Aislamiento de células dendríticas del pulmón de ratón

El objetivo general de este procedimiento es obtener una preparación altamente purificada de células dendríticas de pulmón de ratón. Esto se logra primero recolectando el tejido pulmonar sin incluir los ganglios linfáticos drenantes. Luego, se obtiene una suspensión de células individuales mediante digestión con colagenasa.

El siguiente paso consiste en enriquecer las células positivas para CD11C utilizando un sistema de aislamiento magnético de células. Ahora, el subconjunto de células dendríticas convencionales se aísla mediante clasificación celular por citometría de flujo. En última instancia, las células dendríticas convencionales aisladas del tejido pulmonar de ratón pueden analizarse mediante citometría de flujo y microscopía óptica.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología, como cuál es la participación del subconjunto de células dendríticas convencionales en la inmunidad innata y las enfermedades infecciosas del tracto respiratorio. El procedimiento será demostrado por Issa Lancelin, un asociado de investigación de mi laboratorio, y por mí mismo. Después de sacrificar al ratón, comience cortando y luego retirando suavemente la piel externa del peritoneo para exponer la cavidad torácica.

Proceda a abrir el diafragma cortando la caja torácica para exponer el corazón y los pulmones. Una vez expuestos el corazón y los pulmones, puede comenzar el procedimiento de perfusión. Llene una jeringa de cinco mililitros con E-D-T-A-H-B-S-S y conecte una aguja de calibre 25 a la jeringa.

Luego, inserte la aguja en el ventrículo derecho para evitar fugas durante la inyección. Utilice pinzas para sujetar el tejido miocárdico alrededor de la aguja. A continuación, inyecte suavemente la solución manteniendo una presión constante.

Una perfusión precisa dará como resultado la inflación pulmonar y un cambio de color a rosa o blanco; para evitar una posible contaminación, retire y deseche los ganglios linfáticos drenantes. A continuación, recoja el tejido pulmonar, transfiriendo el órgano extirpado a una placa de Petri sobre hielo. Llene un tubo gentle max C con cinco mililitros de solución de digestión con colagenasa para pulmón y luego corte el pulmón en trozos pequeños.

Utilizando una hoja de afeitar, transfiera el tejido al tubo mediante una disociación máxima suave. Para obtener una suspensión de células individuales, seleccione el programa M lung zero one. A continuación, incube la muestra a 37 grados Celsius durante 30 minutos, agitando el tubo cada cinco minutos para resuspender los fragmentos de tejido F, y continúe con el programa M lung zero two.

Ahora transfiera la muestra a un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugue las células durante 10 minutos a 335 ×g a cuatro grados Celsius. Descarte el sobrenadante y agregue dos mililitros de un tampón de lisis CK al precipitado durante un minuto a temperatura ambiente para lisar los glóbulos rojos restantes. Luego lave las células con 13 mililitros de PBS frío suplementado con 0,5 % BSA.

Después de desechar el sobrenadante, volver a suspender este sedimento en cinco mililitros de PBS frío más BSA y luego pasar la solución celular a través de una malla de nailon de 100 micrómetros. Finalmente, determinar el número total de células mediante exclusión con azul de trian. En lugar de usar una disociación suave máxima, llenar un tubo cónico de 15 mililitros con cinco mililitros de solución de colagenasa por pulmón.

Agregue el tejido pulmonar picado al tubo e incube el tejido pulmonar durante una hora a 37 grados Celsius. Vortexee las células cada 15 minutos para re-suspender los fragmentos de tejido. Luego, rompa el tejido digerido pasando la muestra de seis a ocho veces a través de una jeringa de tres mililitros conectada a una aguja de calibre 20.

Evite formar burbujas durante el proceso. Primero, lave la suspensión de células individuales durante 10 minutos a 200 veces G a cuatro grados Celsius y deseche el sobrenadante. Luego, re suspenda las células en 400 microlitros de tampón de separación.

Incube el bloque de células totales con anticuerpos anti-CD16/32 para bloquear la unión inespecífica mediada por FC, utilizando 0,5 microgramos de anticuerpo anti-CD16/32 por cada 10⁸ células, durante 30 minutos a cuatro grados Celsius. Después de lavar las células con 10 mililitros de tampón de separación frío, resuspenda las células en 400 microlitros adicionales de tampón de separación. A continuación, añada 100 microlitros de microperlas CD11c, añada hasta un total de 10⁸ células, mezcle bien e incube la solución de células y perlas durante 15 minutos en el refrigerador.

Después de eliminar las perlas no unidas con 10 mililitros de tampón de separación frío, deseche el sobrenadante y resuspenda el botón celular en un mililitro de tampón de separación frío. Finalmente, cargue las muestras en el separador AutoMax pro y ejecute el programa P-O-S-S-E-L-D. Para recoger la fracción de células que expresan CD 11 C.

Incube la suspensión de células positivas para CD11c enriquecidas con anticuerpo anti-CD11c PEI siete y anticuerpos dirigidos contra las moléculas de Clase II del MHC presentes en estas células durante 30 minutos a cuatro grados Celsius. Después de lavar las células con PBS frío más BSA, re suspenda las células en 0.5 mililitros de PBS más BSA y páselas a través de un filtro de malla de nailon de 40 micrómetros. Finalmente, agregue las células positivas para CD11c purificadas a un tubo FACS para su cuantificación posterior en tubos en blanco separados.

Añada 100 microlitros de PBS más BSA a tubos de recolección de cinco mililitros para prevenir daños en las células purificadas y clasifique la suspensión celular filtrada mediante citometría; mantenga las células recolectadas a temperatura refrigerada durante todo el proceso de clasificación celular. En estos gráficos de densidad, hay más del triple de células dendríticas convencionales en el bazo que en el pulmón. Además, en el pulmón, las células positivas para CD11c incluyen una población celular que no corresponde a células dendríticas convencionales, representada por el grupo de eventos con bajo nivel de MHC clase II fuera de la compuerta de células dendríticas convencionales.

En el lado izquierdo de la figura, como se observa en este gráfico de densidad, la separación magnética de las células pulmonares totales aumenta el número de células dendríticas convencionales desde aproximadamente el 1,5 % de las células totales hasta aproximadamente el 16,5 %. Sin embargo, los macrófagos CD11C positivos y de baja expresión de MHC clase II aún constituyen más del 70 % de la población celular total, contaminando significativamente la pureza del subconjunto enriquecido de células dendríticas convencionales pulmonares en esta etapa del proceso de aislamiento. No obstante, la clasificación por FACS mejora la pureza de las células dendríticas convencionales a más del 96 %, como se observa en la microfotografía superior derecha. Las células dendríticas convencionales CD11C alto y MHC clase II alto son células redondeadas que presentan las dendritas típicas, mientras que las células CD11C alto y MHC clase II bajo, observadas en la microfotografía inferior derecha, exhiben protuberancias celulares más características de la morfología de los macrófagos.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar manipular el tejido pulmonar y la preparación de células individuales a las temperaturas indicadas. Esto es fundamental para preservar la viabilidad celular y el rendimiento de células dendríticas convencionales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar subpoblaciones de células dendríticas del pulmón de ratón.

El aislamiento de subpoblaciones de células dendríticas pulmonares representa una herramienta muy útil para comprender las funciones de estas células frente a patógenos respiratorios y factores ambientales que pueden desencadenar la respuesta inmunitaria del huésped en el pulmón.