Name: Trasplante de células madre en un In vitro Simulación de isquemia / reperfusión modelo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Aprende a establecer un modelo in vitro de isquemia/reperfusión para evaluar la terapia con células madre mesenquimales en células cardíacas dañadas. Este protocolo permite analizar la viabilidad celular y las interacciones mediante microscopía confocal y citometría de flujo.

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Este trabajo fue apoyado por OTKA (Fondo de Investigación Científica de Hungría) D45933, T049621, TET (húngaro Fundación de Ciencia y Tecnología) A4/04, Arg-17/2006 y el SIN, Bolyai, Becas y Öveges TÁMOP 4.2.2-08 / 1 / KMR-2008-0004 y 4.2.1 / B 09/1/KMR-2010-0001. OTKA 83803. Nos gustaría dar las gracias a William Gesztes para proporcionar la voz en off.

1. Preparación de las células H9c2 cardiomyoblast H9c2 cardiomyoblasts rata se obtuvieron de ATCC (Wesel, Alemania) y ampliado en el alto nivel de glucosa (4,5 g / L) DMEM con 10% de suero fetal bovino, 4 mM L-glutamina, 100 U / ml de penicilina y estreptomicina 100 mg / ml. La línea de mioblastos H9c2 células se deriva de corazón de rata embrionaria, que se utiliza como un modelo in vitro para ambos músculo esquelético y cardíaco 8,9. Prepare 12 y placa de células H9c2: <ol><li> Quitar medio de cultivo de una placa de Petri de células H9c2. </li><li> Lavar las células dos veces con 5 ml de PBS y digerir con 2-3 ml de 0,05% de tripsina / EDTA. </li><li> Colocar placa de Petri durante 5 minutos en la incubadora a 37 ° C. </li><li> Inhibir la tripsina con 10 ml de medio de cultivo DMEM. </li><li> Centrifugar las células a 1200 rpm durante 8 minutos. </li><li> Después de la eliminación de las células sobrenadante, resuspender en 1 ml de medio de cultivo DMEM y las células cuentan con hemocitómetro utilizando tinción con azul tripán.</li><li> Semillas de 30.000 H9c2 células en 2 ml de DMEM por pocillo en una placa de 12 también. </li><li> Colocar la placa en los 37 ° C incubadora de CO 2 durante 24 horas. </li></ol> 2. Isquemia simulada / reperfusión Isquemia / reperfusión fue simulada in vitro mediante la realización de la privación de oxígeno la glucosa (OGD) en cultivos de células H9c2. Este procedimiento se realizó en la platina del microscopio confocal Zeiss con el sistema de incubación de células PECON (Erbach, Alemania), que permite la observación de las células durante la OGD. <ol><li> Quitar medio por aspiración de 12 pocillos de células H9c2. </li><li> Lavar las células dos veces con PBS. </li><li> Añadir 3 ml de medio de glucosa libre por pozo. </li><li> Colocar la placa en el sistema de incubación de células. </li><li> Inicio de gas nitrógeno para purgar el oxígeno fuera del sistema de incubación. </li><li> Espere hasta que el nivel de oxígeno llega a 0,5% luego iniciar el temporizador. 0,5% de oxígeno significa aproximadamente 3 mmHg la tensión parcial. Células sujetas a una50 minutos de isquemia simulada. </li><li> Al final de la isquemia simulada, eliminar el medio de glucosa libre de las células. </li><li> Pipetear 2 ml de medio de cultivo normal de los pozos. </li><li> Coloque la placa de 12 pocillos durante 30 minutos en los 37 ° C incubadora de CO 2, lo que es el &quot;período de reperfusión&quot;. </li></ol> 3. Preparación de las células madre mesenquimales de rescate La médula ósea de origen humano se ha tenido en frascos T75 y se diluye con medio modificado de Dulbecco Eagle (DMEM) medio de cultivo con 10% de suero fetal bovino (FCS), 100 de penicilina U / ml y 100 estreptomicina mg / ml, 4 mM L-glutamina y 1 g / l de glucosa. Los matraces se incubaron a 37 º C en una atmósfera completamente humidificada de 5% de CO 2 durante 3 días. Después del período de incubación de la BMSCs adherida a la superficie de los frascos y los restantes componentes de la médula ósea se han eliminado mediante el lavado con PBS. El BMSCs utilizados fueron entre 1 y 5 pasajes en los experimentos. La identidadtidad de las células fue confirmado por la presencia del linaje de los marcadores específicos de la superficie celular por citometría de flujo. Hematopoyéticas linaje específico de los marcadores de superficie (CD34, CD45) y marcadores mesenquimales de la superficie (CD73, CD90, CD105 y CD166) fueron investigados. Durante la isquemia simulada, preparar las células madre mesenquimales de rescate para el trasplante. <ol><li> Diluir el colorante fluorescente Vybrant hizo en relación 1:200 en medio de cultivo DMEM. </li><li> Aspirar medio de las células de rescate y añadir 300 l DMEM con Vybrant DID. </li><li> Colocar placa de Petri durante 30 minutos en los 37 ° C incubadora de CO 2. </li><li> Quitar medio de cultivo de una placa de Petri de células madre mesenquimales. </li><li> Lavar las células dos veces con 5 ml de PBS y digerir con 2-3 ml de 0,05% de tripsina / EDTA. </li><li> Colocar placa de Petri durante 5 minutos en la incubadora a 37 ° C. </li><li> Inhibir la tripsina con 10 ml de medio de cultivo DMEM. </li><li> Centrifugar las células a 1200 rpm durante 8 minutos. </li><li> Después de retirar la supecélulas rnatant, resuspender en 1 ml de medio de cultivo DMEM y las células cuentan con hemocitómetro utilizando tinción con azul tripán. </li><li> Después de 30 minutos al final de la reperfusión añadir 20.000 células madre mesenquimales por tanto a la post-isquémica cardiaca H9c2 mioblastos. </li><li> Lugar de co-cultivo de células en los 37 ° C incubadora de CO 2 durante 24 horas. </li></ol> 4. Análisis con microscopía confocal Después de la simulación de la isquemia / reperfusión, las células se incubaron en medio de cultivo normal durante 24 horas. <ol><li> Después de 24 horas, lave las células dos veces con PBS. </li><li> Tinción de las células en 500 l en vivo / muerto solución colorante durante 30 minutos (5 nM calceína y 400 Nm de etidio-homodímero-2 en PBS) (5x10 4 células / ml). </li></ol> La evaluación de las imágenes de confocal de las células vivas y muertas, seleccionados por la morfología y la fluorescencia se puede realizar con el software ImageJ (National Institutes of Health, EE.UU.). En el caso de co-las culturas, las MSC se pueden distinguir de las células H9c2 debido a su etiquetado Vybrant celular DID. La proporción de células muertas pueden ser evaluados en cuatro campos de vista independiente (objetivo 10x) para cada cultura a ciegas 10. H9c2 cardiomyoblasts cultivadas en cubreobjetos de 42 mm de cristal también puede ser investigado con el microscopio de vídeo lapso de tiempo durante y después de la lesión por isquemia / reperfusión mediante el sistema de incubación de células del microscopio confocal. Célula a célula de las interacciones, como la fusión celular y la formación de los nanotubos intercelulares, se pueden estudiar a través del tiempo. 5. Análisis por citometría de flujo Después de la simulación de la isquemia / reperfusión, las células se incubaron en medio de cultivo normal durante 24 horas. <ol><li> Después de 24 horas, la cosecha de los medios de cultivo. Es muy importante para recoger el medio de cultivo también porque algunas células muertas podría haber desprendido de la superficie de la placa de cultivo durante la incubación de 24 horasción. </li><li> Lavar las células dos veces con PBS y se digieren con 0,05% de tripsina-EDTA. </li><li> Inhibir la tripsina con medio de cultivo DMEM. </li><li> Centrifugar las células y el medio de cultivo cosechado a 1200 rpm (aproximadamente 150-200g) durante 8 minutos. </li><li> Eliminar el sobrenadante. </li><li> Suspender las células en 500 l en vivo / muerto solución colorante durante 30 minutos (5 nM calceína y 400 Nm de etidio-homodímero-2 en PBS) (5x10 4 células / ml). </li><li> La transferencia de las células de los tubos de flujo de citometría. </li><li> Inicie el software Pro CellQuest. </li><li> Para configurar el citómetro de flujo para la medición, el control de preparar muestras de células vivas y muertas. <ol class="lalpha"><li> Placa H9c2 células a una densidad de 3x10 4 en placas de 12 pocillos como se describe en el punto 1. </li><li> Prepare vivir controles de células con tripsinización solo como se describe en el punto 1. </li><li> Preparar los controles de las células muertas por el tratamiento con 10 mM H 2 O 2 durante 1 hora. </li><li> Después de tripsinización, resuspend vivir y los controles de las células muertas en la solución de 500 l tinte vivo / muerto (5 nM calceína-AM y 400 Nm de etidio-homodímero-2 en PBS). </li></ol></li><li> La configuración del instrumento se debe ajustar para que las células vivientes son calceína positivo y negativo homodímero de etidio, mientras que las células muertas son calceína negativos y positivos homodímero de etidio. </li><li> El porcentaje de estas poblaciones puede expresarse como barras en un gráfico y el análisis estadístico se pueden realizar en estos valores. </li><li> Medir los diferentes grupos experimentales. </li></ol> 6. Los resultados representativos: Nuestros resultados mostraron que añadir las células madre mesenquimales podrían mejorar la supervivencia de las células cardíacas postisquémica. Imágenes de microscopía confocal reveló directa de célula a célula interacciones, como la conexión a la membrana parcial o nanotubos intercelulares, lo que probablemente juegan un papel importante en la protección observada 10. Estos nanotubos abarcan distancias de varias células diameters, y sus diámetros son entre 200 y 500 nm (flechas blancas). <img src="/files/ftp_upload/3575/3575fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. La formación de nanotubos de entre las células. Formación de nanotubos (flecha blanca) se observó entre Vybrant cardiomyoblasts DiO etiquetados y marcados Vybrant SABÍA células madre mesenquimales. Análisis de citometría de flujo mostró las poblaciones de sobrevivir y cardiomyoblasts necrótico y las células madre mesenquimales. Curiosamente, también se observó una población cardiomyoblast tercero, &#39;herido&#39; de células que contiene calceína, pero también contiene el indicador de las células muertas, homodímero de etidio (Figura 2). <img src="/files/ftp_upload/3575/3575fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Representante punto de parcelas de los diferentes poblaciones de células después de la isquemia simulada. La evaluación de varios experimentos showed que la adición de células madre mesenquimales a postisquémica cardiomyoblast H9c2 aumentó significativamente el porcentaje de células vivas en comparación con los mioblastos cardiacos cultivadas solo después de la isquemia (Figura 3). <img src="/files/ftp_upload/3575/3575fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. . Efecto del tratamiento con células madre en cardiomyoblasts postisquémica porcentaje de las células vivas se redujo significativamente después de la isquemia simulada en comparación con el control (control vs modelo IR: 90,36 ± 2,60 vs 10,52 ± 0,48, *** p&gt; 0,001), que aumentó después de la adición de células madre mesenquimales (IR modelo vs IR + BMSC: 10,52 ± 0,48 vs 25,21 ± 2,13, *** p&gt; 0,001). Los datos representan la media ± SEM. El análisis estadístico de los datos se realizó mediante un análisis de varianza con el mensaje comparación múltiple de Tukey hoc test.

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<li>Lim, Y. J., Zheng, S., Zuo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphine+Preconditions+Purkinje+Cells+against+Cell+Death+under+In+Vitro+Simulated+Ischemia%2FReperfusion+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Morphine Preconditions Purkinje Cells against Cell Death under In Vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Conditions.</a> Anesthesiology. 100, 562-562 (2004).</li>
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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El protocolo se ha demostrado un enfoque in vitro a la cuestión mucho más compleja de la terapia celular en infarto de miocardio, con todas las ventajas y desventajas de este modelo. Obviamente, no puede reflejar el complejo (inmunológicos, por ejemplo) los acontecimientos que ocurren durante y después del infarto de miocardio, pero puede centrarse en los efectos directos de las células añadido en las células postisquémica. Los efectos de la isquemia simulada en H9c2 cardiomyoblasts dependen en gran medida el momento de...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> calceína-AM </td><td> Las sondas moleculares </td><td> L3224, C3099 </td><td> <a href="http://www.invitrogen.com">http://www.invitrogen.com</a> </td></tr><tr><td> homodímero de etidio-2 </td><td> Las sondas moleculares </td><td> L3224, E3599 </td><td> <a href="http://www.invitrogen.com">http://www.invitrogen.com</a> </td></tr><tr><td> ¿SABÍA Vybrant </td><td> Las sondas moleculares </td><td> V22887 </td><td> <a href="http://www.invitrogen.com">http://www.invitrogen.com</a> </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Reactivos. <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del equipo </td><td> Empresa </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Celular PECON incubación sistema de microscopios Zeiss </td><td> PECON GmbH </td><td> <a href="http://www.pecon.biz/">www.pecon.biz/</a> </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Equipo.

trasplante de células madre en un in vitro simulación de isquemia / reperfusión modelo

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

El trasplante de células madre protocolos están encontrando su camino en la práctica clínica 1,2,3. Obtener mejores resultados, por lo que los protocolos más robustos, y la búsqueda de nuevas fuentes de células implantables son el foco de las investigaciones recientes 4,5. La investigación de la eficacia de las terapias con células no es una tarea fácil y se necesitan nuevas herramientas para investigar los mecanismos implicados en el proceso de tratamiento 6. Hemos diseñado un protocolo experimental de isquemia / reperfusión con el fin de permitir la observación de las conexiones celulares y los mecanismos subcelulares incluso durante la lesión por isquemia / reperfusión y después del trasplante de células madre y para evaluar la eficacia de la terapia celular. H9c2 células cardiomyoblast se colocaron en placas de cultivo celular 7,8. La isquemia se simuló con 150 minutos en un medio de glucosa libre con el nivel de oxígeno por debajo del 0,5%. Entonces, los medios de comunicación normales y los niveles de oxígeno se volvieron a introducir para simular la reperfusión. Después de la falta de oxígeno la glucosa,las células dañadas fueron tratados con trasplante de médula ósea humana etiquetados derivados de células madre mesenquimales mediante su inclusión en la cultura. Las células madre mesenquimales son las preferidas en los estudios clínicos porque son de fácil acceso con la cirugía mínimamente invasiva, ampliable fácilmente y autólogo. Después de 24 horas de co-cultivo, las células fueron teñidas con calceína y homodímero de etidio-para diferenciar entre células vivas y muertas. Esta configuración nos permite investigar las conexiones intercelulares mediante microscopía confocal de fluorescencia y para cuantificar la tasa de supervivencia de las células postisquémica por citometría de flujo. La microscopía confocal mostraron las interacciones de las dos poblaciones de células, como la fusión celular y la formación de los nanotubos intercelulares. Análisis de citometría de flujo reveló tres grupos de células dañadas que se pueden representar en un gráfico y se analizaron estadísticamente. Estas poblaciones pueden ser investigados por separado y se pueden sacar conclusiones sobre estos datos sobre la eficacia de la simulaciónenfoque terapéutico.

Demostramos cómo configurar un<em&gt; In vitro</em&gt; Isquemia / reperfusión modelo y la forma de evaluar el efecto de la terapia con células madre en células cardíacas postisquémica.

Trasplante de células madre en un In vitro Simulación de isquemia / reperfusión modelo

Los protocolos de trasplante de células madre se están incorporando a la práctica clínica1,2,3. Para obtener mejores resultados, hacer que los protocolos sean más robustos y...

Las células derivadas del corazón se colocan en placas de cultivo celular para simular isquemia. El modelo de reperfusión isquémica se logra con 150 minutos en un medio sin glucosa, mientras el nivel de oxígeno está por debajo del 0,5%. Este período isquémico provoca la contracción y la formación de blebs en la mayoría de las células. Luego, se reintroducen niveles normales de medio y de oxígeno para simular la reperfusión.Se añaden células madre mesenquimales y se cultivan junto con las células dañadas. Después de 24 horas de co-cultivo, las células se tiñen con calcio y homodímero de etidio para diferenciar entre células vivas y muertas. Mediante microscopía confocal, se observa claramente la presencia de dos poblaciones celulares y sus interacciones. El análisis mediante citometría de flujo revela tres agrupamientos de células dañadas, que pueden representarse en una gráfica y analizarse estadísticamente. El trasplante de células madre. Los protocolos están incorporándose a la práctica clínica; obtener mejores resultados, hacer que los protocolos sean más robustos y encontrar nuevas fuentes de células implantables son el enfoque de la investigación reciente.Investigar la eficacia de las terapias celulares no es una tarea sencilla y se necesitan nuevas herramientas para estudiar los mecanismos implicados en el proceso de tratamiento. Diseñamos un protocolo experimental con el fin de permitir la observación de conexiones celulares e incluso mecanismos subcelulares durante la isquemia, la lesión por reperfusión y tras el trasplante de células madre. Nuestros criterios de diseño, nuestro sistema completamente in vitro, pero solo están presentes las células huésped y las células donantes.Por lo tanto, se aísla del tejido circundante. Medición continua de la viabilidad celular antes, durante y después de la lesión durante un período de hasta 24 horas. E identificación clara de ambas poblaciones celulares para poder rastrear el destino de las células injertadas.Con el fin de alcanzar este objetivo, establecimos un protocolo de privación de oxígeno y glucosa, comúnmente abreviado como OGD, seguido de un período de reoxigenación. Nuestra elección de células huésped fueron células C2C12, una línea celular conocida de mioblastos cardíacos rojos. Después del OGD, las células dañadas fueron tratadas mediante el trasplante de células madre mesenquimales derivadas de médula ósea, añadiéndolas al cultivo.Este montaje nos permitió investigar las conexiones intercelulares mediante microscopía confocal y cuantificar la tasa de supervivencia de células dañadas mediante citometría de flujo. Comencemos a trabajar y veamos cómo lo hacemos. Retire el medio de cultivo de las células H nine C two.Lave las células dos veces con PBS y digiera con tripsina-EDTA al 0,05 % colocando las placas de Petri durante cinco minutos. En un incubador a 37 grados, inhiba la tripsina con medio de cultivo DMEM. Centrifugue las células a 1200 RPM durante ocho minutos.Tras eliminar el sobrenadante, resuspenda las células en un milímetro de medio de cultivo DMEM, cuente las células con un hemocitómetro utilizando tinción con azul de tripano: 30.000 células H9c2 por pocillo. En una placa de 12 pocillos, coloque la placa en el incubador de dióxido de carbono a 37 grados durante 24 horas. Retire el medio mediante aspiración y lave las células dos veces con PBS.Añada tres milímetros de medio sin glucosa. Coloque la placa en el sistema de incubación celular. Inicie el flujo de gas nitrógeno para eliminar el oxígeno del sistema de incubación.Espere hasta que el nivel de oxígeno alcance el 0,5 %. Luego inicie el cronómetro; un 0,5 % de oxígeno equivale aproximadamente a tres milímetros de mercurio de tensión parcial. Somete las células a 150 minutos de isquemia simulada. Durante la isquemia, las células se desprenden de la superficie y sus membranas comienzan a formar blebs. Descubrimos que cada población requiere longitudes de tiempo ligeramente diferentes para alcanzar una viabilidad celular del 60 al 80 %.Por eso sugerimos comenzar con la incubación de dos R. Y si no es suficiente, aumentar el tiempo de DGO. En nuestro caso, las células C2 de nueve días típicamente necesitan de 150 a 70 minutos de DGO al final de la isquemia simulada.Retire el medio sin glucosa de las células y agregue medio de cultivo normal a los pocillos. Incube una placa de 12 pocillos durante 30 minutos en el incubador de dióxido de carbono a 37 grados. Este es el período de reperfusión.Durante la isquemia simulada, prepare las células de rescate para el trasplante. Diluya la dieta fluorescente, DID vívido, en una proporción de uno a 200 en medio de cultivo DMEM. Aspire el medio de las células de rescate y agregue 300 microlitros de DMEM del plato de Petri Brent Place vívido durante 30 minutos en el incubador de dióxido de carbono a 37 grados.Después de 30 minutos al final de la reperfusión, añada mil células madre mesenquimales por pocillo a los mioblastos cardíacos H nine C two posisquémicos. Los pasos iniciales son los mismos que la siembra de H nine C two: lavado dos veces con PBS, tripsinización y recuento. Incube el cultivo conjunto de células en un incubador con dióxido de carbono a 37 grados durante 24 horas.Después de 24 horas, recolecte el medio de cultivo y las células adheridas de los pocillos con ization. Es muy importante recolectar también el medio de cultivo porque algunas células muertas podrían haberse desprendido de la superficie del recipiente de cultivo durante la incubación de 24 horas.Suspenda las células en 500 microlitros de solución de células vivas, muertas y en muerte, cinco NMO de calcio y 400 NMO de homodímero de Ethereum en PBS cinco veces 10 a la potencia de cuatro células por mililitro. En el caso de cultivos conjuntos, las células madre mesenquimales se distinguen de las células H nine C dos mediante la marcación fluorescente específica de cada tipo celular. De este modo, es posible detectar la fusión celular y los sitios de contacto entre célula y célula.La proporción de células muertas puede evaluarse en cuatro campos independientes utilizando un objetivo de 10 aumentos para cada cultivo de forma ciega, lo que proporciona un resultado reproducible del recuento celular. Transfiera las células a tubos para citometría de flujo. Inicie el software Cell Quest Pro para configurar el citómetro de flujo para la medición.Prepare muestras control de células vivas y muertas. Las células vivas se cultivan a la misma densidad en condiciones normales y se tiñen con calcio. Las células muertas se preparan con un tratamiento de una hora con 10 micromoles de peróxido de hidrógeno teñido con etidio, homodímero, y se recolectan de la misma manera; los parámetros del instrumento deben ajustarse para que las células vivas sean positivas para calcio y negativas para el homodímero de etidio.Aunque las células muertas son negativas para calcio y positivas para homodímero de etidio, el porcentaje de estas poblaciones puede expresarse como barras en una gráfica y se puede realizar un análisis estadístico con estos valores. Descubrimos que la adición de células madre sanas aumenta la proporción de células sobrevivientes en la población. Curiosamente, también observamos que las células que se salvaron tras la lesión pueden separarse mediante citometría no solo de las células muertas, sino también de aquellas que permanecieron vivas.Consideramos que esta población requiere investigaciones adicionales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar experimentos de isquemia simulada con trasplante de células madre in vitro de manera estandarizada. Eso es todo.Gracias por ver el video y buena suerte con sus experimentos. Si tiene alguna pregunta técnica, no dude en contactarnos. Estaremos disponibles para ayudarle.

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Investigación

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