Trasplante de células madre en un In vitro Simulación de isquemia / reperfusión modelo

Las células derivadas del corazón se colocan en placas de cultivo celular para simular isquemia. El modelo de reperfusión isquémica se logra con 150 minutos en un medio sin glucosa, mientras el nivel de oxígeno está por debajo del 0,5%. Este período isquémico provoca la contracción y la formación de blebs en la mayoría de las células. Luego, se reintroducen niveles normales de medio y de oxígeno para simular la reperfusión.

Se añaden células madre mesenquimales y se cultivan junto con las células dañadas. Después de 24 horas de co-cultivo, las células se tiñen con calcio y homodímero de etidio para diferenciar entre células vivas y muertas. Mediante microscopía confocal, se observa claramente la presencia de dos poblaciones celulares y sus interacciones. El análisis mediante citometría de flujo revela tres agrupamientos de células dañadas, que pueden representarse en una gráfica y analizarse estadísticamente. El trasplante de células madre. Los protocolos están incorporándose a la práctica clínica; obtener mejores resultados, hacer que los protocolos sean más robustos y encontrar nuevas fuentes de células implantables son el enfoque de la investigación reciente.

Investigar la eficacia de las terapias celulares no es una tarea sencilla y se necesitan nuevas herramientas para estudiar los mecanismos implicados en el proceso de tratamiento. Diseñamos un protocolo experimental con el fin de permitir la observación de conexiones celulares e incluso mecanismos subcelulares durante la isquemia, la lesión por reperfusión y tras el trasplante de células madre. Nuestros criterios de diseño, nuestro sistema completamente in vitro, pero solo están presentes las células huésped y las células donantes.

Por lo tanto, se aísla del tejido circundante. Medición continua de la viabilidad celular antes, durante y después de la lesión durante un período de hasta 24 horas. E identificación clara de ambas poblaciones celulares para poder rastrear el destino de las células injertadas.

Con el fin de alcanzar este objetivo, establecimos un protocolo de privación de oxígeno y glucosa, comúnmente abreviado como OGD, seguido de un período de reoxigenación. Nuestra elección de células huésped fueron células C2C12, una línea celular conocida de mioblastos cardíacos rojos. Después del OGD, las células dañadas fueron tratadas mediante el trasplante de células madre mesenquimales derivadas de médula ósea, añadiéndolas al cultivo.

Este montaje nos permitió investigar las conexiones intercelulares mediante microscopía confocal y cuantificar la tasa de supervivencia de células dañadas mediante citometría de flujo. Comencemos a trabajar y veamos cómo lo hacemos. Retire el medio de cultivo de las células H nine C two.

Lave las células dos veces con PBS y digiera con tripsina-EDTA al 0,05 % colocando las placas de Petri durante cinco minutos. En un incubador a 37 grados, inhiba la tripsina con medio de cultivo DMEM. Centrifugue las células a 1200 RPM durante ocho minutos.

Tras eliminar el sobrenadante, resuspenda las células en un milímetro de medio de cultivo DMEM, cuente las células con un hemocitómetro utilizando tinción con azul de tripano: 30.000 células H9c2 por pocillo. En una placa de 12 pocillos, coloque la placa en el incubador de dióxido de carbono a 37 grados durante 24 horas. Retire el medio mediante aspiración y lave las células dos veces con PBS.

Añada tres milímetros de medio sin glucosa. Coloque la placa en el sistema de incubación celular. Inicie el flujo de gas nitrógeno para eliminar el oxígeno del sistema de incubación.

Espere hasta que el nivel de oxígeno alcance el 0,5 %. Luego inicie el cronómetro; un 0,5 % de oxígeno equivale aproximadamente a tres milímetros de mercurio de tensión parcial. Somete las células a 150 minutos de isquemia simulada. Durante la isquemia, las células se desprenden de la superficie y sus membranas comienzan a formar blebs. Descubrimos que cada población requiere longitudes de tiempo ligeramente diferentes para alcanzar una viabilidad celular del 60 al 80 %.

Por eso sugerimos comenzar con la incubación de dos R. Y si no es suficiente, aumentar el tiempo de DGO. En nuestro caso, las células C2 de nueve días típicamente necesitan de 150 a 70 minutos de DGO al final de la isquemia simulada.

Retire el medio sin glucosa de las células y agregue medio de cultivo normal a los pocillos. Incube una placa de 12 pocillos durante 30 minutos en el incubador de dióxido de carbono a 37 grados. Este es el período de reperfusión.

Durante la isquemia simulada, prepare las células de rescate para el trasplante. Diluya la dieta fluorescente, DID vívido, en una proporción de uno a 200 en medio de cultivo DMEM. Aspire el medio de las células de rescate y agregue 300 microlitros de DMEM del plato de Petri Brent Place vívido durante 30 minutos en el incubador de dióxido de carbono a 37 grados.

Después de 30 minutos al final de la reperfusión, añada mil células madre mesenquimales por pocillo a los mioblastos cardíacos H nine C two posisquémicos. Los pasos iniciales son los mismos que la siembra de H nine C two: lavado dos veces con PBS, tripsinización y recuento. Incube el cultivo conjunto de células en un incubador con dióxido de carbono a 37 grados durante 24 horas.

Después de 24 horas, recolecte el medio de cultivo y las células adheridas de los pocillos con ization. Es muy importante recolectar también el medio de cultivo porque algunas células muertas podrían haberse desprendido de la superficie del recipiente de cultivo durante la incubación de 24 horas.

Suspenda las células en 500 microlitros de solución de células vivas, muertas y en muerte, cinco NMO de calcio y 400 NMO de homodímero de Ethereum en PBS cinco veces 10 a la potencia de cuatro células por mililitro. En el caso de cultivos conjuntos, las células madre mesenquimales se distinguen de las células H nine C dos mediante la marcación fluorescente específica de cada tipo celular. De este modo, es posible detectar la fusión celular y los sitios de contacto entre célula y célula.

La proporción de células muertas puede evaluarse en cuatro campos independientes utilizando un objetivo de 10 aumentos para cada cultivo de forma ciega, lo que proporciona un resultado reproducible del recuento celular. Transfiera las células a tubos para citometría de flujo. Inicie el software Cell Quest Pro para configurar el citómetro de flujo para la medición.

Prepare muestras control de células vivas y muertas. Las células vivas se cultivan a la misma densidad en condiciones normales y se tiñen con calcio. Las células muertas se preparan con un tratamiento de una hora con 10 micromoles de peróxido de hidrógeno teñido con etidio, homodímero, y se recolectan de la misma manera; los parámetros del instrumento deben ajustarse para que las células vivas sean positivas para calcio y negativas para el homodímero de etidio.

Aunque las células muertas son negativas para calcio y positivas para homodímero de etidio, el porcentaje de estas poblaciones puede expresarse como barras en una gráfica y se puede realizar un análisis estadístico con estos valores. Descubrimos que la adición de células madre sanas aumenta la proporción de células sobrevivientes en la población. Curiosamente, también observamos que las células que se salvaron tras la lesión pueden separarse mediante citometría no solo de las células muertas, sino también de aquellas que permanecieron vivas.

Consideramos que esta población requiere investigaciones adicionales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar experimentos de isquemia simulada con trasplante de células madre in vitro de manera estandarizada. Eso es todo.

Gracias por ver el video y buena suerte con sus experimentos. Si tiene alguna pregunta técnica, no dude en contactarnos. Estaremos disponibles para ayudarle.