 grados Celsius. Raspe y suspenda completamente las células en 10 mililitros. Autoclave agua destilada e inocule 500 mililitros de medio YPD líquido.
Verifique la densidad celular mediante espectrofotometría y cultivo a 30 grados Celsius. Proceda a la recolección de las células por centrifugación. Lave una vez con 100 mililitros de agua destilada autoclaveada y una vez con 50 mililitros de la solución uno.
Luego, re suspenda el precipitado en 2,5 mililitros de la solución uno. Ahora agregue ADN de esperma de salmón desnaturalizado y fragmentado, y también la biblioteca de ADN CD mezclada suavemente mediante pipeteo. A continuación, agregue 15 mililitros de la solución dos que contiene 40 % de polietilenglicol.
Mezcle suavemente y distribuya alícuotas de 700 microlitros en 25 tubos de microcentrífuga esterilizados en autoclave de 1,5 mililitros. Incube durante 30 minutos en un baño de agua a 30 grados Celsius, seguido de un choque térmico de 15 minutos en un baño de agua a 42 grados Celsius.
Recoger las células por centrifugación y resuspender suavemente cada pellet en 400 microlitros de agua destilada autoclaveada. Sembrar cada mezcla de transformación en dos placas de selección e incubar de cinco a 10 días a 30 grados Celsius como control para estimar la eficiencia de transformación de la placa de reacción. Diluciones seriadas de una reacción.
Después de incubar durante tres días a 30 grados Celsius, determine el número de colonias totales. Transfiera las colonias a una placa YPD e incube a 30 grados Celsius durante la noche. Luego, coloque una membrana de nitrocelulosa redondeada directamente sobre la placa YPD, asegurándose de que no queden burbujas de aire.
Después de un minuto, verifique que todas las colonias se hayan transferido a las membranas. Coloque la membrana con el lado de las colonias hacia arriba en un recipiente de aluminio y colóquelo sobre la superficie del nitrógeno líquido durante 20 segundos. Luego, sumérjala en el nitrógeno líquido durante unos minutos.
Ahora retire la membrana para descongelarla. Mientras tanto, prepare una placa de Petri con una capa fresca de solución XCA sobre papel Aman. Luego, sumerja cuidadosamente la membrana descongelada e incube a 37 grados Celsius.
Hasta que aparezcan colonias azules. La transformación de las presas, los clones y el constructo de cebo en levadura puede eliminar además falsos positivos. Primero, aísle el ADN plasmídico de las cepas de levadura que potencialmente contengan proteínas interaccionantes.
Transforme el ADN en E. coli DH5α y seleccione mediante crecimiento en placas de LB con ampicilina. Tamice los transformantes mediante análisis con enzimas de restricción. Ahora, cotransformar los plásmidos de presa y señuelo en levadura MAV203, sembrar en placas SC-LU-trip y incubar de dos a tres días a 30 grados Celsius.
Seleccione tres colonias diferentes para realizar la secuencia del ensayo xal, el ADN plasmídico de los clones positivos e identificar genes utilizando bioinformática. En este experimento, el factor de crecimiento Rine progranulina se utilizó como cebo para tamizar una biblioteca de ADNc cerebral, obteniendo 54 clones positivos.
Los candidatos se aislaron entre 2,5 millones. Transformantes seleccionados con el cebo de progranulina. Análisis posteriores mediante el ensayo ex skull indicaron 23 candidatos positivos para el cebo de progranulina.
Curiosamente, los análisis bioinformáticos de los datos de secuenciación identificaron TNF R dos. De hecho, experimentos funcionales adicionales confirmaron la progranulina como un nuevo ligando de los receptores TT NF. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo realizar esta pantalla híbrida modificada con tu base de interés.
No olvide trabajar con guantes, ya que algunas de las regiones utilizadas son peligrosas. Buena suerte con sus experimentos.
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Descripción general
Este estudio presenta un sistema modificado de doble híbrido en levadura que mejora el protocolo convencional para identificar interacciones proteicas. El nuevo enfoque reduce significativamente los falsos positivos y mejora la fiabilidad de los resultados.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Interacciones proteicas
- Tamizaje genético
- Sistema de levadura bifactorial
Antecedentes
- El sistema de dos híbridos en levadura es un método ampliamente utilizado para estudiar interacciones entre proteínas.
- Los métodos convencionales a menudo producen un alto número de falsos positivos.
- Mejorar la precisión de estos análisis es fundamental para obtener conclusiones biológicas confiables.
- Este estudio tiene como objetivo abordar estos problemas mediante modificaciones metodológicas.
Objetivo del estudio
- Modificar el protocolo del sistema de dos híbridos en levadura para mejorar la precisión.
- Reducir la carga de trabajo y el tiempo requerido para los cribados.
- Proporcionar un método reproducible y confiable para identificar interacciones proteicas.
Métodos Utilizados
- Preparación de una transformación a pequeña escala del plásmido cebo en levadura.
- Validación del constructo cebo mediante una prueba con inhibidor competitivo.
- Tamizaje de la biblioteca de ADNc en placas menos cuatro.
- Verificación de los clones positivos mediante ensayos con XGL y reacciones.
Resultados principales
- El sistema modificado reduce significativamente el número de falsos positivos.
- Se observó una mayor eficacia y éxito en el proceso de cribado.
- Se identificaron proteínas interactivas potenciales mediante secuenciación de ADN.
- El análisis de bioinformática respaldó los hallazgos.
Conclusiones
- El sistema modificado de doble híbrido en levadura es una herramienta confiable para estudios de interacción proteica.
- Este enfoque mejora la eficiencia general de los cribados genéticos.
- Las aplicaciones futuras podrían beneficiarse de las tasas reducidas de falsos positivos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La cartografía de interacciones proteicas en fase de descubrimiento es fundamental para la validación de dianas y la reducción del riesgo mecanicista en la I+D de biofármacos&D. El sistema de levadura bifactorial modificado (MY2H) permite una identificación más confiable de las proteínas asociadas, reduciendo los falsos positivos y acelerando los hallazgos aplicables. Este enfoque fortalece la confianza predictiva en los puntos críticos de nominación del blanco y de identificación temprana de candidatos promisorios.
Aplicaciones Estratégicas en Biofármacos R&D
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación sistemática de interacciones proteína-proteína para la validación funcional de objetivos.
- Reduce la ambigüedad mecanicista al minimizar los falsos positivos en los cribados de interacciones.
- Apoya la triage confiable de objetivos basada en socios de unión validados.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Prepara constructos de cebo validados para flujos de trabajo de cribado posteriores.
- Mejora la reproducibilidad y fiabilidad del ensayo mediante controles con inhibidores competitivos.
- Facilita el cribado escalable de bibliotecas de ADN complementario para el descubrimiento de interacciones.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Alinea los hallazgos de interacciones proteicas con vías relevantes para la enfermedad cuando la selección del cebo está vinculada a la enfermedad.
- Permite la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante la identificación de socios proteicos accionables.
- Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo basadas en datos sólidos de interacción.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El sistema MY2H se sitúa en la interfaz entre el descubrimiento inicial y la identificación de compuestos activos, proporcionando una plataforma reproducible para mapear interacciones proteicas antes de los estudios funcionales posteriores.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al identificar interactores directos de factores de crecimiento o proteínas relevantes para enfermedades.
- Selección: Proporciona resultados validados y con baja tasa de falsos positivos, adecuados para ensayos bioquímicos o celulares posteriores.
- Análisis: Ofrece recuentos cuantitativos de colonias y aciertos verificados por secuenciación para análisis comparativo.
- Investigación Traducional: Conecta los datos de interacción con modelos de enfermedades cuando las proteínas cebo están implicadas en patologías.
- Reutilización Empresarial: Ofrece un flujo de trabajo estandarizado y reproducible, adaptable a diversos objetivos proteicos en múltiples portafolios.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la incertidumbre mecanicista en la validación de objetivos.
- Valor operativo: Mejora la estandarización, la reproducibilidad y el rendimiento de los cribados de interacciones proteicas.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones más informadas de avanzar/no avanzar y una gestión eficiente del portafolio en términos de capital.
- Impacto en el portafolio: Apoya la priorización ajustada al riesgo y el avance de objetivos validados.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en genética de levaduras, clonación molecular y análisis de bioinformática.
- Necesita acceso a equipos de transformación, medios selectivos e infraestructura de secuenciación.
- Exige estandarización entre equipos en la validación del cebo y los controles de inhibidores.
- Adaptable a diversas proteínas cebo, aunque puede requerir optimización para constructos específicos.
- La reducción de falsos positivos depende de pasos rigurosos de control y validación.
