Name: Análisis de Expresión de mamíferos enlazador histonas subtipos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 40 s
Description: Aprenda a analizar la expresión de subtipos de histonas enlazadoras H1 mediante PCR en tiempo real y cromatografía líquida de alta resolución. Este método computacional permite cuantificar ARN y proteínas en células de mamíferos.

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Este trabajo es apoyado por el NIH subvención GM085261 y un Premio de la Coalición de Georgia Cancer Académico Distinguido (a la fiebre amarilla).

<ol><li>Fan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H1+linker+histones+are+essential+for+mouse+development+and+affect+nucleosome+spacing+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">H1 linker histones are essential for mouse development and affect nucleosome spacing in vivo.</a> Mol. Cell Biol. 23, 4559-4572 (2003).</li>
<li>Woodcock, C. L., Skoultchi, A. I., Fan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+linker+histone+in+chromatin+structure+and+function%3A+H1+stoichiometry+and+nucleosome+repeat+length%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Role of linker histone in chromatin structure and function: H1 stoichiometry and nucleosome repeat length.</a> Chromosome Res. 14, 17-25 (2006).</li>
<li>Shen, X., Gorovsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linker+histone+H1+regulates+specific+gene+expression+but+not+global+transcription+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Linker histone H1 regulates specific gene expression but not global transcription in vivo.</a> Cell. 86, 475-483 (1996).</li>
<li>Alami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+linker-histone+subtypes+differentially+affect+gene+expression+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mammalian linker-histone subtypes differentially affect gene expression in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 5920-5925 (2003).</li>
<li>Happel, N., Doenecke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H1+and+its+isoforms%3A+contribution+to+chromatin+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Histone H1 and its isoforms: contribution to chromatin structure and function.</a> Gene. 431, 1-12 (2009).</li>
<li>Clausell, J., Happel, N., Hale, T. K., Doenecke, D., Beato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H1+subtypes+differentially+modulate+chromatin+condensation+without+preventing+ATP-dependent+remodeling+by+SWI%2FSNF+or+NURF%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Histone H1 subtypes differentially modulate chromatin condensation without preventing ATP-dependent remodeling by SWI/SNF or NURF.</a> PLoS One. 4, 0007243-0007243 (2009).</li>
<li>Khadake, J. R., Rao, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-+chromatin-condensing+properties+of+rat+testes+H1a+and+H1t+compared+to+those+of+rat+liver+H1bdec%3B+H1t+is+a+poor+condenser+of+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">DNA- chromatin-condensing properties of rat testes H1a and H1t compared to those of rat liver H1bdec; H1t is a poor condenser of chromatin.</a> Biochemistry. 34, 15792-15801 (1995).</li>
<li>Orrego, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+affinity+of+mammalian+histone+H1+somatic+subtypes+for+DNA+and+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential affinity of mammalian histone H1 somatic subtypes for DNA and chromatin.</a> BMC Biol. 5, 22-22 (2007).</li>
<li>Th'ng, J. P., Sung, R., Ye, M., Hendzel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H1+family+histones+in+the+nucleus.+Control+of+binding+and+localization+by+the+C-terminal+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">H1 family histones in the nucleus. Control of binding and localization by the C-terminal domain.</a> J. Biol. Chem. 280, 27809-27814 (2005).</li>
<li>Wang, Z. F., Sirotkin, A. M., Buchold, G. M., Skoultchi, A. I., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+histone+H1+genes%3A+gene+organization+and+differential+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The mouse histone H1 genes: gene organization and differential regulation.</a> J. Mol. Biol. 271, 124-138 (1997).</li>
<li>Brown, D. T., Sittman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+through+overexpression+and+tagging+of+the+variant+type+of+the+mouse+H1e+and+H1c+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification through overexpression and tagging of the variant type of the mouse H1e and H1c genes.</a> J. Biol. Chem. 268, 713-718 (1993).</li>
<li>Fan, Y., Sirotkin, A., Russell, R. G., Ayala, J., Skoultchi, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+somatic+H1+subtypes+are+dispensable+for+mouse+development+even+in+mice+lacking+the+H1%280%29+replacement+subtype%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Individual somatic H1 subtypes are dispensable for mouse development even in mice lacking the H1(0) replacement subtype.</a> Mol. Cell. Biol. 21, 7933-7943 (2001).</li>
<li>Fan, Y., Skoultchi, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+H1+linker+histone+subtypes+and+their+functions+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of H1 linker histone subtypes and their functions in mice.</a> Methods Enzymol. 377, 85-107 (2004).</li>
<li>Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Real time quantitative PCR.</a> Genome Res. 6, 986-994 (1996).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El conjunto de ensayos que aquí se presenta permitir el análisis exhaustivo de los niveles de expresión de mamíferos subtipos de histonas linker. Correctamente diseñados QRT-PCR proporcionar mediciones de alta sensibilidad y precisión de los mensajes de ARN de los genes histona H1 de mamífero. La parte crítica de la QRT-PCR para los genes del subtipo enlazador histonas es la preparación de cDNA utilizando cebadores aleatorios basados ​​en la transcripción inversa. ARNm de genes más histonas, incluyendo los genes H1, la ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> RNasa Zap </td><td> Applied Biosystems </td><td> AM9780 </td></tr><tr><td> Reactivo Trizol </td><td> Invitrogen </td><td> 15596-018 </td></tr><tr><td> SuperScriptIII </td><td> Invitrogen </td><td> 18080-051 </td></tr><tr><td> Etanol absoluto </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2818-4 </td></tr><tr><td> IQ SYBR Green </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-8880 </td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> Desoxirribonucleasa I </td><td> Sigma </td><td> AMP-D1 </td></tr><tr><td> Microseal placas de 96 pocillos PCR </td><td> Bio-Rad </td><td> MSP-9605 </td></tr><tr><td> Los sellos adhesivos &#39;B&#39; Microseal </td><td> Bio-Rad </td><td> MSB-1001 </td&gt; </tr><tr><td> Sacarosa </td><td> Agros Organics </td><td> AC40594 </td></tr><tr><td> El fosfato de sodio dibásico heptahidratado (Na 2 HPO 4 · 7H 2 O) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP332 </td></tr><tr><td> Cloruro sódico (NaCl) </td><td> América Bioanalítica </td><td> AB01915 </td></tr><tr><td> Dihidrógeno de sodio heptahidratado (NaH 2 PO 4 · 7H2O) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP-330 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP310 </td></tr><tr><td> Completa el inhibidor de la proteasa cóctel mini tablet </td><td> Roche Ciencias Aplicadas </td><td> 11836153001 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E-5134 </td></tr><tr><td> Fenilmetanosulfonilo fluoruro (PMSF) </td><td> América Bioanalítica </td><td> AB01620 </td></tr><tr><td> Nonidet-40 (NP-40) </td&gt; <td> América Bioanalítica </td><td> AB01425 </td></tr><tr><td> El cloruro de potasio (KCL) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP366 </td></tr><tr><td> Tris [hidroximetil aminometano] </td><td> América Bioanalítica </td><td> AB02000 </td></tr><tr><td> Cloruro de magnesio (MgCl2) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP214 </td></tr><tr><td> El ácido sulfúrico (H2SO4) </td><td> VWR </td><td> VW3648-3 </td></tr><tr><td> De hidróxido de amonio (NH 4 OH) </td><td> Agros Organics </td><td> AC42330 </td></tr><tr><td> Bradford ensayo de proteínas </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0001 </td></tr><tr><td> Acetonitrilo </td><td> EMD </td><td> AX0145-1 </td></tr><tr><td> Ácido trifluoroacético (TFA) </td><td> JT Baker </td><td> 9470-01 </td></tr></tbody></table>

análisis de expresión de mamíferos enlazador histonas subtipos

Expression Analysis of Mammalian Linker-histone Subtypes

Histona H1 vinculador se une a la partícula central del nucleosoma y el ADN enlazador, lo que facilita el plegamiento de la cromatina en la estructura de orden superior. H1 es esencial para el desarrollo de mamíferos 1 y regula la expresión de genes específicos in vivo 2-4. Entre las proteínas histonas altamente conservadas, la familia de las histonas H1 linker es el grupo más heterogéneo. Hay 11 subtipos H1 en los mamíferos que son regulados diferencialmente durante el desarrollo y en diferentes tipos celulares. Estos subtipos H1 H1 somáticas son: 5 (H1a-e), el reemplazo de H1 0, 4 subtipos de células germinales específicos H1, ​​y H1X 5. La presencia de los subtipos H1 múltiples que difieren en su afinidad de unión al ADN y la capacidad de compactación de la cromatina 6.9 proporciona un nivel adicional de modulación de la función de la cromatina. Así, el análisis cuantitativo de expresión de los subtipos H1 individuales, tanto de ARNm y proteínas, es necesario para una mejor comprensión de la regulación de la mayorPara estructura de la cromatina y la función. Aquí se describe una serie de ensayos diseñados para el análisis de los niveles de expresión de los subtipos H1 individuales (Figura 1). la expresión de mRNA de varios genes H1 variante se mide por un conjunto de alta sensibilidad y cuantitativa de la PCR con transcripción inversa (QRT-PCR), que son más rápidos, más precisos y requieren muestras y mucho menos en comparación con el enfoque alternativo de análisis de Northern blot. A diferencia de la mayoría de los otros mensajes de ARNm celulares, ARNm para genes de la mayoría de las histonas, incluyendo la mayoría de los genes H1, ​​carecen de una larga cola poli, pero contienen una estructura tallo-bucle en la región 3 &#39;no traducida (UTR) 10. Por lo tanto, los ADNc se preparó a partir de ARN total por transcripción inversa usando cebadores al azar en lugar de cebadores oligo-dT. En tiempo real ensayos de PCR con primers específicos para cada uno de los subtipos H1 (Tabla 1) se llevan a cabo para obtener la medición altamente cuantitativa de los niveles de mRNA de subtipo H1 personas. La expresión de los genes de limpieza se analizan como controles para la normalización. La abundancia relativa de las proteínas de cada subtipo H1 y histonas se obtiene mediante cromatografía líquida en fase inversa de alto rendimiento (CLAR) de análisis de las histonas total extraído de células de mamífero 11-13. El método HPLC y condiciones de elución descrito aquí dan separaciones óptimas de los subtipos H1 del ratón. Al cuantificar el perfil de HPLC, se calcula la proporción relativa de los subtipos H1 H1 individuales dentro de la familia, así como determinar la relación entre nucleosoma H1 en las células.

Se describe un conjunto de ensayos para analizar los niveles de expresión de las histonas H1 enlazador. ARNm de genes H1 individuales se mide cuantitativamente por transcripción inversa aleatoria cebador basado seguido por PCR en tiempo real, mientras que la cuantificación de proteínas de las histonas H1 se logra mediante análisis por HPLC.

Análisis de Expresión de mamíferos enlazador histonas subtipos

La histona de enlace H1 se une a la partícula central del nucleosoma y al ADN de enlace, facilitando el plegamiento de la cromatina en una estructura de orden superior. La H1 es esencial...

El objetivo general de este procedimiento es analizar los niveles de expresión de los subtipos de histona H1 mediante el análisis de los niveles de ARNm de H1 y la medición de los niveles de proteína H1. Para realizar el análisis de ARNm, primero se extrae ARN total de células cultivadas o tejido de ratón. El segundo paso del procedimiento consiste en realizar una transcripción inversa del ARN total con cebadores aleatorios, seguido de ensayos de PCR cuantitativa en tiempo real para cada uno de los genes de subtipos de H1. El análisis de la proteína histona H1 comienza con la preparación de extractos totales de histonas a partir de tejidos de ratón o células cultivadas.A continuación, se realiza la fraccionación y cuantificación de cada subtipo de histona H uno y de la histona central H dos B mediante análisis por HPLC en fase reversa. Finalmente, los análisis de PCR cuantitativa en tiempo real y de HPLC en fase reversa muestran los niveles de expresión de ARNm y proteínas. Para cada subtipo de histona H uno.Somos estudiantes de posgrado del laboratorio FES de la Dra. Yuhan en la Escuela de Biología del Instituto de Tecnología de Georgia. Hoy les mostraremos un conjunto de ensayos integrales para el análisis de la expresión de H ones en subtipos de H one de mamíferos. A través de estos ensayos, pueden obtener una medición cuantitativa de los niveles de expresión de ARNm y proteína en diversos subtipos de H one.La histona H1 es la principal proteína cromosómica estructural que facilita el plegamiento de orden superior de la cromatina. Existen múltiples variantes de la histona H1 que se expresan de manera diferencial durante la diferenciación celular y el desarrollo. El perfilado de estos subtipos de H1 es necesario para comprender mejor la regulación de la estructura y función de la cromatina de orden superior. Así que comencemos.Antes de la extracción de ARN, todas las superficies de trabajo y pipetas deben limpiarse con etanol al 70 % y tratarse con solución de descontaminación de ARN. Esta práctica reduce las posibilidades de contaminación del ARN y de degradación del ARN. Además, se deben usar guantes en todos los procedimientos para iniciar la extracción de ARN a partir de cultivos celulares adherentes, aspirar el medio de cultivo y lavar las células con PBS.Luego, retire el PBS de los pocillos. Es necesario un cantidad suficiente de reactivo triol para obtener ARN de alta calidad. Utilice un mililitro de reactivo triol para extraer ARN de un pocillo de una placa de seis pocillos y proceda a extraer el ARN de las células según el manual del fabricante para el reactivo triol. Tras la extracción de ARN, mida la concentración de ARN utilizando el NanoDrop 1000.El rendimiento típico oscila entre cinco y quince microgramos de ARN por uno por diez a la sexta células cultivadas. Antes de proceder a la síntesis de ADNc, analice la calidad del ARN mediante electroforesis GE para eliminar la posible contaminación del ARN con trazas de ADN genómico. Trate las muestras de ARN con ADNasa libre de ARN según las instrucciones del fabricante para la transcripción inversa de ARN total en ADNc. Utilice el sistema de síntesis de primera cadena Superscript III según las instrucciones del fabricante. Dado que el ARNm de la mayoría de los genes H1 carece de colas poli A, es fundamental utilizar hexámeros aleatorios en lugar de oligo dT como cebadores.Para la síntesis de ADNc, tras la transcripción inversa, la amplificación de ADNc se puede lograr mediante RT-PCR cuantitativa (Q-R-T-P-C-R) tal como se detecta mediante el colorante SYBR Green antes del ensayo de Q-R-T-P-C-R. Se diseñaron cebadores específicos directos e inversos para cada gen H uno y para el gen de referencia interno, y la eficiencia de los cebadores se probó mediante el método de curva estándar descrito en el protocolo escrito. Proceda a preparar cada reacción de PCR mezclando los cebadores, ADNc y Supermix con SYBR Green.Mezcle bien las reacciones en una placa PCR de 96 pocillos utilizando sellos adhesivos micros EAL B para asegurar que la tapa de la placa quede sellada herméticamente. Luego, vortexee la placa sellada y centrifugue brevemente para reunir los componentes al fondo de los pocillos. Coloque la placa en el sistema de detección en tiempo real My IQ de un solo color para QPCR.Configure las condiciones de QPCR y realice la corrida según se indica en el texto posterior a la amplificación. Examine las curvas de amplificación para evaluar la eficiencia de la PCR y el umbral de ciclos o valores CT. La línea umbral puede establecerse automáticamente mediante el software versión 2.0 del sistema óptico IQ Five.Dado que el verde de citrón detecta cualquier ADN de doble cadena, es fundamental realizar un análisis de curva de desnaturalización tras la QPCR para asegurar que se amplifica y detecta el amplicón deseado, y no los dímeros de cebadores ni contaminantes. Para el programa de análisis de curva de fusión, el instrumento de QPCR debe calentar las muestras desde 55 grados centígrados hasta 95 grados centígrados en incrementos de 0,5 grados centígrados con recolección de datos. Dado que la temperatura o TM del ADN de doble cadena depende de la longitud del amplicón y del contenido de GC, diferentes amplicones tendrán distintas TM.Examine las curvas de derivada de fusión de los productos de QPCR para confirmar la temperatura específica de fusión de los amplicones deseados, así como la ausencia de picos de amplicones no específicos, como las curvas de fusión de los amplicones de PCR de H one A mostradas aquí con una TM de 86 grados centígrados. Proceda a analizar los datos de QPCR con el software del sistema óptico IQ cinco. Normalice los valores de expresión de los genes de la isoforma H one con la expresión de los genes de mantenimiento para obtener niveles relativos de expresión de los genes H one.Después de diseccionar el órgano de interés de un ratón sacrificado, enjuáguelo con PBS frío con hielo. En esta demostración, la preparación de cromatina total se realiza en el hígado; tras el lavado, pique el tejido en trozos con una hoja de bisturí. Transfiera el tejido picado a un homogenizador Dounce y agregue tampón de sacarosa al homogenizador en un volumen de 10 mililitros por gramo de tejido.Proceda a homogeneizar el tejido con 10 a 15 movimientos. Después de transferir los homogenizados a un tubo de 15 mililitros, realice la centrifugación de las muestras a 500 RPM durante 30 segundos. Tras la centrifugación, transfiera cuidadosamente el sobrenadante a un tubo nuevo y centrifugue a 2000 RPM durante cinco minutos.Para obtener el sedimento celular, resuspenda el botón celular en 10 mililitros de tampón de sacarosa, suplementado con 0,5 % de NP-40. Transfiera la muestra a un homogenizador tipo Dounce y realice 10 golpes durante una incubación de 20 minutos. En este punto, se obtienen los núcleos.Examine la calidad de los núcleos bajo un microscopio. Después de sedimentar los núcleos por centrifugación a 2000 RPM durante cinco minutos, se puede descartar el sobrenadante. A continuación, resuspenda el sedimento de núcleos en tres mililitros de tampón de alta salinidad por cada gramo de tejido.Transfiera la muestra a un homogeneizador pequeño y homogenice con cinco a 10 movimientos. Alicuote la suspensión en tres tubos eppendorf. Incube los tubos en hielo durante 20 minutos.Tras la incubación, realice una centrifugación a 14.000 RPM durante 10 minutos para obtener el sedimento de cromatina. Después de desechar el sobrenadante, extraiga las histonas totales añadiendo 0,8 mililitros de ácido sulfúrico 0,2 normal a cada sedimento de cromatina. Utilice un pistilo para tubo eppendorf para triturar bien el sedimento hasta que este se disocie completamente.Incube las muestras en una plataforma rotatoria a cuatro grados centígrados durante la noche. Posteriormente a la centrifugación, transfiera el sobrenadante a dos tubos EOR. Añada 2,5 volúmenes de etanol frío con hielo a cada tubo.Mantenga las muestras a menos 20 grados centígrados durante la noche; al día siguiente, centrifugue a 14 000 RPM durante 10 minutos para obtener el pellet de histonas totales y deseche el sobrenadante. Después de lavar el pellet tres veces con etanol al 70 %, deje los tubos abiertos sobre la mesa durante 20 a 30 minutos para que sequen al aire y proceda inmediatamente al análisis por HPLC. Resuspenda el pellet de histonas en el volumen recomendado de agua doblemente destilada, dependiendo de la capacidad de la columna de fase reversa y del instrumento de HPLC, y centrifugue a 14 000 RPM durante cinco minutos.Para eliminar los residuos insolubles, inyecte de 50 a 100 microgramos de proteína total de histonas en la columna de fase reversa del sistema de HPLC, como el purificador GE ACTA UPC 900. Carga. Se debe evitar una cantidad excesiva de proteína para prevenir la obstrucción de la columna. Fracción ocho, las histonas conectoras y las histonas centrales se eluyen con un gradiente creciente de acetonitrilo según se indica en el protocolo escrito; el efluente se monitorea a 214 nanómetros y los perfiles de HPLC se registran y analizan. Las fracciones proteicas también pueden recolectarse mediante el colector automático de fracciones GE FRAC nine 20 para análisis posteriores.Se muestran aquí curvas típicas de amplificación de reacciones H one A-Q-P-C-R utilizando ADNc preparado a partir de hígado de ratón y células madre embrionarias de ratón. La evaluación del gráfico de amplificación muestra que las reacciones triplicadas de QPCR de cada muestra produjeron señales consistentes con valores de CT casi idénticos, lo que sugiere una alta reproducibilidad. La ausencia de acumulación de amplicones en las reacciones de QPCR sin RT indica que no hubo contaminación con ADN genómico o que esta fue mínima. Utilizando los valores de CT de los genes H one y los genes de mantenimiento, se calculó el nivel relativo de expresión de ARN de cada gen H one.Los gráficos mostrados aquí son ejemplos de resultados calculados para los genes H one A y H one zero. Los niveles relativos de expresión de ARNm de H one A son más altos en células madre embrionarias de ratón en comparación con hígado de ratón, mientras que la expresión de H one zero es mucho más alta en hígado que en las células madre embrionarias. La diferencia en la expresión de H one A o H one zero en células madre embrionarias de ratón frente al hígado adulto de ratón también es evidente a partir de los perfiles de HPLC de las proteínas histonas.H uno cero. La H uno específica de diferenciación se acumula en gran cantidad en el hígado de ratón adulto. En contraste, la proteína H uno cero está casi ausente en células madre embrionarias de ratón indiferenciadas.Por otro lado, H uno A se expresa altamente en las células madre embrionarias, pero se presenta en bajos niveles en el hígado de ratón adulto mediante la cuantificación de los picos de H uno. En el perfil de HPLC, se determina la proporción relativa de cada subtipo individual de H uno dentro de la familia de H uno en el hígado de ratón adulto. Además, los valores de cada subtipo individual de H uno por nucleosoma pueden calcularse a partir de la relación entre el valor normalizado del pico de absorbancia a 214 nanómetros de los subtipos correspondientes de H uno y la mitad del valor normalizado de H dos B. Este valor puede calcularse de manera similar para el H uno total por nucleosoma.Una vez dominada la técnica, el análisis Q-R-T-P-C-R del subtipo H uno puede realizarse en un día, y la extracción de histonas y el análisis HPRC pueden completarse en tres días si se realiza adecuadamente. Al realizar el análisis Q-R-T-P-C-R de los genes de histona H uno, es fundamental evitar la degradación del ARN, eliminar la contaminación con ADN genómico y, lo más importante, incluir cebadores aleatorios en la reacción de transcripción inversa. Durante la extracción de histonas y el análisis HPOC, es importante añadir inhibidores de proteínas frescos al tampón de extracción para evitar la degradación proteica, y también debemos prestar atención a desagregar completamente la cromatina para facilitar la extracción completa de las histonas.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo analizar exhaustivamente la expresión de los subtipos de histona H1 de mamíferos a nivel de ARNm y de proteína.

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