La evaluación de la hipermutación somática en Ramos células B después de sobreexpresión o derribo de genes específicos

El objetivo general del siguiente experimento consiste en modificar la expresión de un gen y luego medir su impacto en la hipermutación somática. Esto se logra transfectando células Bosque 23 para producir partículas virales que contienen ya sea un constructo de sobreexpresión o uno que incluye SHRA. Como segundo paso, las células ramo se infectan con los virus, lo que resulta en la inhibición o sobreexpresión del gen de interés.

A continuación, los clones de células individuales se cultivan durante varias semanas para permitir que las células acumulen mutaciones. Finalmente, el efecto de la expresión génica alterada puede determinarse mediante el análisis de la pérdida de IgM y la secuenciación de los genes IG. Este método podría ayudar a identificar nuevos factores implicados en la diversificación de anticuerpos.

Comience citando 600 microlitros de DMEM tibio y suplementado en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros. Luego, tenga cuidado de pipetear directamente en el medio 30 microlitros de FUgene seis en el tubo, vortexee la solución durante menos de un segundo y, a continuación, incube el tubo a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, para una infección lentiviral como esta, añada seis microgramos del constructo S-H-R-N-A y 1,5 microgramos de cada uno de P-V-S-V-G-P-M-D-L-G-P-R-R-E y PRSV rev a la mezcla de DMEM con FUgene seis.

Vortex la solución brevemente y luego incubar las dos horas a temperatura ambiente, esta vez durante 25 minutos. Finalmente, transfectar un cultivo celular Bosque 23 con 50 a 60 % de confluencia con el gen D-N-A-D-M-E-M FU seis. Mezclar e incubar las células a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono durante 24 horas.

Al día siguiente, añada cinco mililitros de DMEM a las células y devuélvalas al incubador durante otras 24 horas. Al tercer día después de la transfección, utilice una jeringa de 10 mililitros para recoger 10 mililitros de medio de la caja de células transfectadas 23, y luego coloque un filtro de 0,45 micrómetros en el extremo de la jeringa. Recoja el medio filtrado en un tubo de polipropileno limpio de 15 mililitros. 24 horas antes de la infección, siembre dos mililitros de dos veces 10 a la quinta células por mililitro de células ramo en RPMI completo en una placa de seis pocillos. Al día siguiente, añada tres microlitros de una solución de polibreno de 10 microgramos por mililitro y un mililitro de virus a las células ramo, y mezcle bien la suspensión celular mediante pipeteo.

Para el control no infectado, agregue un mililitro de RPMI completo y tres microlitros de poli cerebro a uno de los pocillos en lugar del virus. Además, infecte un pocillo con un control negativo emparejado y otro con un vector que contenga GFP para determinar la eficiencia de infección mediante fax. Ahora, centrifugue la placa de seis pocillos a 3000 GS durante 90 minutos a temperatura ambiente y luego devuelva la placa al incubador durante 48 horas.

Finalmente, centrifugue las células infectadas en un tubo de polipropileno de 15 mililitros a 400 G durante cuatro minutos a temperatura ambiente, luego aspire el medio asegurándose de no perturbar el sedimento celular y re suspenda las células en RPMI fresco. Después de contar las células, utilice una alícuota de las células infectadas para obtener una concentración de 10 células por mililitro.

En una solución de medio condicionado RPMI y SFB hasta un volumen final de 10 mililitros para cada placa sembrada. Luego, utilice una pipeta multicanal para sembrar placas de 96 pozos con 100 microlitros por pozo de las células diluidas.

Después de incubar las placas durante 24 horas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono, utilice un microscopio para revisar cada pocillo individual. Para confirmar la presencia de células, ya que la profundidad adecuada para identificar células individuales puede ser difícil de determinar. Primero, intente enfocar los números de los pocillos impresos en la parte inferior de la placa de 96 pocillos.

Luego, intente buscar una célula después de dos semanas. Busque colonias celulares a lo largo de los bordes de las pocillos utilizando tinta permanente. Marque los pocillos con crecimiento celular robusto y luego transfiera las colonias a placas de 24 pocillos en un mililitro de RPMI para una incubación adicional.

Después de varios días de crecimiento, transfiera las células a una placa de seis pocillos y continúe incubando los cultivos. Tres semanas después de sembrar las colonias celulares en la placa de seis pocillos Eloqua, cinco veces 10 a la quinta células de cada pocillo a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros. En este momento, también recolecte las células de cada uno de los pocillos de control y con silenciamiento de HRNA, así como una muestra para un control sin tinción.

Ahora centrifugue todas las células a 400 G durante cuatro minutos a temperatura ambiente, lavando las células dos veces con un mililitro de PBS para la segunda centrifugación. Después del segundo lavado, suspendemos el pellet de control sin teñir en 50 microlitros de PBS y los otros pellets en PBS más una dilución 1:20 del anticuerpo anti-IgM humano marcado con PE. A continuación, incube todas las muestras celulares en hielo durante una hora tras lavar las células dos veces más con PBS como antes, deseche el sobrenadante y re suspenda todos los pellets en 100 microlitros de PBS.

A continuación, transfiera las células teñidas resuspendidas y las células de control sin teñir a tubos FACS y luego analice las células mediante citometría de flujo. Compare el porcentaje de células negativas para IgM de los controles frente a las células con silenciamiento de S-H-R-N-A. Se transfectó un vector retroviral de sobreexpresión para un ID en células Bosque 23.

Posteriormente, se cosecharon los virus y se utilizaron para infectar células Ramos, tanto del tipo salvaje (wt) como con sobreexpresión de a ID. Las células a ID.High se sembraron individualmente y se cultivaron durante tres semanas, momento en el cual se analizó la expresión génica mediante RT-PCR cuantitativa. Como era de esperar, los resultados de la RT-PCR cuantitativa muestran un aumento notable en la expresión de a ID tras la infección de las células con un vector de sobreexpresión de a ID. La pérdida de IgM en las células infectadas también se evaluó mediante citometría de flujo. La IgM de superficie se midió por citometría de flujo a las tres semanas, según se muestra en la figura anterior, y se calculó el porcentaje de pérdida de IgM para las células de tipo salvaje y las células con alto nivel de a ID, representándose gráficamente aquí. Como era de esperar, las células que sobreexpresan a ID exhibieron una mayor pérdida de IgM de superficie.

En un experimento independiente, se generaron lentivirus que contenían ya sea un ARNsh irrelevante como control o un ARNsh dirigido contra un factor de reparación del ADN de alta fidelidad que se espera que proteja frente a la HMS, en células bosque 23. Luego, los lentivirus se utilizaron para infectar un clon a ID alto de células Ramos. Nuevamente, se analizó la expresión génica y, una vez más, como se esperaba, se observó una disminución en los niveles del factor de reparación del ADN en presencia del ARNsh dirigido contra dicho factor. Además, tras tres semanas se analizó la pérdida de IgM en los clones monoclonales, ya que se considera que el factor proporciona protección contra las mutaciones durante la HMS; por lo tanto, en ausencia del factor ocurre un aumento en la pérdida de IgM y en la HMS, tal como puede observarse en esta figura.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar infecciones virales con constructos que contengan SOBREEXPRESIÓN o S-H-R-N-A en la línea celular de linfocitos B RAW, y luego cómo medir la hipermutación somática en estas células.