Name: Análisis de Expresión de mamíferos enlazador histonas subtipos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 40 s
Description: Aprenda a analizar la expresión de subtipos de histonas enlazadoras H1 mediante PCR en tiempo real y cromatografía líquida de alta resolución. Este método computacional permite cuantificar ARN y proteínas en células de mamíferos.

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Este trabajo es apoyado por el NIH subvención GM085261 y un Premio de la Coalición de Georgia Cancer Académico Distinguido (a la fiebre amarilla).

<ol><li>Fan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H1+linker+histones+are+essential+for+mouse+development+and+affect+nucleosome+spacing+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">H1 linker histones are essential for mouse development and affect nucleosome spacing in vivo.</a> Mol. Cell Biol. 23, 4559-4572 (2003).</li>
<li>Woodcock, C. L., Skoultchi, A. I., Fan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+linker+histone+in+chromatin+structure+and+function%3A+H1+stoichiometry+and+nucleosome+repeat+length%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Role of linker histone in chromatin structure and function: H1 stoichiometry and nucleosome repeat length.</a> Chromosome Res. 14, 17-25 (2006).</li>
<li>Shen, X., Gorovsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linker+histone+H1+regulates+specific+gene+expression+but+not+global+transcription+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Linker histone H1 regulates specific gene expression but not global transcription in vivo.</a> Cell. 86, 475-483 (1996).</li>
<li>Alami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+linker-histone+subtypes+differentially+affect+gene+expression+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mammalian linker-histone subtypes differentially affect gene expression in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 5920-5925 (2003).</li>
<li>Happel, N., Doenecke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H1+and+its+isoforms%3A+contribution+to+chromatin+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Histone H1 and its isoforms: contribution to chromatin structure and function.</a> Gene. 431, 1-12 (2009).</li>
<li>Clausell, J., Happel, N., Hale, T. K., Doenecke, D., Beato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H1+subtypes+differentially+modulate+chromatin+condensation+without+preventing+ATP-dependent+remodeling+by+SWI%2FSNF+or+NURF%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Histone H1 subtypes differentially modulate chromatin condensation without preventing ATP-dependent remodeling by SWI/SNF or NURF.</a> PLoS One. 4, 0007243-0007243 (2009).</li>
<li>Khadake, J. R., Rao, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-+chromatin-condensing+properties+of+rat+testes+H1a+and+H1t+compared+to+those+of+rat+liver+H1bdec%3B+H1t+is+a+poor+condenser+of+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">DNA- chromatin-condensing properties of rat testes H1a and H1t compared to those of rat liver H1bdec; H1t is a poor condenser of chromatin.</a> Biochemistry. 34, 15792-15801 (1995).</li>
<li>Orrego, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+affinity+of+mammalian+histone+H1+somatic+subtypes+for+DNA+and+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential affinity of mammalian histone H1 somatic subtypes for DNA and chromatin.</a> BMC Biol. 5, 22-22 (2007).</li>
<li>Th'ng, J. P., Sung, R., Ye, M., Hendzel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H1+family+histones+in+the+nucleus.+Control+of+binding+and+localization+by+the+C-terminal+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">H1 family histones in the nucleus. Control of binding and localization by the C-terminal domain.</a> J. Biol. Chem. 280, 27809-27814 (2005).</li>
<li>Wang, Z. F., Sirotkin, A. M., Buchold, G. M., Skoultchi, A. I., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+histone+H1+genes%3A+gene+organization+and+differential+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The mouse histone H1 genes: gene organization and differential regulation.</a> J. Mol. Biol. 271, 124-138 (1997).</li>
<li>Brown, D. T., Sittman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+through+overexpression+and+tagging+of+the+variant+type+of+the+mouse+H1e+and+H1c+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification through overexpression and tagging of the variant type of the mouse H1e and H1c genes.</a> J. Biol. Chem. 268, 713-718 (1993).</li>
<li>Fan, Y., Sirotkin, A., Russell, R. G., Ayala, J., Skoultchi, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+somatic+H1+subtypes+are+dispensable+for+mouse+development+even+in+mice+lacking+the+H1%280%29+replacement+subtype%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Individual somatic H1 subtypes are dispensable for mouse development even in mice lacking the H1(0) replacement subtype.</a> Mol. Cell. Biol. 21, 7933-7943 (2001).</li>
<li>Fan, Y., Skoultchi, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+H1+linker+histone+subtypes+and+their+functions+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of H1 linker histone subtypes and their functions in mice.</a> Methods Enzymol. 377, 85-107 (2004).</li>
<li>Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Real time quantitative PCR.</a> Genome Res. 6, 986-994 (1996).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El conjunto de ensayos que aquí se presenta permitir el análisis exhaustivo de los niveles de expresión de mamíferos subtipos de histonas linker. Correctamente diseñados QRT-PCR proporcionar mediciones de alta sensibilidad y precisión de los mensajes de ARN de los genes histona H1 de mamífero. La parte crítica de la QRT-PCR para los genes del subtipo enlazador histonas es la preparación de cDNA utilizando cebadores aleatorios basados ​​en la transcripción inversa. ARNm de genes más histonas, incluyendo los genes H1, la ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> RNasa Zap </td><td> Applied Biosystems </td><td> AM9780 </td></tr><tr><td> Reactivo Trizol </td><td> Invitrogen </td><td> 15596-018 </td></tr><tr><td> SuperScriptIII </td><td> Invitrogen </td><td> 18080-051 </td></tr><tr><td> Etanol absoluto </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2818-4 </td></tr><tr><td> IQ SYBR Green </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-8880 </td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> Desoxirribonucleasa I </td><td> Sigma </td><td> AMP-D1 </td></tr><tr><td> Microseal placas de 96 pocillos PCR </td><td> Bio-Rad </td><td> MSP-9605 </td></tr><tr><td> Los sellos adhesivos &#39;B&#39; Microseal </td><td> Bio-Rad </td><td> MSB-1001 </td&gt; </tr><tr><td> Sacarosa </td><td> Agros Organics </td><td> AC40594 </td></tr><tr><td> El fosfato de sodio dibásico heptahidratado (Na 2 HPO 4 · 7H 2 O) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP332 </td></tr><tr><td> Cloruro sódico (NaCl) </td><td> América Bioanalítica </td><td> AB01915 </td></tr><tr><td> Dihidrógeno de sodio heptahidratado (NaH 2 PO 4 · 7H2O) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP-330 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP310 </td></tr><tr><td> Completa el inhibidor de la proteasa cóctel mini tablet </td><td> Roche Ciencias Aplicadas </td><td> 11836153001 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E-5134 </td></tr><tr><td> Fenilmetanosulfonilo fluoruro (PMSF) </td><td> América Bioanalítica </td><td> AB01620 </td></tr><tr><td> Nonidet-40 (NP-40) </td&gt; <td> América Bioanalítica </td><td> AB01425 </td></tr><tr><td> El cloruro de potasio (KCL) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP366 </td></tr><tr><td> Tris [hidroximetil aminometano] </td><td> América Bioanalítica </td><td> AB02000 </td></tr><tr><td> Cloruro de magnesio (MgCl2) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP214 </td></tr><tr><td> El ácido sulfúrico (H2SO4) </td><td> VWR </td><td> VW3648-3 </td></tr><tr><td> De hidróxido de amonio (NH 4 OH) </td><td> Agros Organics </td><td> AC42330 </td></tr><tr><td> Bradford ensayo de proteínas </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0001 </td></tr><tr><td> Acetonitrilo </td><td> EMD </td><td> AX0145-1 </td></tr><tr><td> Ácido trifluoroacético (TFA) </td><td> JT Baker </td><td> 9470-01 </td></tr></tbody></table>

análisis de expresión de mamíferos enlazador histonas subtipos

Expression Analysis of Mammalian Linker-histone Subtypes

Histona H1 vinculador se une a la partícula central del nucleosoma y el ADN enlazador, lo que facilita el plegamiento de la cromatina en la estructura de orden superior. H1 es esencial para el desarrollo de mamíferos 1 y regula la expresión de genes específicos in vivo 2-4. Entre las proteínas histonas altamente conservadas, la familia de las histonas H1 linker es el grupo más heterogéneo. Hay 11 subtipos H1 en los mamíferos que son regulados diferencialmente durante el desarrollo y en diferentes tipos celulares. Estos subtipos H1 H1 somáticas son: 5 (H1a-e), el reemplazo de H1 0, 4 subtipos de células germinales específicos H1, ​​y H1X 5. La presencia de los subtipos H1 múltiples que difieren en su afinidad de unión al ADN y la capacidad de compactación de la cromatina 6.9 proporciona un nivel adicional de modulación de la función de la cromatina. Así, el análisis cuantitativo de expresión de los subtipos H1 individuales, tanto de ARNm y proteínas, es necesario para una mejor comprensión de la regulación de la mayorPara estructura de la cromatina y la función. Aquí se describe una serie de ensayos diseñados para el análisis de los niveles de expresión de los subtipos H1 individuales (Figura 1). la expresión de mRNA de varios genes H1 variante se mide por un conjunto de alta sensibilidad y cuantitativa de la PCR con transcripción inversa (QRT-PCR), que son más rápidos, más precisos y requieren muestras y mucho menos en comparación con el enfoque alternativo de análisis de Northern blot. A diferencia de la mayoría de los otros mensajes de ARNm celulares, ARNm para genes de la mayoría de las histonas, incluyendo la mayoría de los genes H1, ​​carecen de una larga cola poli, pero contienen una estructura tallo-bucle en la región 3 &#39;no traducida (UTR) 10. Por lo tanto, los ADNc se preparó a partir de ARN total por transcripción inversa usando cebadores al azar en lugar de cebadores oligo-dT. En tiempo real ensayos de PCR con primers específicos para cada uno de los subtipos H1 (Tabla 1) se llevan a cabo para obtener la medición altamente cuantitativa de los niveles de mRNA de subtipo H1 personas. La expresión de los genes de limpieza se analizan como controles para la normalización. La abundancia relativa de las proteínas de cada subtipo H1 y histonas se obtiene mediante cromatografía líquida en fase inversa de alto rendimiento (CLAR) de análisis de las histonas total extraído de células de mamífero 11-13. El método HPLC y condiciones de elución descrito aquí dan separaciones óptimas de los subtipos H1 del ratón. Al cuantificar el perfil de HPLC, se calcula la proporción relativa de los subtipos H1 H1 individuales dentro de la familia, así como determinar la relación entre nucleosoma H1 en las células.

Se describe un conjunto de ensayos para analizar los niveles de expresión de las histonas H1 enlazador. ARNm de genes H1 individuales se mide cuantitativamente por transcripción inversa aleatoria cebador basado seguido por PCR en tiempo real, mientras que la cuantificación de proteínas de las histonas H1 se logra mediante análisis por HPLC.

Análisis de Expresión de mamíferos enlazador histonas subtipos

La histona de enlace H1 se une a la partícula central del nucleosoma y al ADN de enlace, facilitando el plegamiento de la cromatina en una estructura de orden superior. La H1 es esencial...

El objetivo general de este procedimiento es analizar los niveles de expresión de los subtipos de histona H1 mediante el análisis de los niveles de ARNm de H1 y la medición de los niveles de proteína H1. Para realizar el análisis de ARNm, primero se extrae ARN total de células cultivadas o tejido de ratón. El segundo paso del procedimiento consiste en realizar una transcripción inversa del ARN total con cebadores aleatorios, seguido de ensayos de PCR cuantitativa en tiempo real para cada uno de los genes de subtipos de H1. El análisis de la proteína histona H1 comienza con la preparación de extractos totales de histonas a partir de tejidos de ratón o células cultivadas.A continuación, se realiza la fraccionación y cuantificación de cada subtipo de histona H uno y de la histona central H dos B mediante análisis por HPLC en fase reversa. Finalmente, los análisis de PCR cuantitativa en tiempo real y de HPLC en fase reversa muestran los niveles de expresión de ARNm y proteínas. Para cada subtipo de histona H uno.Somos estudiantes de posgrado del laboratorio FES de la Dra. Yuhan en la Escuela de Biología del Instituto de Tecnología de Georgia. Hoy les mostraremos un conjunto de ensayos

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Al combinar nativa y reticular inmunoprecipitación de cromatina con una elevada resolución Espectrometría de Masas, enfoque ChroP permite diseccionar la arquitectura proteómico compuesta de modificaciones de las histonas, variantes y proteínas no histonic sinergizantes en cromatina dominios funcionalmente distintos.

El Enfoque ChroP Combina chip y la espectrometría de masas para diseccionar Locus específicos proteómicos Paisajes de la cromatina

Este protocolo describe un flujo de trabajo totalmente integrado para la caracterización de las histonas modificaciones post-traduccionales utilizando espectrometría de masas (MS). El flujo de trabajo incluye la purificación de la histona de cultivos de células o tejidos, la derivación de histonas y la digestión, el análisis de MS utilizando cromatografía líquida de flujo nano e instrucciones para el análisis de datos. El protocolo está diseñado para dentro de 2 - 3 días.

Flujo de trabajo completo para el análisis de las histonas modificaciones post-traduccionales El uso de espectrometría de masas de abajo hacia arriba: A partir de la histona Extracción de Análisis de Datos

Este protocolo describe la reconstitución de los nucleosomas que contienen histonas hermana marcados con isótopos diferencialmente. Al mismo tiempo, los nucleosomas asimétricamente después de la traducción modificados pueden ser generados después de usar una copia de la histona premodified. Estas preparaciones se pueden utilizar fácilmente para estudiar los mecanismos de modificación de diafonía, simultáneamente en ambos histonas hermanas, mediante el uso de la espectroscopia de RMN de alta...

La reconstitución de los nucleosomas con histonas hermanas marcadas con isótopos diferencialmente

Este manuscrito describe métodos para aplicar la tecnología de microarrays de péptidos a la especificidad de perfiles de anticuerpos que reconocen las histonas y sus modificaciones post-traduccionales.

Análisis de especificidad de anticuerpos histona con microarrays peptídicos

Presentamos un método eficaz y reproducible para aislar las células progenitoras neurales de tejido cerebral embrionario y postnatal de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) de la histona 3 lisina 79 dimetilación (H3K79me2) - una marca de histona situada dentro de la cultura el dominio globular de la histona 3.

Aislamiento y cultivo de progenitores neuronales seguido por inmunoprecipitación de cromatina de histona 3 lisina 79 dimetilación marca

Los inhibidores de las acetiltransferasas de histona (HATs, también conocidos como acetiltransferasas de lisina), como CBP/p300, son terapias potenciales para el tratamiento del cáncer. Sin embargo, se necesitan métodos rigurosos para validar estos inhibidores. Tres métodos in vitro para la validación incluyen ensayos HAT con acetiltransferasas recombinantes, inmunoblotting para la acetilación de histona en el cultivo celular, y ChIP-qPCR.

Ensayos para validar los inhibidores de la acetiltransferasa histona

La cortina de ADN, una técnica de adquisición de imágenes de molécula única de alto rendimiento, proporciona una plataforma para la visualización en tiempo real de diversas interacciones proteína-ADN. El presente protocolo utiliza la técnica de cortina de ADN para investigar el papel biológico y el mecanismo molecular de Abo1, una ATPasa AAA+ que contiene bromodominio de Schizosaccharomyces pombe .

Descifrando el mecanismo molecular del ensamblaje de histonas mediante la técnica de cortina de ADN

Este protocolo describe cómo se puede utilizar un sistema de cultivo celular tridimensional para modelar, tratar y analizar modificaciones de cromatina en un estado casi fisiológico.

Cuantificación a nivel global de modificaciones post-traduccionales de histonas en un modelo de cultivo celular 3D de tejido hepático

Un flujo de trabajo analítico basado en cromatografía líquida, espectrometría de movilidad de iones atrapados y espectrometría de masas de tiempo de vuelo (LC-TIMS-ToF MS/MS) para un análisis "ascendente" de alta confianza y altamente reproducible de las modificaciones e identificación de histonas en función de los parámetros principales (tiempo de retención [RT], sección transversal de colisión [CCS] y relación masa-carga [m/z] precisa).

Cribado de modificación de histonas mediante cromatografía líquida, espectrometría de movilidad de iones atrapados y espectrometría de masas de tiempo de vuelo

Este método describe una estrategia simple y rápida para la caracterización e investigación de proteoformes de histonas.

Presentación de Proteoformas de Histonas mediante electroforesis en gel 2D-TAU

Aprenda a analizar la expresión de subtipos de histonas enlazadoras H1 mediante PCR en tiempo real y cromatografía líquida de alta resolución. Este método computacional permite cuantificar ARN y proteínas en células de mamíferos.

Análisis de Expresión de mamíferos enlazador histonas subtipos

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