Name: La translocación de péptidos en la medición de grandes vesículas unilamelares (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Aprende a cuantificar la translocación de péptidos en vesículas lipídicas unilamelares grandes usando FRET y tripsina. Este método permite analizar la cinética de entrada en membranas y evaluar eficiencia de péptidos.

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Los autores desean agradecer a Leonor Fleming y Chen Jessica útil para los debates. El financiamiento fue proporcionado por el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (NIH-NIAID) y un Premio R15AI079685 Research Corporation Cottrell Premio Facultad de Ciencias. Apoyo a los estudiantes adicional fue proporcionada por el Instituto Médico Howard Hughes y el fondo de Staley.

1. Preparación de grandes vesículas de lípidos unilamelares (LUVs) <ol><li> Prepare LUVs para servir como membrana de la célula imita para el ensayo 19. </li><li> Fosfatidilcolina Mix (POPC, 760,10 g / mol), fosfatidilglicerol (POPG. 770,99 g / mol), 5-dimethylaminonaphthalene-1-sulfonil fosfatidiletanolamina (DNS-PAPA, 994.350 g / mol) (Avanti Polar Lipids) disuelto en cloroformo en un 50 : relación de 45:5. Como cada ensayo requiere la preparación por separado de LUVs experimentales y control, dos viales de la torta de lípidos debe estar preparado. 0.376 mg de lípidos totales (0,188 mg POPC, 0.169 POPG mg, 0.019 mg y DNS-PAPA) suele ser suficiente para que las vesículas suficientes para un juicio translocación única. </li><li> Se evapora el cloroformo con una corriente de N2 gas. </li><li> Secar la torta de lípidos 14.09 horas en un desecador de vacío. </li><li> Prepare una solución stock 10 mM tampón HEPES (10 mM HEPES, 238,3 g / mol, 45 mM NaCl, 58.44 g / mol, 1 mM EDTA, 372,24 g / mol pH 7,4). Tampón HEPES es stOR a 4 ° C. </li><li> Prepare una solución madre de 0,4 mM tripsina porcina (23,3 kg / mol) en tampón HEPES 10 mM preparada anteriormente. Tripsina se almacenan a -20 ° C y, en nuestra práctica, por lo general no pasan por más de dos ciclos de congelación-descongelación antes de su uso. </li><li> Prepare una solución madre de 4,0 mM inhibidor de Bowman-Birk tripsina (8 kg / mol) en 10 mM solución tampón HEPES y almacenar a -20 ° C. En nuestro uso, esta población se abastece mensualmente y por lo general no sufre más de 3 de congelación / deshielo antes de que se hizo de nuevo. </li><li> Reconstituir experimental vesículas multilamelares (MLV) en una solución 0.2 mM de tripsina mediante la adición de un volumen igual de 0,4 mM de valores de tripsina y 10 mM solución tampón HEPES a la torta seca de lípidos. Para una sola muestra de 0.376 mg de lípidos totales, una mezcla de 150 ml de solución de tripsina y 150 l de tampón HEPES es suficiente. </li><li> MLV reconstituir el control en una solución con 0,2 mM de tripsina y 2,0 mM de Bowman-Birk inhibidor de la tripsina mediante la adición de un volumen igual de 0.4 mM tripsina de acciones y 4,0 mM de inhibidor de tripsina de las tortas de lípidos secos. Para una sola muestra de 0.376 mg de lípidos totales, una mezcla de 150 ml de solución de tripsina y 150 l de inhibidor de tripsina es suficiente. </li><li> Transferencia de MLV soluciones de frascos de vidrio de 1,7 ml tubo de microcentrífuga. </li><li> Asunto MLV soluciones al 5 de congelación / deshielo en nitrógeno líquido. </li><li> Prepare lípidos extrusora (Avanti Polar Lipids) mediante la colocación de dos soportes de filtro humedecido en una solución tampón HEPES en cada pieza de teflón extrusora. Colocar una membrana pista Nuclepore grabado con 0,1 micras poros (Whatman, Reino Unido) entre las dos piezas de teflón extrusora, y colocar las piezas del extrusor dentro del recipiente de metal extrusora. Coloque el espaciador dona más de las dos piezas del extrusor antes de apretar la tapa de metal de la lata del extrusor y colocarlo en el soporte. </li><li> Llenar el volumen vacío dentro de la extrusora con 500 l tampón HEPES 10 mM usando una jeringa de vidrio de 250 l para evitar la pérdida de la muestra de la vesícula. &lt;/ Li&gt; <li> Cargar cada muestra MLV en la extrusora y empuje la muestra a través de la membrana por lo menos 21 veces para asegurarse de tamaño uniforme de vesículas unilamelares. LUVs se obtienen a partir de la extrusión siguientes MLV solución. </li><li> LUVs se almacena a 4 º C y utilizar dentro de las 48 horas. </li></ol> 2. La cuantificación de la concentración LUV <ol><li> LUV concentración se cuantificó mediante la determinación del contenido total de fósforo en la muestra 20. </li><li> Prepare 8,9 NH 2 SO 4 en agua Nanopure y almacenar a temperatura ambiente. </li><li> Prepare un 2,5% w / v de amonio molibdato VI (588,04 g / mol) disolución en agua Nanopure. Prepare un 10% w / v de ácido ascórbico (176,1 g / mol) disolución en agua Nanopure. Proteger a la solución de ácido ascórbico de la exposición a la luz por la que cubre el tubo con papel de aluminio. Tienda de ambas soluciones a 4 º C durante un máximo de 2 meses. </li><li> Prepare 0,65 mM de fosfato solución tampón (fosfato monobásico de sodio anhidro, 120 g / mol). </li><li> Preparar seis estándar tubes. Las normas deben contener 0,0 l, 50 l (0,0325 moles), 100 L (0,065 moles), 175 l (0,114 moles), 250 l (0,163 moles), o 350 l (0,228 moles) de solución de fósforo. </li><li> Prepare LUV tubos de muestras por triplicado. Cada tubo de ensayo debe contener aproximadamente 0,1 moles de LUVs. Experimentales y de control LUV concentraciones deben medirse por separado. </li><li> Para corregir las sales de fósforo en el polvo seco inhibidor de Bowman-Birk, un control de LUV en blanco debe estar preparado. El blanco debe contener el mismo volumen del 0,2 mM mM trypsin/2.0 solución de inhibidor de Bowman-Birk que fue colocado en el control LUV tubo de muestra. </li><li> Colocar 450 l de 8,9 NH 2 SO 4 en cada una de las muestras, estándar, y los tubos de vacío. </li><li> Muestras de calor, las normas y los espacios en blanco durante 25 minutos a 175-210 ° C en un horno. </li><li> Retire todos los tubos y deje que se enfríen. Añadir 150 ml de 30% de H 2 O 2 a cada uno de los tubes. </li><li> Muestras de calor, las normas y los espacios en blanco durante 30 minutos a 175-210 º C. </li><li> Quitar las muestras, las normas y los espacios en blanco del fuego. Si alguna de las soluciones aún no son incoloros, se añaden 50 l H 2 O 2 a todos los tubos y el calor durante 15 minutos a 175-210 º C. </li><li> Añadir 3,9 ml Nanopure H 2 O, 0,5 ml de solución de molibdato de amonio y 0,5 mL de solución de ácido ascórbico a cada tubo. </li><li> Todos los tubos de calor durante 5-7 minutos en un baño de agua hirviendo. </li><li> Medir la absorbancia de cada estándar y muestra a 820 nm utilizando un Agilent 8453 espectrofotómetro UV-Visible. El tubo que contiene 0,0 mmol de fósforo se debe utilizar como blanco de todas las normas y experimental LUV muestras. El tubo que contiene el 0,2 mM mM trypsin/2.0 Bowman-Birk solución de inhibidor debe ser utilizado como blanco para el control de la muestra LUV. </li><li> Un contenido de fósforo lineal absorbancia frente a la curva estándar puede ser producido y utilizado para calcular el total de phosphOrus contenido y la LUV concentración de las muestras. </li></ol> 3. La preparación de soluciones de péptidos <ol><li> Disolver péptido en Nanopure H 2 O. Los péptidos utilizados en este ensayo como se describe debe contener un residuo de triptófano. </li><li> Medir la absorbancia de la solución de péptido a 282 nm por triplicado. Calcular la concentración de péptido mediante el coeficiente de extinción molar de triptófano de 5700 M -1 cm -1. </li><li> Diluir en agua Nanopure péptido a una concentración final de 30 micras. Almacenar a -20 ° C </li></ol> 4. Translocación de cuantificación <ol><li> Preparar muestras experimentales y de control en el 1,7 mL tubos de microcentrífuga. Añadir LUVs suficiente para cada solución, para una concentración final de 250 mM. Agregar suficiente Bowman-Birk solución de inhibidor de modo que es inhibidor de una concentración final 10 veces mayor que la concentración de tripsina. Agregar suficiente tampón HEPES 10 mM para llevar el volumen de la solución final a 450 mL. </li> &lt;li&gt; Lugar 50 l solución del péptido en una célula Starna micro fluorómetro de cuarzo. La relación entre LUVs y el péptido es lo suficientemente alta para asegurar que prácticamente todos los péptidos intactos están muy cerca como para un grupo dansilo para dar una señal de FRET, aunque ninguno de ellos ha translocado en la vesícula. Esto es consistente con la observada en el FRET similares condiciones de control de péptidos que hacer y no trasladar en vesículas. </li><li> Añadir la muestra experimental o de control para la solución de péptido en la cubeta. Esto debería reducir la concentración de péptido final a 3 micras. </li><li> Comenzar un experimento de 25 minutos cinética de fluorescencia inmediatamente después de la adición de experimental o de control LUV solución, teniendo una lectura de la fluorescencia por lo menos una vez por segundo. La longitud de onda de excitación a 280 nm, la longitud de onda de emisión a 525 nm, y la temperatura a 25 ° C. El uso de un espectrofotómetro de fluorescencia Cary Eclipse, que ajustar la sensibilidad a la PMT de alta. </li></ol><html> 5. Generación de una Relación de translocación cuantitativos <ol><li> Definir fluorescencia inicial (F o) como la lectura de fluorescencia después de quince segundos de la recopilación de datos. En nuestra configuración del instrumento, hemos encontrado que los primeros quince segundos de los datos de fluorescencia recogidos no son fiables debido a la mezcla, cerrar la cámara de la muestra, y otras perturbaciones en el sistema con la adición de la muestra. Divide cada lectura posterior por F o para obtener la fluorescencia relativa (F / F 0) en cada momento. </li><li> Promedio de todas las lecturas de fluorescencia relativa de la última hora del experimento para obtener una final de fluorescencia relativa media <img alt="[F / Fo] avg" src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" /> . </li><li> Divida el <img alt="[F / Fo] avg" src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" /> para las muestras de control por parte del <img alt="[F / Fo] avg" src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" /> para muestras experimentales para obtener un valor corregido de fluorescencia final. </li></ol>le &quot;&gt; 6. Resultados Representante La Figura 2 muestra los resultados de este ensayo para un péptido representante que mostró translocación robusto. La señal en este experimento (negro traza) muestra un marcado descenso de la señal de FRET en el tiempo. Sin embargo, es importante controlar la posible pérdida de la señal de FRET debido a la inhibición de tripsina incompleta o otros factores no relacionados con la capacidad de desplazamiento. Con este fin, siempre también medir la señal de FRET entre los péptidos y LUVs que contiene tanto la tripsina y Bowman-Birk inhibidor de la tripsina (gris traza, figura 2). En nuestras manos, ha sido importante para llevar a cabo este control para cada péptido cada vez que se ejecute un experimento. Esto nos permite corregir claramente cualquier cambio en la señal debido a las diferencias entre las preparaciones de vesículas de lípidos o el ruido del instrumento, que puede ser significativo para las señales fluorescente relativamente débil suele observarse en estas concentraciones. La importancia de las experiencias de controlriment con LUVs que contiene inhibidor de la tripsina se destaca por los datos mostrados en la Figura 3. En este caso, el péptido señal de disminución de una cantidad similar a la de la Figura 2 en la muestra experimental (rastro negro). Sin embargo, la muestra de control muestra una disminución más rápida de este péptido, por lo que su desplazamiento neto es inferior. La sección 5 de nuestro protocolo describe un método sencillo para cuantificar la translocación de este experimento. Mayores relaciones de translocación son indicativos de los péptidos que trasladar de manera eficiente, la relación de la translocación de los péptidos penetrantes de células se muestra en la Figura 2 es de 1,16, mientras que translocación débilmente péptidos tienen índices de desplazamiento más cercano a 1. En nuestra experiencia, el error estándar de tres experimentos independientes realizados con preparados de diferentes vesícula está en el rango de 0,01 a 0,06. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3571/3571fig1.jpg" /> Figura 1. Esquemática de translocatanálisis de iones. Experimental LUV muestras (A) son dopados con fluorescentes PAPA dansilo (barras de color negro) y contienen encapsulado tripsina (tijeras). Inhibidor de la tripsina (círculo rojo) se utiliza para inhibir la tripsina fuera de la LUVs. El LUVs están expuestas al péptido (morado). Péptido junto con los rendimientos de las membranas LUV un traste de la señal (verde), que disminuye a medida que los péptidos translocting encuentro tripsina internos sin inhibiciones. Tanto la tripsina y el inhibidor de tripsina se encapsulan en el control de las muestras LUV (B) para medir la disminución de la señal de FRET no relacionados con la translocación. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3571/3571fig2.jpg" /> Figura 2. Datos representativos de un péptido penetran en las células. Un representante de la translocación pepide antimicrobianos muestra un descenso significativo en FRET señal en comparación con su control. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3571/3571fig3.jpg" /> Figura3. Datos representativos destacando la importancia del control. Inhibición incompleta de la digestión tríptica de un péptido de translocación no conduce a una caída en el FRET señal con el tiempo, tanto experimentales y de control LUV soluciones. Debido a la diferencia entre el control y la traza experimental es relativamente pequeño, este mutante se caracteriza por ser un péptido débilmente translocación.

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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El protocolo que aquí se presenta puede ser utilizado para evaluar el cambio relativo en la concentración de péptidos dentro y fuera de las vesículas lipídicas. Estos cambios están relacionados con la capacidad de desplazamiento. Este protocolo se puede utilizar para identificar penetran en las células péptidos con potencial como vectores de la administración de fármacos. Como el interés en la celda de penetración de los péptidos crece, será interesante ver cómo los métodos que miden directamente el caso de translocació...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> 16:00-18:01 PG </td><td> Avanti Polar Lípidos </td><td> 840457C </td></tr><tr><td> 01:18 Dansilo PE </td><td> Avanti Polar Lípidos </td><td> 810330C </td></tr><tr><td> 16:00-18:01 PC </td><td> Avanti Polar Lípidos </td><td> 850457C </td></tr><tr><td> Tripsina porcina </td><td> Sigma </td><td> T-0303 </td></tr><tr><td> Bowman-Birk tripsina / quimotripsina inhibidor </td><td> Sigma </td><td> T-9777 </td></tr><tr><td> Mini-extrusora </td><td> Avanti Polar Lípidos </td><td> 610000 </td></tr><tr><td> Molibdato de amonio (para) </td><td> Alfa Aesar </td><td> 10811 </td></tr><tr><td> Ácido L-ascórbico </td><td> Sigma </td><td> A1417 </td></tr><tr><td> El peróxido de hidrógeno, 30% de solución </td><td> Mallinckrodt productos químicos </td><td> 5240-05 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H-3375 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> S-9625 &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E5134 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> Sigma </td><td> S-0751 </td></tr></tbody></table>

la translocación de péptidos en la medición de grandes vesículas unilamelares

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

Hay un interés activo en péptidos que atraviesa fácilmente las membranas celulares sin la ayuda de los receptores de membrana de la célula 1. Muchos de estos se conocen como células de penetración de los péptidos, que con frecuencia se caracterizan por su potencial como vectores de administración de fármacos 1-3. Por otra parte, hay un creciente interés en los péptidos antimicrobianos que operan a través de mecanismos no-membrana lítica 4,5, en particular los que atraviesan las membranas bacterianas sin causar lisis celular y destruir las células al interferir con los procesos intracelulares 6,7. De hecho, los autores han señalado cada vez más la relación entre los péptidos penetran en las células y la resistencia a 1,8. Una sólida comprensión del proceso de translocación de membrana y la relación entre la estructura de péptidos y su capacidad para trasladar requiere ensayos de eficacia y reproducible para el desplazamiento. Varios grupos han propuesto métodos para medir el desplazamiento en gran unilamellar vesículas de lípidos (LUVs) 13.09. LUVs servir como modelos útiles para las membranas celulares bacterianas y eucariotas y se utilizan con frecuencia en estudios de péptido fluorescente 14,15. A continuación, describimos nuestra aplicación del primer método desarrollado por Matsuzaki y compañeros de trabajo para considerar los péptidos antimicrobianos, como Magainin y buforin II 16,17. Además de proporcionar el protocolo para este método, también presentamos un método directo para el análisis de datos que cuantifica la capacidad de desplazamiento utilizando este ensayo. Las ventajas de este ensayo de translocación en comparación con otros que tiene el potencial para proporcionar información sobre la tasa de translocación de membrana y no requiere la adición de una etiqueta fluorescente, que pueden alterar las propiedades del péptido 18, al triptófano que contienen péptidos. En pocas palabras, la capacidad de desplazamiento en las vesículas de lípidos se mide en función de la transferencia de energía Fomentar la resonancia (FRET) entre los residuos de triptófano nativos y dansyl fosfatidiletanolamina cuando las proteínas se asocian con la membrana externa LUV (Figura 1). Penetran en las células se rompen como los péptidos que se encuentran inhibidos tripsina encapsulada con la LUVs, lo que lleva a la disociación de la membrana LUV y la caída de la señal de FRET. La caída de la FRET señal observada para un péptido de translocación es significativamente mayor que la observada para el mismo péptido cuando el LUVs contener la tripsina y el inhibidor de tripsina, o cuando un péptido que no espontáneamente atravesar las membranas de lípidos está expuesto a la tripsina que contienen LUVs. Este cambio en la fluorescencia proporciona una cuantificación directa de la translocación de péptidos a través del tiempo.

Este protocolo de detalles un método para la medición cuantitativa de la translocación de péptidos en grandes vesículas de lípidos unilamelares. Este método también proporciona información sobre la tasa de translocación de membrana y puede ser utilizado para identificar péptidos que de manera eficiente y espontáneamente bicapas lipídicas cruz.

La translocación de péptidos en la medición de grandes vesículas unilamelares

Existe un interés activo en los péptidos que atraviesan fácilmente las membranas celulares sin la ayuda de receptores de membrana celular1. Muchos de estos se denominan...

Para cuantificar la translocación de péptidos a través de membranas de vesículas. Se generan vesículas lipídicas marcadas con fluorescencia que contienen tripsina encapsulada. Se añade un inhibidor de la tripsina para inhibir la actividad de cualquier tripsina exógena, dejando la tripsina activa en el lumen de la vesícula.Solo cuando se añaden péptidos marcados con fluorescencia a las vesículas, sus etiquetas fluorescentes actúan como donadores de fret y excitan las moléculas fluorescentes en la vesícula. Sin embargo, cuando las proteínas atraviesan la membrana, son digeridas por la tripsina y la señal de fret se pierde. El análisis espectrométrico revela el grado de translocación del péptido, que se observa como una disminución en el fret entre las vesículas y el péptido a lo largo del tiempo.La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos, incluidas otras técnicas de vesículas lipídicas y métodos para medir la entrada de péptidos en células, es que proporciona información sobre la cinética de la entrada en la membrana, y no requiere la adición de una etiqueta fluorescente a los péptidos si contienen un triptófano. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el diseño e ingeniería de péptidos activos sobre membranas, como cuáles son las características necesarias para una translocación eficaz a través de la membrana. El primer paso de este procedimiento consiste en preparar vesículas unilamelares grandes o UUVs para utilizarlas como modelos de membrana celular en el ensayo.Comience combinando fosfatidilcolina, fosfatidilglicerol y cinco dimetilamino naftaleno unido a fosfatidiletanolamina en cloroformo, en una proporción de 50 a 45 a 5. Usualmente, 0,376 miligramos de lípido total son suficientes para producir suficientes vesículas para un único ensayo experimental o control.Prepare un vial como muestra experimental y otro como control; evapore el cloroformo utilizando una corriente de gas nitrógeno. Los lípidos secos que quedan después de este paso se denominan pastillas de lípidos. Seque las pastillas de lípidos durante nueve a 14 horas en un desecador al vacío.A continuación, prepare una solución stock de HEI de 10 milimolar, una solución stock de tripsina porcina de 0.4 milimolar y una solución stock de inhibidor de tripsina Bowman-Birk de 4.0 milimolar; los detalles para su preparación se encuentran en el documento adjunto. Añada un volumen igual de la solución stock de tripsina de 0.4 milimolar y de la solución buffer de HEI de 10 milimolar a los discos lipídicos secos. Luego, vortexee el vial para reconstituir las vesículas multilamelares o MVs. Para reconstituir las MVs de control, añada un volumen igual de la solución stock de tripsina de 0.4 milimolar y del inhibidor de tripsina de 4.0 milimolar al disco lipídico seco y vortexee como antes.Una vez que se reconstituyen las MV, transfiera las soluciones de MLV desde los viales de vidrio a tubos microcentrífugos de 1,7 mililitros. Luego, someta las soluciones de MLV a cinco ciclos de congelación-descongelación, alternando entre nitrógeno líquido y un baño de agua a 30 grados Celsius. A continuación, prepare un extrusor de lípidos humedeciendo dos soportes de filtro en tampón Heiss.Luego, coloque cada uno sobre una pieza de extrusor de teflón humedecida y coloque una membrana de policarbonato con poros de 0,1 micrones entre las dos piezas de extrusor de teflón. Ahora coloque las piezas del extrusor dentro de un cartucho metálico del extrusor y coloque un espaciador en forma de dona sobre las dos piezas del extrusor. Ajuste la tapa metálica del cartucho del extrusor y luego colóquelo en el soporte utilizando una jeringa de vidrio de 250 microlitros.Llene el vacío del extrusor con 500 microlitros de tampón HEPES 10 milimolar para evitar cualquier pérdida de la muestra de vesículas. Transfiera la muestra a un vaso de precipitados de 10 mililitros.Luego, cargue cada muestra de MLV en el extrusor e impulse la muestra a través de la membrana al menos 21 veces. Para asegurar un tamaño uniforme de las vesículas Ella tras la extrusión, transfiera las vesículas lipídicas grandes de ELLA o L UUVs a un tubo microcentrífugo de 1,7 mililitros. Almacene las UUVs a cuatro grados Celsius y úselas dentro de las 48 horas.Para evaluar la concentración de LUV, se determina el contenido total de fósforo en la muestra. Debe prepararse lo siguiente según las especificaciones del protocolo escrito adjunto: ácido sulfúrico 8,9 normal, molibdato de amonio al 2,5% peso por volumen, seis al 10% peso por volumen, ácido ascórbico y solución tampón de fosfato 0,65 milimolar.Prepare seis estándares de fósforo como se muestra aquí. Luego, prepare un blanco de LUV con el mismo volumen de solución de tripsina 0,2 milimolar e inhibidor Bowman BIR 2,0 milimolar que el utilizado para los controles. Esto se realiza para corregir cualquier sal de fósforo seca presente en el polvo del inhibidor Bowman B.A continuación, pipetee aproximadamente 0,1 micromoles, generalmente unos 25 microlitros de UUV, en tubos de cultivo de vidrio desechables por triplicado. A continuación, agregue 450 microlitros de H dos SO cuatro normal 8,9 a cada uno de los tubos de muestra, estándar y blanco. Luego coloque las muestras, estándares y blancos en un horno a 175-210 grados Celsius durante 25 minutos.Después de que hayan transcurrido 25 minutos, retire todos los tubos del horno y déjelos enfriar. Añada 150 microlitros de 30%H2O a cada uno de los tubos. Luego caliente las muestras, patrones y blancos durante otros 30 minutos a una temperatura de 175 a 210 grados Celsius.Después de 30 minutos, retire los patrones, muestras y blancos del calor. Si alguna de las soluciones aún no está incolora, agregue 50 microlitros de tubo de H2O a todos los tubos y caliente durante 15 minutos adicionales a 175-210 grados Celsius. Una vez que las soluciones estén incoloras, agregue 3,9 mililitros de H2O nano pura, 0,5 mililitros de solución de molibdato de amonio y 0,5 mililitros de solución de ácido ascórbico a cada tubo.Luego, caliente todos los tubos durante cinco a siete minutos. En un baño de agua hirviendo, mida la absorbancia de cada estándar y muestra a 820 nanómetros utilizando un espectrofotómetro UV visible Agilent 8 4 5 3. Las concentraciones de LUV experimentales y de control deben medirse por separado.El tubo que contiene 0,0 milimoles de fósforo debe usarse como blanco para todos los patrones y muestras experimentales de LUV. El tubo que contiene 0,2 milimolar de tripsina, 2,0 milimolar de hueso y solución inhibidora de bir debe usarse como blanco para la muestra de control de LUV. La curva patrón lineal de absorbancia frente al contenido de fósforo obtenida debe utilizarse para calcular el contenido total de fósforo y la concentración de LUV de las muestras.Para preparar las soluciones de péptidos, disuelva el péptido en Oppu H2O; los péptidos utilizados en este ensayo deben contener un residuo de triptófano. Mida la absorbancia de la solución de péptidos a 282 nanómetros por triplicado. Calcule la concentración del péptido utilizando el coeficiente de extinción molar para triptófano de 5.700.Inverso molar por centímetro inverso, diluya el péptido en agua nano pura hasta una concentración final de 30 micromolares y almacénelo a menos 20 grados Celsius. Para cuantificar la translocación, prepare muestras experimentales y controles en tubos microcentrífugos de 1,7 mililitros. Añada suficientes UUVs a cada solución para obtener una concentración final de 250 micromolares.Añada suficiente solución del inhibidor Bowman BIR para que el inhibidor alcance una concentración final 10 veces mayor que la concentración de tripsina. Añada suficiente tampón heis 10 milimolar para llevar el volumen final de la solución a 450 microlitros. Coloque 50 microlitros de la solución de péptido en una cubeta de microcanales stana para fluorímetro y colóquela en el programa del espectrofotómetro.Un espectrofotómetro de fluorescencia para realizar un experimento de cinética fluorescente de 25 minutos, en el cual se registra una lectura de fluorescencia al menos una vez por segundo con una longitud de onda de excitación de 280 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 525 nanómetros a 25 grados Celsius. Con la sensibilidad del PMT en alto, añada la muestra experimental o control a la solución de péptido en el qve. Esto debe llevar la concentración final del péptido a tres micromolares; inmediatamente comience el experimento de cinética fluorescente.Una vez que se hayan analizado tanto las muestras experimentales como las de control, calcule las relaciones de translocación según se describe en el documento adjunto. La relación entre los péptidos y el grupo dansil es lo suficientemente alta como para garantizar que prácticamente todos los péptidos intactos se encuentren lo suficientemente cerca de un grupo dansil como para producir una señal de FRET, incluso si ninguno de ellos ha translocado hacia el interior de la vesícula. Esto concuerda con la señal de FRET similar observada en las condiciones de control para péptidos que translocan y que no translocan hacia el interior de las vesículas.Los ensayos de translocación se realizaron según se describe en este video. Esta figura muestra los resultados de un péptido representativo que exhibió una translocación robusta. La señal en este experimento, representada por el trazo negro, muestra una marcada disminución en la señal de FRET.Con el tiempo, ratios de translocación más altos indican péptidos que se translocan eficientemente. El ratio de translocación para los péptidos penetrantes celulares mostrados aquí es de 1,19; semanalmente, los péptidos que se traducen presentan ratios de translocación más cercanos a uno para controlar la posible pérdida de la señal FRET debida a viajes incompletos, inhibición u otros factores no relacionados con la capacidad de translocación. Se mide la señal FRET entre el péptido y las UUV que contienen tanto tripsina como el inhibidor de tripsina Bowman-BRK.Esto se muestra como el trazo gris. La importancia del experimento control utilizando UUVs que contienen inhibidor de tripsina queda resaltada por los datos mostrados aquí. En este caso, la señal del péptido disminuyó una cantidad similar a la de la figura anterior en la muestra experimental representada por el trazo negro.Sin embargo, la muestra de control muestra una disminución más rápida para este péptido, por lo que su translocación neta es menor. Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo preparar vesículas lipídicas y medir la translocación de péptidos que contienen triptófano. Al intentar este procedimiento, es importante recordar comenzar a recopilar datos inmediatamente después de mezclar el péptido y las vesículas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este video analiza el ensayo de fuga de fluorescencia para estudiar las interacciones de los péptidos que penetran en las células con las membranas celulares utilizando imitadores de membranas celulares: grandes vesículas unilaminares, o LUV, encapsuladas con un tinte fluorescente y un extintor.

Ensayo de fuga de fluorescencia para estudiar la interacción del péptido que penetra en las células con la membrana

El protocolo presentado describe el análisis del transporte mediado por proteínas de membrana a nivel de transportador único utilizando bicapas lipídicas sin disolventes que atraviesan poros. Esto se logra mediante la creación de chips de matriz de nanoporos producidos a granel, combinados con la adquisición y el análisis de datos altamente paralelos, lo que permite el establecimiento futuro de cribados de efectores de proteínas de membrana.

Membrana de transporte de procesos analizados por un sistema de nanoporos viruta altamente paralela a la Resolución de la proteína individual

Aquí se presentan protocolos para la creación de pequeñas vesículas unilamelares basadas en péptidos capaces de crecer. Para facilitar la producción vesiculo del péptido de membrana, estas vesículas están equipadas con un sistema de transcripción-traducción y el plásmido codificante de péptidos.

En Vesiculo Síntesis de Precursores de Membrana De péptido para crecimiento de la vesícula Autónoma

El objetivo del protocolo es medir de forma fiable las propiedades mecánicas de membrana de las vesículas gigantes por aspiración de micropipetas.

Obtención de vesículas híbridas unilamelares gigantes por electroformación y medición de sus propiedades mecánicas por aspiración de micropipeta

El ensayo de fuga de fluorescencia es un método simple que permite la investigación de las interacciones péptido/membrana con el fin de comprender su participación en varios procesos biológicos y especialmente la capacidad de los péptidos que penetran en las células para alterar las bicapas de fosfolípidos durante un proceso de translocación celular directa.

Ensayo de fuga fluorescente para investigar la desestabilización de la membrana por péptido que penetra en las células

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Ensamblaje de modelos de bicapa lipídica soportada y suspendida de imitación celular para el estudio de interacciones moleculares

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Seguimiento de partículas sensibles a la masa para caracterizar la dinámica de macromoléculas asociada a la membrana

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Síntesis de vesículas unilamelares gigantes compuestas: un modelo biomimético de células nucleadas

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Seguimiento de proteínas individuales en bicapas lipídicas mediante microscopía de fluorescencia

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Aprende a cuantificar la translocación de péptidos en vesículas lipídicas unilamelares grandes usando FRET y tripsina. Este método permite analizar la cinética de entrada en membranas y evaluar eficiencia de péptidos.

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