Microcápsulas de alginato como una plataforma 3D para la propagación y diferenciación de las células estaminales embrionarias humanas (CMEH) para los diferentes linajes

Este protocolo está optimizado para encapsular células madre embrionarias humanas pluripotentes y diferenciarlas en neuronas dopaminérgicas en un sistema 3D. Primero, trate las colonias con inhibidor de roca o RI y asócielo en células individuales con acuato mezclado con alginato de sodio y pasado a través del dispositivo de encapsulación. Continuar el tratamiento con IR durante tres días, transferir las células encapsuladas a seis células PA y diferenciar durante 28 días.

En última instancia, el análisis de la expresión génica y proteica muestra una mayor eficiencia en la generación de neuronas dopaminérgicas. La principal ventaja de esta técnica en particular sobre el protocolo de diferenciación 2D existente es que tratamos de propagar y diferenciar estas células en un entorno 3D y ese entorno 3D le brinda la oportunidad de que las células se puedan propagar de una manera de alta densidad. Y luego también da la oportunidad de tener una mejor interacción de célula a célula para la diferenciación.

Y en tercer lugar, también le brindan una mejor eficiencia de diferenciación en la pista. Y también, si se me permite añadir que esta técnica en particular también se puede adaptar a otros tipos de células, que podemos propagar en un entorno 3D. Ahora recuerde también, por ejemplo, que esta técnica en particular se ha optimizado en base al uso de un inhibidor de roca particular que evita la apoptosis celular y también evita el desprendimiento de la célula de las placas de cultivo.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades al principio, ya que esta técnica no se suele realizar en el cultivo de tejidos. La siguiente técnica de encapsulación se ha optimizado en función de los estudios resumidos del Dr. Dean Dr. Chad sobre la aplicación del tipo de alginato inhibidor R, la concentración de alginato y la configuración del dispositivo de encapsulación. Jamie y Kim, un estudiante de doctorado de nuestro laboratorio, ahora demostrarán este protocolo.

Agregue 25 mililitros de solución estéril de gelatina al 0,1% a 275 miligramos de alginato de sodio purificado en un vórtice de tubo estéril de 50 mililitros para disolver parcialmente el polvo de alginato. A continuación, coloque el tubo en un mezclador orbital a 10 veces G durante la noche. A continuación, agregue cloruro de sodio estéril al 9% a la solución de alginato.

Vórtice durante 30 segundos y luego centrifugue a 95 veces G durante cinco minutos. Almacene la solución de alginato a cuatro grados centígrados. Primero, en un entorno oscuro, pretrate las células madre embrionarias humanas con medios de cultivo suplementados con 10 micromolares de inhibidor de roca.

Incubar durante dos horas a 37 grados centígrados. Ahora lave las células dos veces con DPBS para desalojar las células enzimáticamente. Agregue accutane e incube durante 10 minutos.

A 37 grados centígrados, recoja suavemente las células con un raspador de células y transfiéralas a un tubo de 15 mililitros. Neutralice el Accutane con un volumen igual de medio SL. A continuación, pase las células neutralizadas a través de un filtro de 40 micras a un tubo de centrífuga nuevo de 50 mililitros.

Ahora use un hemocitómetro para enumerar las células. Granular las células por centrifugación, desechar con cuidado el supinado. A continuación, lave las celdas una vez con precalentamiento.

0,9% cloruro de sodio. Centrifuga tu ganancia y desecha el supinado. Para encapsular las células madre embrionarias humanas, comience por Resus suspendiendo las células con una solución de alginato precalentada.

Para hacer esto, conecte una jeringa de 20 mililitros a un tubo de plástico blando y aspire alginato en la jeringa. A continuación, mezcle suavemente la suspensión celular con la jeringa sin crear burbujas. Ahora aspire las células en la jeringa.

Deseche el tubo de plástico y luego conecte la jeringa a la máquina de encapsulación. Proceda a la configuración de los instrumentos del generador de perlas, la bomba de jeringa, el medidor de flujo de aire y el baño de precipitación de cloruro de calcio. Verifique un espacio de 10 centímetros entre el extremo de la máquina de encapsulación y el punto de recolección de la placa de Petri.

A continuación, ajuste la bomba de jeringa a 10 mililitros por hora. Caudal de aire de ocho litros por minuto y una presión de 100 kilos pascales. Recoja las células encapsuladas en un baño de precipitación precaliente durante siete minutos.

Luego transfiéralos por aspiración suave a un tubo de centrífuga de 50 mililitros que contenga 20 mililitros de cloruro de sodio al 0,9%, deje que las cápsulas se asienten en el fondo del tubo, deseche suavemente el supinato y luego lávese una vez con cloruro de sodio al 0,9%. Proceda a resuspender las células encapsuladas en un medio de cultivo precalentado, suplementado con inhibidor de rocas. Transfiera a un matraz de cultivo e incube durante tres días.

Siembre la línea estromal de ratón PA seis células en un matraz T 75 recubierto de gelatina al 0,1% y acondicionamiento de medio de diferenciación neuronal dopaminérgico durante 24 horas. Transfiera las cápsulas a un tubo de centrífuga de 50 mililitros y deje que se asienten en el fondo del tubo. Deseche el supinato y vuelva a suspender las cápsulas en PA de seis células en condición de diferenciación neuronal dopaminérgica.

Cultura media. Las células madre embrionarias humanas encapsuladas con la monocapa de seis células PA durante 21 días. Al reponer el cambio de medio.

Solo la mitad de los medios cada vez continúan cultivando las seis células PA en diferenciación neuronal dopaminérgica. Medio suplementado con factores inductores durante una semana. Primero aspire las cápsulas y transfiéralas a un tubo de centrífuga de 15 mililitros.

Cuando las cápsulas se hayan asentado en el fondo, deseche el supinado. Lavar dos veces con DPBS, desechando el supinado. A continuación, añade cinco mililitros de solución decapante y mezcla bien la suspensión.

Incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de centrifugar el pellet, las células de decapado y el lavado dos veces con DPBS proceden a utilizar las celdas de decapado como cultivo monocapa o para el análisis posterior inmediato. En una preparación típica, el diámetro de las microcápsulas de alginato está entre 400 y 500 micras.

Aquí, ensayo C-F-D-A-P-I. Los resultados determinan las células encapsuladas viables verdes al 80%Los análisis de viabilidad, proliferación y apoptosis de células madre embrionarias humanas encapsuladas en diferentes puntos de tiempo sirven para optimizar las condiciones de cultivo. Curiosamente, los efectos inhibidores de rocas previenen la apoptosis inducida por la disociación y mantienen la viabilidad celular con indicación de un crecimiento superior de células madre embrionarias humanas encapsuladas cultivadas en H-F-F-C-M más ri.

En este ejemplo se aplica la encapsulación celular como plataforma 3D para diferenciar células madre embrionarias humanas encapsuladas en neuronas dopaminérgicas. Como era de esperar, el tamaño de los cuerpos embrionarios aumenta con el tiempo, en la encapsulación de las células se muestra una morfología neuronal progresiva después de dos o tres días de cultivo con más del 90% de viabilidad. El análisis de la expresión génica indica una regulación a la baja del marcador pluripotente OCT cuatro.

Es importante destacar que el marcador neuroprogenitor PAC six y el marcador neuronal dopaminérgico th permanecen regulados al alza después de siete días de diferenciación. Las células madre embrionarias humanas más diferenciadas indican más del 90% de neuronas positivas TH después de 21 días. El análisis de pérdidas de Western confirma los patrones de expresión favorables de TH y PAC seis en sistemas de cultivo celular 3D frente a 2D.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar de manera efectiva en dos horas. Recuerde tratar las células con inhibidor de rocas antes y después de la encapsulación. Las variantes inductoras o inhibidoras pueden adaptar el protocolo de diferenciación 3D para futuros experimentos.

Esta técnica particular de encapsular ESL humanos y diferenciarlos en un entorno 3D o por su potencial para la terapia celular para una serie de enfermedades, particularmente la enfermedad de Parkinson.