Ratón reproducible aplastamiento del nervio ciático y posterior evaluación de la regeneración mediante el análisis de músculo entero Monte

En este informe se describe un método para aplastar el nervio ciático del ratón. Este método usa unas pinzas hemostáticas fácilmente disponibles y fácilmente reproducible y produce aplastamiento completo del nervio ciático. Además, se describe un método para preparar soportes de músculo entero adecuadas para el análisis de la regeneración del nervio después de aplastamiento del nervio ciático.

El objetivo general de este procedimiento es demostrar un método simple y reproducible de aplastamiento del nervio ciático y análisis de montaje completo de la reinervación muscular después del aplastamiento del nervio ciático. Esto se logra exponiendo primero el nervio ciático, incluida la disposición adecuada de los retractores quirúrgicos para garantizar un buen acceso al nervio. A continuación, triture el nervio con pinzas de hemostático y marque el nervio con carbón.

A continuación, retire los músculos individuales inervados por el nervio ciático de la extremidad posterior. El paso final es diseccionar los músculos individuales para el análisis de la montura completa después de la inmunotinción. En última instancia, los resultados demuestran que el aplastamiento reproducible del nervio ciático se puede realizar de forma sencilla y que los montajes de agujeros musculares se pueden utilizar para analizar la regeneración posterior.

La principal ventaja de este procedimiento es que proporciona una técnica sencilla y reproducible para triturar el nervio ciático y, posteriormente, conseguir la regeneración axonal. Comience este procedimiento anestesiando al ratón para la cirugía con un cóctel de 100 miligramos por kilogramo de ketamina y 10 miligramos por kilogramo de xilacina mediante inyección intraperitoneal para minimizar el dolor postoperatorio. El ratón también recibe una inyección subcutánea de 10 miligramos por kilogramo de meloxicam.

A continuación, afeita ambos cuartos traseros con cuidado con una maquinilla quirúrgica. A continuación, aplique la crema depilatoria nare para un agotamiento completo. Limpie la piel con un aplicador estéril con punta de algodón y un exfoliante quirúrgico Betadine.

Después de eso, aplique ungüento oftálmico en los ojos con un aplicador estéril con punta de algodón. Coloque el ratón sobre una placa de acero inoxidable limpia sobre una manta homeo themic precalentada y mantenga la temperatura del animal a 37 grados centígrados. A continuación, pega todas las extremidades con cinta adhesiva.

Coloque con cuidado la extremidad trasera simétricamente para que la articulación de la rodilla forme un ángulo recto con el cuerpo. Posteriormente, cubra el campo quirúrgico con un paño estéril bajo el microscopio. Haz una incisión semicircular a través de la línea media.

Separe la piel suavemente de la musculatura subyacente y dóblela de vez en cuando. Aplique aproximadamente 0,1 mililitros de solución salina estéril para mantener húmedo el sitio quirúrgico durante el procedimiento. A continuación, abra el plano fascial entre el glúteo mayor y la cabeza anterior del bíceps femoral.

Revelar el nervio ciático para un control quirúrgico. El nervio ciático contralateral debe exponerse y movilizarse, pero dejarse intacto. A continuación, reposar y suturar la musculatura glútea.

Exponga el nervio ciático experimental de la misma manera que los retractores. Para facilitar la visualización. Libere suavemente el nervio ciático del tejido conectivo circundante con unas tijeras de iridectomía.

A continuación, utilice las pinzas finas 5 45 para colocar el nervio en la mandíbula inferior de las pinzas hemostáticas superfinas, alinee las tres fasciales adyacentes, no una encima de la otra. Las pinzas hemostáticas han sido grabadas con una marca a 1,5 milímetros de su punta. Coloque la parte más externa de la ciática en línea con esta marca antes de triturar.

Esto asegura un aplastamiento de ancho uniforme y que el nervio no se extienda más allá de las mandíbulas de las pinzas hemostáticas cuando se aplana debido a la fuerza de aplastamiento. Si el nervio se extiende más allá de las puntas de las pinzas, el nervio solo se aplastará parcialmente. Use un segundo par de pinzas hemostáticas que hayan sido sumergidas previamente y polvo de carbono para marcar el sitio de trituración.

Triture el nervio en el mismo sitio de trituración durante 15 segundos con tres clics. Ninguna marca de carbono debe extenderse más allá del límite de la trituración inicial. Esto es particularmente importante si se requiere un marcado preciso del sitio de trituración para sumergir previamente las pinzas en carbono e impedir que el carbón se extienda en el sitio quirúrgico.

Abra las pinzas de carbón en polvo. A continuación, ciérrelos suavemente. Use una gasa estéril para limpiar el carbón en el exterior de los hemostáticos.

Revise las pinzas con al menos tres aumentos para verificar que las superficies de trituración estén uniformemente recubiertas de carbono en polvo. Si es necesario, se vuelven a sumergir y se limpian en reposo y suturan la musculatura glútea de la misma manera que el lado contralateral. Por último, cierre la incisión cutánea con las pinzas reflex de nueve milímetros.

Si se encuentra que las pinzas de reflejos de nueve milímetros restringen el movimiento, se pueden utilizar pinzas de reflejos más pequeñas o seis suturas automáticas. En cambio, después de sacrificar el ratón, retire cuatro músculos. Las tibias, el extensor anterior de los dedos, el peroneo largo y el sóleo en la extremidad posterior se sujetan cuidadosamente a través de sus tejidos conectivos a una placa recubierta de sarda negra.

Luego enjuáguelos en PBS. Posteriormente, fíjelos en aldehído 4%Paraform durante 30 minutos. Para diseccionar cada músculo en una placa de Petri recubierta de sardo negra, retire los tendones con las tijeras de iridectomía.

Después de eso, adelgace los músculos pelando las fibras musculares internas Conserve cuidadosamente la superficie exterior del músculo, incluidas las bandas de la placa terminal. A continuación, monta los músculos resultantes en portaobjetos plus con escudo vectorial y cubreobjetos de cristal de 22 por 40 milímetros, sella dos lados con esmalte de uñas transparente. Cuando están correctamente montadas en la corredera, las bandas de la placa n deben estar en contacto con los deslizadores de la cubierta.

Aquí hay un ejemplo de un sitio de aplastamiento in situ en la extremidad trasera izquierda. El sitio de trituración está indicado por carbono negro. El asterisco marca una rama del nervio tibial que inerva la musculatura del muslo y sirve como un punto de referencia útil.

Durante la cirugía de aplastamiento, la división tibial del nervio ciático se delinea en azul, el peroneo y verde y el srel y amarillo. Esta sección semidelgada demuestra un aplastamiento completo realizado con las pinzas hemostáticas. Las puntas de flecha indican fibras trituradas aquí.

Un aplastamiento incompleto realizado con las pinzas en ángulo está indicado en otra sección de semi aleta. Las puntas de flecha nuevamente indican fibras trituradas, mientras que las flechas indican axones conservados. Estas son las imágenes renderizadas de todos los músculos de la montura.

Después de la extirpación del tejido conectivo y el posterior adelgazamiento, las bandas de la placa conectiva se delinean en cada músculo. Aquí se muestra el músculo de la montura sous entera. 14 días después del aplastamiento del nervio ciático.

Las flechas indican áreas de la unión neuromuscular que han sido reinervadas por un axón. Aquí está la demostración de la unión neuromuscular denervada. La brecha 43 procesos positivos de la célula de Schwan se indica mediante las puntas de flecha.

No se observan axones en esta unión neuromuscular denervada. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo triturar de manera reproducible el nervio estático y preparar las monturas de hormonas musculares para el análisis de la regeneración.