La translocación de péptidos en la medición de grandes vesículas unilamelares

Para cuantificar la translocación de péptidos a través de membranas de vesículas. Se generan vesículas lipídicas marcadas con fluorescencia que contienen tripsina encapsulada. Se añade un inhibidor de la tripsina para inhibir la actividad de cualquier tripsina exógena, dejando la tripsina activa en el lumen de la vesícula.

Solo cuando se añaden péptidos marcados con fluorescencia a las vesículas, sus etiquetas fluorescentes actúan como donadores de fret y excitan las moléculas fluorescentes en la vesícula. Sin embargo, cuando las proteínas atraviesan la membrana, son digeridas por la tripsina y la señal de fret se pierde. El análisis espectrométrico revela el grado de translocación del péptido, que se observa como una disminución en el fret entre las vesículas y el péptido a lo largo del tiempo.

La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos, incluidas otras técnicas de vesículas lipídicas y métodos para medir la entrada de péptidos en células, es que proporciona información sobre la cinética de la entrada en la membrana, y no requiere la adición de una etiqueta fluorescente a los péptidos si contienen un triptófano. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el diseño e ingeniería de péptidos activos sobre membranas, como cuáles son las características necesarias para una translocación eficaz a través de la membrana. El primer paso de este procedimiento consiste en preparar vesículas unilamelares grandes o UUVs para utilizarlas como modelos de membrana celular en el ensayo.

Comience combinando fosfatidilcolina, fosfatidilglicerol y cinco dimetilamino naftaleno unido a fosfatidiletanolamina en cloroformo, en una proporción de 50 a 45 a 5. Usualmente, 0,376 miligramos de lípido total son suficientes para producir suficientes vesículas para un único ensayo experimental o control.

Prepare un vial como muestra experimental y otro como control; evapore el cloroformo utilizando una corriente de gas nitrógeno. Los lípidos secos que quedan después de este paso se denominan pastillas de lípidos. Seque las pastillas de lípidos durante nueve a 14 horas en un desecador al vacío.

A continuación, prepare una solución stock de HEI de 10 milimolar, una solución stock de tripsina porcina de 0.4 milimolar y una solución stock de inhibidor de tripsina Bowman-Birk de 4.0 milimolar; los detalles para su preparación se encuentran en el documento adjunto. Añada un volumen igual de la solución stock de tripsina de 0.4 milimolar y de la solución buffer de HEI de 10 milimolar a los discos lipídicos secos. Luego, vortexee el vial para reconstituir las vesículas multilamelares o MVs. Para reconstituir las MVs de control, añada un volumen igual de la solución stock de tripsina de 0.4 milimolar y del inhibidor de tripsina de 4.0 milimolar al disco lipídico seco y vortexee como antes.

Una vez que se reconstituyen las MV, transfiera las soluciones de MLV desde los viales de vidrio a tubos microcentrífugos de 1,7 mililitros. Luego, someta las soluciones de MLV a cinco ciclos de congelación-descongelación, alternando entre nitrógeno líquido y un baño de agua a 30 grados Celsius. A continuación, prepare un extrusor de lípidos humedeciendo dos soportes de filtro en tampón Heiss.

Luego, coloque cada uno sobre una pieza de extrusor de teflón humedecida y coloque una membrana de policarbonato con poros de 0,1 micrones entre las dos piezas de extrusor de teflón. Ahora coloque las piezas del extrusor dentro de un cartucho metálico del extrusor y coloque un espaciador en forma de dona sobre las dos piezas del extrusor. Ajuste la tapa metálica del cartucho del extrusor y luego colóquelo en el soporte utilizando una jeringa de vidrio de 250 microlitros.

Llene el vacío del extrusor con 500 microlitros de tampón HEPES 10 milimolar para evitar cualquier pérdida de la muestra de vesículas. Transfiera la muestra a un vaso de precipitados de 10 mililitros.

Luego, cargue cada muestra de MLV en el extrusor e impulse la muestra a través de la membrana al menos 21 veces. Para asegurar un tamaño uniforme de las vesículas Ella tras la extrusión, transfiera las vesículas lipídicas grandes de ELLA o L UUVs a un tubo microcentrífugo de 1,7 mililitros. Almacene las UUVs a cuatro grados Celsius y úselas dentro de las 48 horas.

Para evaluar la concentración de LUV, se determina el contenido total de fósforo en la muestra. Debe prepararse lo siguiente según las especificaciones del protocolo escrito adjunto: ácido sulfúrico 8,9 normal, molibdato de amonio al 2,5% peso por volumen, seis al 10% peso por volumen, ácido ascórbico y solución tampón de fosfato 0,65 milimolar.

Prepare seis estándares de fósforo como se muestra aquí. Luego, prepare un blanco de LUV con el mismo volumen de solución de tripsina 0,2 milimolar e inhibidor Bowman BIR 2,0 milimolar que el utilizado para los controles. Esto se realiza para corregir cualquier sal de fósforo seca presente en el polvo del inhibidor Bowman B.

A continuación, pipetee aproximadamente 0,1 micromoles, generalmente unos 25 microlitros de UUV, en tubos de cultivo de vidrio desechables por triplicado. A continuación, agregue 450 microlitros de H dos SO cuatro normal 8,9 a cada uno de los tubos de muestra, estándar y blanco. Luego coloque las muestras, estándares y blancos en un horno a 175-210 grados Celsius durante 25 minutos.

Después de que hayan transcurrido 25 minutos, retire todos los tubos del horno y déjelos enfriar. Añada 150 microlitros de 30%H2O a cada uno de los tubos. Luego caliente las muestras, patrones y blancos durante otros 30 minutos a una temperatura de 175 a 210 grados Celsius.

Después de 30 minutos, retire los patrones, muestras y blancos del calor. Si alguna de las soluciones aún no está incolora, agregue 50 microlitros de tubo de H2O a todos los tubos y caliente durante 15 minutos adicionales a 175-210 grados Celsius. Una vez que las soluciones estén incoloras, agregue 3,9 mililitros de H2O nano pura, 0,5 mililitros de solución de molibdato de amonio y 0,5 mililitros de solución de ácido ascórbico a cada tubo.

Luego, caliente todos los tubos durante cinco a siete minutos. En un baño de agua hirviendo, mida la absorbancia de cada estándar y muestra a 820 nanómetros utilizando un espectrofotómetro UV visible Agilent 8 4 5 3. Las concentraciones de LUV experimentales y de control deben medirse por separado.

El tubo que contiene 0,0 milimoles de fósforo debe usarse como blanco para todos los patrones y muestras experimentales de LUV. El tubo que contiene 0,2 milimolar de tripsina, 2,0 milimolar de hueso y solución inhibidora de bir debe usarse como blanco para la muestra de control de LUV. La curva patrón lineal de absorbancia frente al contenido de fósforo obtenida debe utilizarse para calcular el contenido total de fósforo y la concentración de LUV de las muestras.

Para preparar las soluciones de péptidos, disuelva el péptido en Oppu H2O; los péptidos utilizados en este ensayo deben contener un residuo de triptófano. Mida la absorbancia de la solución de péptidos a 282 nanómetros por triplicado. Calcule la concentración del péptido utilizando el coeficiente de extinción molar para triptófano de 5.700.

Inverso molar por centímetro inverso, diluya el péptido en agua nano pura hasta una concentración final de 30 micromolares y almacénelo a menos 20 grados Celsius. Para cuantificar la translocación, prepare muestras experimentales y controles en tubos microcentrífugos de 1,7 mililitros. Añada suficientes UUVs a cada solución para obtener una concentración final de 250 micromolares.

Añada suficiente solución del inhibidor Bowman BIR para que el inhibidor alcance una concentración final 10 veces mayor que la concentración de tripsina. Añada suficiente tampón heis 10 milimolar para llevar el volumen final de la solución a 450 microlitros. Coloque 50 microlitros de la solución de péptido en una cubeta de microcanales stana para fluorímetro y colóquela en el programa del espectrofotómetro.

Un espectrofotómetro de fluorescencia para realizar un experimento de cinética fluorescente de 25 minutos, en el cual se registra una lectura de fluorescencia al menos una vez por segundo con una longitud de onda de excitación de 280 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 525 nanómetros a 25 grados Celsius. Con la sensibilidad del PMT en alto, añada la muestra experimental o control a la solución de péptido en el qve. Esto debe llevar la concentración final del péptido a tres micromolares; inmediatamente comience el experimento de cinética fluorescente.

Una vez que se hayan analizado tanto las muestras experimentales como las de control, calcule las relaciones de translocación según se describe en el documento adjunto. La relación entre los péptidos y el grupo dansil es lo suficientemente alta como para garantizar que prácticamente todos los péptidos intactos se encuentren lo suficientemente cerca de un grupo dansil como para producir una señal de FRET, incluso si ninguno de ellos ha translocado hacia el interior de la vesícula. Esto concuerda con la señal de FRET similar observada en las condiciones de control para péptidos que translocan y que no translocan hacia el interior de las vesículas.

Los ensayos de translocación se realizaron según se describe en este video. Esta figura muestra los resultados de un péptido representativo que exhibió una translocación robusta. La señal en este experimento, representada por el trazo negro, muestra una marcada disminución en la señal de FRET.

Con el tiempo, ratios de translocación más altos indican péptidos que se translocan eficientemente. El ratio de translocación para los péptidos penetrantes celulares mostrados aquí es de 1,19; semanalmente, los péptidos que se traducen presentan ratios de translocación más cercanos a uno para controlar la posible pérdida de la señal FRET debida a viajes incompletos, inhibición u otros factores no relacionados con la capacidad de translocación. Se mide la señal FRET entre el péptido y las UUV que contienen tanto tripsina como el inhibidor de tripsina Bowman-BRK.

Esto se muestra como el trazo gris. La importancia del experimento control utilizando UUVs que contienen inhibidor de tripsina queda resaltada por los datos mostrados aquí. En este caso, la señal del péptido disminuyó una cantidad similar a la de la figura anterior en la muestra experimental representada por el trazo negro.

Sin embargo, la muestra de control muestra una disminución más rápida para este péptido, por lo que su translocación neta es menor. Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo preparar vesículas lipídicas y medir la translocación de péptidos que contienen triptófano. Al intentar este procedimiento, es importante recordar comenzar a recopilar datos inmediatamente después de mezclar el péptido y las vesículas.