Chromosomics: Detección de alteraciones numéricas y estructurales en todos los 24 cromosomas humanos de manera simultánea utilizando un nuevo ensayo FISH OctoChrome
6 de febrero de 2012
Una novela de fluorescencia In situ (FISH), método que al mismo tiempo examina alteraciones cromosómicas numéricas y estructurales, en particular las translocaciones cromosómicas específicas asociadas con la leucemia y el linfoma, de los 24 cromosomas humanos en un solo dispositivo en una hibridación, se describe.
El ensayo Octa Chrome Fish examina simultáneamente los 24 cromosomas humanos en una sola hibridación en un portaobjetos. Primero, prepare las tiradas de metafase en la diapositiva específica de ocho cuadrados. A continuación, realice un escaneo automatizado del portaobjetos de muestra para facilitar la localización de todas las fases meta y la futura reevaluación de todas las imágenes de celdas.
En la siguiente posición, el cuadrado de ocho se desliza sobre el dispositivo de cromo Octa e hibrida las sondas. Los resultados obtenidos pueden mostrar tres cromosomas enteros pintados diferentes en cada cuadrado en función de la disposición de las combinaciones de cromosomas en el dispositivo de ósmosis inversa. La primera vez que tuve la idea de este método RO FISH fue cuando comencé a aplicar peces en estudios de poblaciones humanas a principios de la década de 1990.
Luego presenté mi idea de pintura de triple color, diapositiva de ocho cuadrados para establecer la celda en la conferencia anual de A A CR en 1994. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la flexión cromosómica clásica y la creación de prototipos espectrales modernos, es que puede analizar fácilmente los 24 cromosomas humanos en un mayor número de células. Comience con una preparación de las células de metafase fijadas en suspensión como una pipeta de control, coloque las células en un portaobjetos y verifique la densidad adecuada.
Ahora sumérjalo en ocho cuadrados de cromo OC, deslícelo en etanol puro durante dos minutos. En una secuencia de cuadrados alternos, distribuya cinco microlitros de suspensión celular en el portaobjetos de plantilla para evitar que las dispersiones celulares interfieran entre sí. Seque las muestras al aire antes de detectar pares adyacentes.
Aplique 20 microlitros de 0,2 microgramos por mililitro de tinción DAPI en el centro de cada mitad del portaobjetos y coloque un cubreobjetos. Ahora, realice un escaneo automatizado del portaobjetos de muestra para localizar las células de metafase. Utilice el software del metaverso para facilitar la localización de todas las fases meta y la futura reevaluación de todas las imágenes de celdas.
Vea los resultados del análisis manualmente y elimine los artefactos que no sean de metafase. Primero, elimine la mancha de DPI en dos tampones XSSC, luego deshidrate las muestras a través de una serie de lavados con etanol. Seque al aire el portaobjetos y luego colóquelo en una placa de lúpulo a 37 grados centígrados durante cinco minutos.
Ahora equilibre la sonda de croma, la cámara de hibridación de múltiples sondas y el tampón de hibridación en un baño de agua a 37 grados Celsius con la etiqueta hacia abajo. Coloque el dispositivo cromado OC en una placa calefactora a 37 grados centígrados. Agregue dos microlitros de solución de hibridación precalentada a cada una de las ocho áreas.
Invierta y oriente con cuidado la plantilla. Deslice el dedo sobre el dispositivo OC chrome. Comprueba que la diapositiva de la plantilla esté alineada con el dispositivo Octa Chrome.
A continuación, baje con cuidado el portaobjetos sobre las gotas de solución de hibridación y aplique una presión suave y uniforme para esparcir la solución de hibridación a los bordes de cada una de las áreas elevadas del dispositivo OC chrome. Levántelo en el extremo esmerilado de la guía de vidrio e inviértala para que la guía quede debajo del dispositivo cromado OC. Coloque en una placa caliente a 37 grados centígrados durante 10 minutos.
Luego transfiéralo a una placa caliente de 75 grados centígrados durante cinco minutos. Para desnaturalizar las muestras para la etapa de hibridación, transfiéralas a una sonda de croma, cámara de hibridación de múltiples sondas. Vuelva a colocar la tapa y haga flotar la cámara en el baño de agua a 37 grados centígrados durante la noche.
Retire el portaobjetos con cuidado del dispositivo y lávelo con un exceso de 0,4 SC a 72 grados centígrados durante dos minutos. Realice el segundo lavado a temperatura ambiente durante 30 segundos. Proceda a agregar 20 microlitros de DPI al centro de cada mitad del portaobjetos y coloque un cubreobjetos.
Incubar las muestras en la oscuridad durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de verlas mediante microscopía de fluorescencia. El ensayo Octa Chrome Fish facilita el examen simultáneo de los 24 cromosomas humanos mediante una sola hibridación en un solo portaobjetos. Cada cuadrado lleva tres sondas de pintura de cromosomas completos diferentes directamente marcadas con fluoro de diferentes colores.
El examen de cuatro de una célula metafásica normal en el punto dos del sistema Octa CHRO muestra que los cromosomas 8, 21 y 12 están pintados de rojo, verde y azul. Pueden visualizarse individualmente utilizando los filtros respectivos o visualizarse simultáneamente a través de un filtro triple DAPI Fitzy, Texas Red. Este enfoque cromosómico es útil en la detección de células anormales con leucemia cromosómica específica, translocación y aneuploidía.
Por ejemplo, T 8 21 es una translocación cromosómica común en la leucemia mieloide aguda. La trisomía 21 3 copias del cromosoma 21 es una aneuploidía común en la leucemia después del desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los científicos en el campo de la citogenética molecular y la epidemiología molecular exploraran los reordenamientos cromosómicos más comunes detectados en la leucemia y el linfoma, y para examinar la ploidía selectiva entre todos los cromosomas humanos en pacientes clínicos o poblaciones expuestas a productos químicos tóxicos.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo examinar simultáneamente los 24 cromosomas humanos en una sola hibridación en un portaobjetos mediante el ensayo Octo Chrome Fish. Y nosotros definimos esto como cromosomas.
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Visión general
Este artículo describe un nuevo método de hibridación in situ fluorescente (FISH) conocido como el ensayo Octa Chrome Fish. Permite el examen simultáneo de los 24 cromosomas humanos en una sola hibridación en un portaobjetos, centrándose en las alteraciones cromosómicas asociadas con la leucemia y el linfoma.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Hibridación in situ fluorescente (FISH)
- Análisis cromosómico
- Oncología
Antecedentes
- FISH es una técnica utilizada para detectar y localizar la presencia o ausencia de secuencias específicas de ADN en los cromosomas.
- Las translocaciones cromosómicas son significativas en el estudio de la leucemia y el linfoma.
- El método permite un análisis exhaustivo de las alteraciones cromosómicas.
- Los métodos anteriores requerían múltiples hibridaciones, haciendo que este enfoque sea más eficiente.
Propósito del estudio
- Desarrollar un método que simplifique la detección de anomalías cromosómicas.
- Mejorar la eficiencia del análisis cromosómico en entornos clínicos.
- Proporcionar una herramienta para una mejor comprensión de la base genética de las neoplasias hematológicas.
Métodos utilizados
- Preparación de extensiones de metafase en un portaobjetos especializado de ocho cuadrados.
- Escaneo automatizado del portaobjetos para localizar metafases para el análisis.
- Hibridación de sondas utilizando el dispositivo Octa Chrome.
- Visualización de resultados mostrando diferentes cromosomas completos pintados basados en arreglos.
Resultados principales
- El ensayo visualiza exitosamente todos los 24 cromosomas en una sola hibridación.
- Los resultados pueden mostrar tres diferentes cromosomas pintados en cada cuadrado del portaobjetos.
- Facilita la reevaluación de imágenes celulares para un análisis integral.
- Demuestra potencial para la aplicación en estudios de población humana.
Conclusiones
- El ensayo Octa Chrome Fish representa un avance significativo en la metodología FISH.
- Este método puede mejorar la detección de anomalías cromosómicas en los cánceres hematológicos.
- Ofrece un enfoque más eficiente para investigadores y clínicos.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
The OctoChrome-FISH assay enables simultaneous detection of numerical and structural chromosomal alterations across all 24 human chromosomes in a single hybridization, addressing a key bottleneck in cytogenetic analysis for hematological malignancies. By consolidating whole-genome screening into one slide-based workflow, it enhances throughput and reproducibility in leukemia and lymphoma research, supporting early target validation and mechanistic de-risking in preclinical discovery. This capability improves predictive confidence in identifying translocation-driven oncogenes and aneuploidy patterns relevant to benzene-induced leukemogenesis and other toxicant exposures.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing leukemia-specific translocations such as t(9;22), t(15;17), t(8;21), and t(14;18) in their native chromosomal context.
- Operational Value: Reduces need for multiple sequential FISH hybridizations, conserving samples and accelerating target confirmation in discovery biology.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by providing concurrent assessment of structural rearrangements and genome-wide aneuploidy, improving confidence in target-disease associations.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated chromosomal systems for downstream screening by establishing baseline karyotypes and detecting background alteration rates in exposed populations.
- Operational Value: Standardizes cytogenetic readouts through consistent probe labeling and slide architecture, enhancing reproducibility across laboratories and screening campaigns.
- Scalability Value: Enables high-content analysis of metaphase spreads via automated scanning, facilitating reevaluation and longitudinal tracking of chromosomal stability in longitudinal toxicology studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Bridges discovery and preclinical validation by allowing direct comparison of chromosomal alterations in cell models, patient samples, and population cohorts exposed to leukemogens like benzene.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed aneuploidies or translocations are random events or exposure-linked patterns, informing risk assessment in translational biomarker development.
- Continuity Value: Supports seamless transition from in vitro findings to in vivo relevance by maintaining chromosomal resolution across model systems and human specimens.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling chromosomal analysis at early hypothesis testing stages and supporting lead identification through mechanistic de-risking of genomic instability.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing of chromosomal mechanisms in leukemogenesis by allowing simultaneous screening for multiple known and novel alterations across the genome.
- Screening: Delivers quantitative, multiplexed outputs (e.g., translocation frequency, aneuploidy rates) that allow comparison of compound or exposure effects across conditions.
- Analytics: Generates multiplexed fluorescence readouts compatible with automated imaging and software-assisted karyotyping, enabling objective comparison of chromosomal states.
- Translational Research: Connects in vitro findings to human relevance by detecting identical chromosomal patterns in population studies, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable cytogenetic platform applicable across oncology, toxicology, and pharmacogenomics programs requiring chromosomal integrity assessment.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing false negatives through comprehensive chromosomal coverage.
- Operational Value: Improves standardization and reproducibility via standardized probe sets and slide format, minimizing inter-laboratory variability.
- Strategic Value: Enhances capital efficiency by reducing reagent consumption and hands-on time compared to sequential FISH or SKY approaches.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement decisions by providing early evidence of genomic stability or instability in lead candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and cytogenetic preparation for accurate metaphase spread generation and signal interpretation.
- Dependent on access to the OctoChrome device and compatible hybridization chambers for multi-probe simultaneous delivery.
- Necessitates standardization of slide handling, denaturation, and washing protocols to ensure consistent probe penetration and signal-to-noise ratios.
- Adaptation to non-human model systems may require revalidation of probe specificity and chromosomal painting efficiency.
- Practical limitations include reliance on metaphase-quality samples and potential signal overlap in highly rearranged genomes, requiring careful spectral unmixing.
