Name: La evaluación de la hipermutación somática en Ramos células B después de sobreexpresión o derribo de genes específicos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Aprende a evaluar la hipermutación somática en células B Ramos mediante sobreexpresión o silenciamiento de genes específicos. Este método permite identificar nuevos factores implicados en la diversificación de anticuerpos.

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El pMSCV-AID-I-Thy1.1 y pKat2 vectores eran una especie de regalo de la Dirección General de Schatz y el pVSV-G, PRSV Ap-, y pMDLg / pRRE vectores eran una especie de regalo de BR Cullen.

<ol><li>Di Noia, J. M., Neuberger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+antibody+somatic+hypermutation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of antibody somatic hypermutation.</a> Annu. Rev. Biochem. 76, 1-22 (2007).</li>
<li>Peled, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biochemistry+of+somatic+hypermutation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The biochemistry of somatic hypermutation.</a> Annu. Rev. Immunol. 26, 481-511 (2008).</li>
<li>Longerich, S., Basu, U., Alt, F., Storb, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AID+in+somatic+hypermutation+and+class+switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">AID in somatic hypermutation and class switch recombination.</a> Curr. Opin. Immunol. 18, 164-174 (2006).</li>
<li>Bardwell, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+somatic+hypermutation+and+reduced+class-switch+recombination+in+exonuclease+1-mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Altered somatic hypermutation and reduced class-switch recombination in exonuclease 1-mutant mice.</a> Nat. Immunol. 5, 224-229 (2004).</li>
<li>Martomo, S. A., Yang, W. W., Gearhart, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Msh6+but+not+Msh3+in+somatic+hypermutation+and+class+switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">A role for Msh6 but not Msh3 in somatic hypermutation and class switch recombination.</a> J. Exp. Med. 200, 61-68 (2004).</li>
<li>Phung, Q. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+hypermutation+at+G+and+C+nucleotides+in+immunoglobulin+variable+genes+from+mice+deficient+in+the+MSH2+mismatch+repair+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Increased hypermutation at G and C nucleotides in immunoglobulin variable genes from mice deficient in the MSH2 mismatch repair protein.</a> J. Exp. Med. 187, 1745-1751 (1998).</li>
<li>Rada, C., Ehrenstein, M. R., Neuberger, M. S., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hot+spot+focusing+of+somatic+hypermutation+in+MSH2-deficient+mice+suggests+two+stages+of+mutational+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Hot spot focusing of somatic hypermutation in MSH2-deficient mice suggests two stages of mutational targeting.</a> Immunity. 9, 135-141 (1998).</li>
<li>Rada, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoglobulin+isotype+switching+is+inhibited+and+somatic+hypermutation+perturbed+in+UNG-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunoglobulin isotype switching is inhibited and somatic hypermutation perturbed in UNG-deficient mice.</a> Curr. Biol. 12, 1748-1755 (2002).</li>
<li>Delbos, F., Aoufouchi, S., Faili, A., Weill, J. C., Reynaud, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+eta+is+the+sole+contributor+of+A%2FT+modifications+during+immunoglobulin+gene+hypermutation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase eta is the sole contributor of A/T modifications during immunoglobulin gene hypermutation in the mouse.</a> J. Exp. Med. 204, 17-23 (2007).</li>
<li>Masuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+eta+is+a+limiting+factor+for+A%3AT+mutations+in+Ig+genes+and+contributes+to+antibody+affinity+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase eta is a limiting factor for A:T mutations in Ig genes and contributes to antibody affinity maturation.</a> Eur. J. Immunol. 38, 2796-2805 (2008).</li>
<li>Lim, D. S., Hasty, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutation+in+mouse+rad51+results+in+an+early+embryonic+lethal+that+is+suppressed+by+a+mutation+in+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">A mutation in mouse rad51 results in an early embryonic lethal that is suppressed by a mutation in p53.</a> Mol. Cell. Biol. 16, 7133-7143 (1996).</li>
<li>Xiao, Y., Weaver, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+gene+targeted+deletion+by+Cre+recombinase+demonstrates+the+requirement+for+the+double-strand+break+repair+Mre11+protein+in+murine+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic.+Acids.+Res%22%5BJournal%5D)">Conditional gene targeted deletion by Cre recombinase demonstrates the requirement for the double-strand break repair Mre11 protein in murine embryonic stem cells.</a> Nucleic. Acids. Res. 25, 2985-2991 (1997).</li>
<li>Zhu, J., Petersen, S., Tessarollo, L., Nussenzweig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+Nijmegen+breakage+syndrome+gene+NBS1+leads+to+early+embryonic+lethality+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the Nijmegen breakage syndrome gene NBS1 leads to early embryonic lethality in mice.</a> Curr. Biol. 11, 105-109 (2001).</li>
<li>Luo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+mRad50+causes+embryonic+stem+cell+lethality%2C+abnormal+embryonic+development%2C+and+sensitivity+to+ionizing+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Disruption of mRad50 causes embryonic stem cell lethality, abnormal embryonic development, and sensitivity to ionizing radiation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7376-7381 (1999).</li>
<li>Pavri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation-induced+cytidine+deaminase+targets+DNA+at+sites+of+RNA+polymerase+II+stalling+by+interaction+with+Spt5%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Activation-induced cytidine deaminase targets DNA at sites of RNA polymerase II stalling by interaction with Spt5.</a> Cell. 143, 122-133 (2010).</li>
<li>Lee-Theilen, M., Matthews, A. J., Kelly, D., Zheng, S., Chaudhuri, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CtIP+promotes+microhomology-mediated+alternative+end+joining+during+class-switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">CtIP promotes microhomology-mediated alternative end joining during class-switch recombination.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 75-79 (2011).</li>
<li>Basu, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+exosome+targets+the+AID+cytidine+deaminase+to+both+strands+of+transcribed+duplex+DNA+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The RNA exosome targets the AID cytidine deaminase to both strands of transcribed duplex DNA substrates.</a> Cell. 144, 353-363 (2011).</li>
<li>Yabuki, M., Fujii, M. M., Maizels, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MRE11-RAD50-NBS1+complex+accelerates+somatic+hypermutation+and+gene+conversion+of+immunoglobulin+variable+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The MRE11-RAD50-NBS1 complex accelerates somatic hypermutation and gene conversion of immunoglobulin variable regions.</a> Nat. Immunol. 6, 730-736 (2005).</li>
<li>Sale, J. E., Neuberger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TdT-accessible+breaks+are+scattered+over+the+immunoglobulin+V+domain+in+a+constitutively+hypermutating+B+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">TdT-accessible breaks are scattered over the immunoglobulin V domain in a constitutively hypermutating B cell line.</a> Immunity. 9, 859-869 (1998).</li>
<li>Cumbers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+iterative+affinity+maturation+of+antibodies+in+vitro+using+hypermutating+B-cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Generation and iterative affinity maturation of antibodies in vitro using hypermutating B-cell lines.</a> Nat. Biotechnol. 20, 1129-1134 (2002).</li>
<li>Papavasiliou, F. N., Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cycle-regulated+DNA+double-stranded+breaks+in+somatic+hypermutation+of+immunoglobulin+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell-cycle-regulated DNA double-stranded breaks in somatic hypermutation of immunoglobulin genes.</a> Nature. 408, 216-221 (2000).</li>
<li>Parsa, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AID+mutates+a+non-immunoglobulin+transgene+independent+of+chromosomal+position%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">AID mutates a non-immunoglobulin transgene independent of chromosomal position.</a> Mol. Immunol. 44, 567-575 (2007).</li>
<li>Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+instability+of+V+region+hypermutation+in+the+Ramos+Burkitt%27s+lymphoma+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Clonal instability of V region hypermutation in the Ramos Burkitt's lymphoma cell line.</a> Int. Immunol. 13, 1175-1184 (2001).</li>
<li>Ukai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+a%3AT+mutations+is+dependent+on+cellular+environment+but+independent+of+mutation+frequency+and+target+gene+location%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of a:T mutations is dependent on cellular environment but independent of mutation frequency and target gene location.</a> J. Immunol. 181, 7835-7842 (2008).</li>
<li>Dull, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+third-generation+lentivirus+vector+with+a+conditional+packaging+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.</a> J. Virol. 72, 8463-8471 (1998).</li>
<li>Nakamura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequency+class+switching+of+an+IgM%2B+B+lymphoma+clone+CH12F3+to+IgA%2B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Immunol%22%5BJournal%5D)">High frequency class switching of an IgM+ B lymphoma clone CH12F3 to IgA+ cells.</a> Int. Immunol. 8, 193-201 (1996).</li>
<li>Muramatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+expression+of+activation-induced+cytidine+deaminase+%28AID%29%2C+a+novel+member+of+the+RNA-editing+deaminase+family+in+germinal+center+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Specific expression of activation-induced cytidine deaminase (AID), a novel member of the RNA-editing deaminase family in germinal center B cells.</a> J. Biol. Chem. 274, 18470-18476 (1999).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Como se mencionó anteriormente, los modelos de líneas celulares para la diversificación de anticuerpos se han convertido en un popular punto de partida para identificar nuevas proteínas que influyen en los diferentes pasos en la diversificación de anticuerpos. En este trabajo presentamos un método para el uso de la infección viral a las proteínas ya sea derribo o sobre-expresan en los Ramos de células B línea y luego examinar el impacto en SHM. Para estos estudios, que utilizan tanto el TE R...

Reactivos sugiere - la mayoría de estos pueden ser sustituidos con productos similares de otros fabricantes. <table border="1" ><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th > Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td > 6-y claro TC tratados con placas </td><td > Corning </td><td> 3516 </td><td ></td></tr><tr><td > 10 ml BD Luer-Loksyringes </td><td > BD Medical </td><td > 309604 </td><td ></td></tr><tr><td> 24-alejado TC-tratados placas </td><td > Corning </td><td > 3526 </td><td></td></tr><tr><td > De 96 pocillos de poliestireno claro fondo plano TC-tratados microplacas </td><td > Corning </td><td > 3596 </td><td ></td></tr><tr><td > 100 mm TC-tratados placas de cultivo </td><td > Corning </td><td > 430167 </td><td ></td></tr><tr><td > Filtros de jeringa Acrodisc, 0,45 m </td><td > Pall Life Sciences </td><td > 4604 </td><td ></td></tr><tr><td > Agar </td><td > Teknova </td><td > A7777 </td&gt; <td ></td></tr><tr><td > Agarosa </td><td > GeneMate </td><td> E-3120-500 </td><td ></td></tr><tr><td > Ampicilina </td><td> Sigma </td><td > A0166 </td><td> 100 mg / ml en agua </td></tr><tr><td > BD FACSCanto II citómetro de flujo </td><td> BD Biosciences </td><td ></td><td > o similar </td></tr><tr><td> BD Falcon tubos redondos inferior de poliestireno </td><td> BD Biosciences </td><td > 352054 </td><td > por FACS </td></tr><tr><td > BOSC 23 celdas </td><td > ATCC </td><td > CRL-11270 </td><td ></td></tr><tr><td > CO 2 capaz de incubadora a 37 ° C </td><td ></td><td ></td><td ></td></tr><tr><td > DMEM (Dulbecco modificado de Eagle) </td><td > Sigma </td><td> D6429 </td><td ></td></tr><tr><td > FBS (suero fetal bovino) </td><td > Gemini Bio-productos </td><td > 100-106 </td><td ></td></tr><tr><td > FITC α-rata CD90/mouse CD90.1 anticuerpos </td><td > BioLegend </td><td > 202503 </td><td > FITCα-Thy1.1 </td></tr><tr><td > FuGENE 6 Transfección reactivo </td><td > Roche </td><td > 11814443001 </td><td></td></tr><tr><td > Solución tampón HEPES </td><td > Invitrogen </td><td > 15630-080 </td><td ></td></tr><tr><td > KAPA HiFi ADN polimerasa </td><td > KAPA Biosystems </td><td > KK2101 </td><td ></td></tr><tr><td > LB caldo (caldo de lisogenia - Luria) en polvo </td><td > Difco </td><td > 240230 </td><td ></td></tr><tr><td > MISIÓN TRC ARNhc acciones glicerol bacteriana </td><td > Sigma </td><td ></td><td> ARNhc vectores </td></tr><tr><td > NCS (suero de ternera recién nacido) </td><td > Gemini Bio-productos </td><td > 100-504 </td><td ></td></tr><tr><td> PBS (solución buffer fosfato) </td><td > Invitrogen </td><td> 70011 </td><td > diluye a 1x en el agua </td></tr><tr><td > PE-α humana de anticuerpos IgM </td><td > BioLegend </td><td > 314508 </td><td ></td></tr><tr><td > PGS (penicilina-estreptomicina-glutamina solución) </td><td > Gemini Bio-Productos </td><td > 400-110 </td><td ></td></tr><tr><td> Polybrene (Hexadimetrina bromuro) </td><td > Sigma </td><td > 107689 </td><td > 10 mg / ml en agua </td></tr><tr><td > PureYield plásmido sistema Midiprep </td><td > Promega </td><td > A2495 </td><td></td></tr><tr><td> Puromicina </td><td> Sigma </td><td > P8833 </td><td > 250 pg / mL en el agua </td></tr><tr><td > QIAquick gel extracción kit </td><td > QIAGEN </td><td > 28706 </td><td ></td></tr><tr><td> Ramos (AR 1) las células </td><td > ATCC </td><td > CRL-1596 </td><td ></td></tr><tr><td > RPMI-1640 </td><td > Sigma </td><td > R8758 </td><td ></td></tr><tr><td > Superíndice II </td><td > Invitrogen </td><td > 18064-022 </td><td></td></tr><tr><td > SYBR RÁPIDO qPCR kit </td><td > KAPA Biosystems </td><td > KK4601 </td><td ></td></tr><tr><td > Taq ADN polimerasa </td><td > Invitrogen </td><td > 18038-042 </td><td ></td></tr><tr><td > TOPO TA kit de clonación </td><td > In vitrogeneración </td><td > K4520-01 </td><td ></td></tr><tr><td > TRIzol </td><td > Invitrogen </td><td > 15596-026 </td><td ></td></tr><tr><td > Asistente de purificación de ADN genómico SV sistema </td><td > Promega </td><td > A2361 </td><td ></td></tr><tr><td > X-Gal [5-bromo-4-cloro-3-β-indoyl-D-galatopyranoside] </td><td > Growcells </td><td > C-5687 </td><td > 40 mg / ml en DMSO </td></tr></tbody></table>

la evaluación de la hipermutación somática en ramos células b después de sobreexpresión o derribo de genes específicos

Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes

Las células B comienzan su vida con los anticuerpos de baja afinidad generado por V (D) J recombinación. Sin embargo, al detectar un patógeno, la variable (V) la región de una inmunoglobulina (Ig) del gen se encuentra mutado aproximadamente 100.000 veces más que el resto del genoma a través de hipermutación somática (SHM), resultando en una alta afinidad 1,2 anticuerpos. Además, la recombinación de cambio de clase (CSR) produce anticuerpos con diferentes funciones efectoras dependiendo del tipo de respuesta inmune que se necesita para un patógeno en particular. Tanto la RSE y SHM se inician por la citidina deaminasa inducida por activación (AID), que desamina residuos de citosina en el ADN para producir uracilos. Estos uracilos son procesados ​​por las formas propenso a errores de las vías de reparación, con el tiempo provocando mutaciones y recombinación 3.1. Nuestra actual comprensión de los detalles moleculares de SHM y RSE provienen de una combinación de estudios en ratones, las células primarias, las líneas celulares, y el F-Cellexperimentos de REE. Modelos de ratones siguen siendo el estándar de oro con nocauts genética que muestra un papel crítico para la reparación de muchos factores (por ejemplo, Ung, MSH2, MSH6, Exo1, y de la polimerasa η) 4-10. Sin embargo, no todos los genes se prestan a los estudios de octavos de final. Por ejemplo, golpes de gracia de varios de doble filamento romper las proteínas de reparación son embrionariamente letal o poner en peligro el desarrollo de células B 14/11. Por otra parte, a veces la función específica de una proteína en SHM o CSR pueden estar enmascarados por más defectos global causado por el golpe de gracia. Además, puesto que los experimentos en ratones pueden ser largos, alterando la expresión de genes individuales en las líneas celulares se ha convertido en un primer paso cada vez más popular para la identificación y caracterización de genes candidatos 15-18. Ramos - un linfoma de Burkitt línea celular que constitutivamente se somete a SHM - ha sido una popular línea celular modelo para estudiar SHM 18-24. Una de las ventajas de las células de Ramos es que tienen una semi-construido en práctica-Cuantitativa medida de SHM. Las células de tipo salvaje expresa IgM y, como recogen las mutaciones, algunas de las mutaciones eliminar la expresión de IgM. Por lo tanto, analizando la pérdida de IgM mediante el escaneo de células activadas por fluorescencia (FACS) proporciona una rápida lectura para el nivel de SHM. Una medición más cuantitativa de la SHM se puede obtener por secuenciación directa de los genes de anticuerpos. Dado que las células Ramos son difíciles de transfectar, producimos derivados estables que han aumentado o reducido la expresión de un gen individual al infectar las células con las construcciones retrovirales o lentiviral que contienen un casete de sobreexpresión o una corta horquilla de ARN (siRNA), respectivamente. Aquí se describe la forma en que infectan a las células Ramos y luego utilizar estas células para investigar el papel de genes específicos en el SHM (Figura 1).

Se describe cómo realizar las infecciones por retrovirus o lentivirus de la sobreexpresión o siRNA que contienen las construcciones en la línea de Ramos humanos de células B y la forma de medir la hipermutación somática en estas células.

La evaluación de la hipermutación somática en Ramos células B después de sobreexpresión o derribo de genes específicos

Las células B comienzan su vida con anticuerpos de baja afinidad generados mediante la recombinación V(D)J. Sin embargo, al detectar un patógeno, la región variable (V) de un...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en modificar la expresión de un gen y luego medir su impacto en la hipermutación somática. Esto se logra transfectando células Bosque 23 para producir partículas virales que contienen ya sea un constructo de sobreexpresión o uno que incluye SHRA. Como segundo paso, las células ramo se infectan con los virus, lo que resulta en la inhibición o sobreexpresión del gen de interés.A continuación, los clones de células individuales se cultivan durante varias semanas para permitir que las células acumulen mutaciones. Finalmente, el efecto de la expresión génica alterada puede determinarse mediante el análisis de la pérdida de IgM y la secuenciación de los genes IG. Este método podría ayudar a identificar nuevos factores implicados en la diversificación de anticuerpos.Comience citando 600 microlitros de DMEM tibio y suplementado en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros. Luego, tenga cuidado de pipetear directamente en el medio 30 microlitros de FUgene seis en el tubo, vortexee la solución durante menos de un segundo y, a continuación, incube el tubo a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, para una infección lentiviral como esta, añada seis microgramos del constructo S-H-R-N-A y 1,5 microgramos de cada uno de P-V-S-V-G-P-M-D-L-G-P-R-R-E y PRSV rev a la mezcla de DMEM con FUgene seis.Vortex la solución brevemente y luego incubar las dos horas a temperatura ambiente, esta vez durante 25 minutos. Finalmente, transfectar un cultivo celular Bosque 23 con 50 a 60 % de confluencia con el gen D-N-A-D-M-E-M FU seis. Mezclar e incubar las células a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono durante 24 horas.Al día siguiente, añada cinco mililitros de DMEM a las células y devuélvalas al incubador durante otras 24 horas. Al tercer día después de la transfección, utilice una jeringa de 10 mililitros para recoger 10 mililitros de medio de la caja de células transfectadas 23, y luego coloque un filtro de 0,45 micrómetros en el extremo de la jeringa. Recoja el medio filtrado en un tubo de polipropileno limpio de 15 mililitros. 24 horas antes de la infección, siembre dos mililitros de dos veces 10 a la quinta células por mililitro de células ramo en RPMI completo en una placa de seis pocillos. Al día siguiente, añada tres microlitros de una solución de polibreno de 10 microgramos por mililitro y un mililitro de virus a las células ramo, y mezcle bien la suspensión celular mediante pipeteo.Para el control no infectado, agregue un mililitro de RPMI completo y tres microlitros de poli cerebro a uno de los pocillos en lugar del virus. Además, infecte un pocillo con un control negativo emparejado y otro con un vector que contenga GFP para determinar la eficiencia de infección mediante fax. Ahora, centrifugue la placa de seis pocillos a 3000 GS durante 90 minutos a temperatura ambiente y luego devuelva la placa al incubador durante 48 horas.Finalmente, centrifugue las células infectadas en un tubo de polipropileno de 15 mililitros a 400 G durante cuatro minutos a temperatura ambiente, luego aspire el medio asegurándose de no perturbar el sedimento celular y re suspenda las células en RPMI fresco. Después de contar las células, utilice una alícuota de las células infectadas para obtener una concentración de 10 células por mililitro.En una solución de medio condicionado RPMI y SFB hasta un volumen final de 10 mililitros para cada placa sembrada. Luego, utilice una pipeta multicanal para sembrar placas de 96 pozos con 100 microlitros por pozo de las células diluidas.Después de incubar las placas durante 24 horas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono, utilice un microscopio para revisar cada pocillo individual. Para confirmar la presencia de células, ya que la profundidad adecuada para identificar células individuales puede ser difícil de determinar. Primero, intente enfocar los números de los pocillos impresos en la parte inferior de la placa de 96 pocillos.Luego, intente buscar una célula después de dos semanas. Busque colonias celulares a lo largo de los bordes de las pocillos utilizando tinta permanente. Marque los pocillos con crecimiento celular robusto y luego transfiera las colonias a placas de 24 pocillos en un mililitro de RPMI para una incubación adicional.Después de varios días de crecimiento, transfiera las células a una placa de seis pocillos y continúe incubando los cultivos. Tres semanas después de sembrar las colonias celulares en la placa de seis pocillos Eloqua, cinco veces 10 a la quinta células de cada pocillo a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros. En este momento, también recolecte las células de cada uno de los pocillos de control y con silenciamiento de HRNA, así como una muestra para un control sin tinción.Ahora centrifugue todas las células a 400 G durante cuatro minutos a temperatura ambiente, lavando las células dos veces con un mililitro de PBS para la segunda centrifugación. Después del segundo lavado, suspendemos el pellet de control sin teñir en 50 microlitros de PBS y los otros pellets en PBS más una dilución 1:20 del anticuerpo anti-IgM humano marcado con PE. A continuación, incube todas las muestras celulares en hielo durante una hora tras lavar las células dos veces más con PBS como antes, deseche el sobrenadante y re suspenda todos los pellets en 100 microlitros de PBS.A continuación, transfiera las células teñidas resuspendidas y las células de control sin teñir a tubos FACS y luego analice las células mediante citometría de flujo. Compare el porcentaje de células negativas para IgM de los controles frente a las células con silenciamiento de S-H-R-N-A. Se transfectó un vector retroviral de sobreexpresión para un ID en células Bosque 23.Posteriormente, se cosecharon los virus y se utilizaron para infectar células Ramos, tanto del tipo salvaje (wt) como con sobreexpresión de a ID. Las células a ID.High se sembraron individualmente y se cultivaron durante tres semanas, momento en el cual se analizó la expresión génica mediante RT-PCR cuantitativa. Como era de esperar, los resultados de la RT-PCR cuantitativa muestran un aumento notable en la expresión de a ID tras la infección de las células con un vector de sobreexpresión de a ID. La pérdida de IgM en las células infectadas también se evaluó mediante citometría de flujo. La IgM de superficie se midió por citometría de flujo a las tres semanas, según se muestra en la figura anterior, y se calculó el porcentaje de pérdida de IgM para las células de tipo salvaje y las células con alto nivel de a ID, representándose gráficamente aquí. Como era de esperar, las células que sobreexpresan a ID exhibieron una mayor pérdida de IgM de superficie.En un experimento independiente, se generaron lentivirus que contenían ya sea un ARNsh irrelevante como control o un ARNsh dirigido contra un factor de reparación del ADN de alta fidelidad que se espera que proteja frente a la HMS, en células bosque 23. Luego, los lentivirus se utilizaron para infectar un clon a ID alto de células Ramos. Nuevamente, se analizó la expresión génica y, una vez más, como se esperaba, se observó una disminución en los niveles del factor de reparación del ADN en presencia del ARNsh dirigido contra dicho factor. Además, tras tres semanas se analizó la pérdida de IgM en los clones monoclonales, ya que se considera que el factor proporciona protección contra las mutaciones durante la HMS; por lo tanto, en ausencia del factor ocurre un aumento en la pérdida de IgM y en la HMS, tal como puede observarse en esta figura.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar infecciones virales con constructos que contengan SOBREEXPRESIÓN o S-H-R-N-A en la línea celular de linfocitos B RAW, y luego cómo medir la hipermutación somática en estas células.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

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