Chromosomics: Detección de alteraciones numéricas y estructurales en todos los 24 cromosomas humanos de manera simultánea utilizando un nuevo ensayo FISH OctoChrome
6 de febrero de 2012
Una novela de fluorescencia In situ (FISH), método que al mismo tiempo examina alteraciones cromosómicas numéricas y estructurales, en particular las translocaciones cromosómicas específicas asociadas con la leucemia y el linfoma, de los 24 cromosomas humanos en un solo dispositivo en una hibridación, se describe.
El ensayo Octa Chrome Fish examina simultáneamente todos los 24 cromosomas humanos en una única hibridación sobre un portaobjetos. Primero, prepare extensiones metafásicas sobre el portaobjetos específico de ocho cuadrados. Luego, realice un escaneo automatizado del portaobjetos de muestra para facilitar la localización de todas las metafases y la reevaluación futura de todas las imágenes celulares.
Siguiente posición: los ocho cuadrados se deslizan sobre el dispositivo Octa chrome e hibridan las sondas. Los resultados obtenidos pueden mostrar tres cromosomas completos teñidos de forma diferente en cada cuadrado, según la disposición de las combinaciones cromosómicas en el dispositivo RO. Tuve la idea inicial de este método RO FISH cuando comencé a aplicar la técnica FISH en estudios de poblaciones humanas a principios de la década de 1990.
Luego presenté mi idea de la pintura de triple color, diapositiva de ocho cuadrados, para establecer la célula en la conferencia anual de la A A CR en 1994. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la curvatura clásica de cromosomas y la prototipificación espectral moderna es que puede analizar fácilmente todos los 24 cromosomas humanos en un mayor número de células. Comience con una preparación de células en metafase fijadas en suspensión como control, depositando con una pipeta una gota de células sobre una portaobjetos y verifique la densidad adecuada.
Ahora sumerja ocho cuadrados de cromo OC, deslice en etanol puro durante dos minutos. En una secuencia de cuadrados alternos, distribuya cinco microlitros de suspensión celular sobre la portaobjetos patrón para evitar que las extensiones celulares interfieran entre sí. Deje secar al aire las muestras antes de colocar pares adyacentes.
Aplique 20 microlitros de tinción con DAPI de 0,2 microgramos por mililitro en el centro de cada mitad del portaobjetos y coloque una cubierta. A continuación, realice un escaneo automatizado del portaobjetos de muestra para localizar las células en metafase. Utilice el software metaverse para facilitar la localización de todas las metafases y la futura reevaluación de todas las imágenes celulares.
Revise manualmente los resultados del escaneo y elimine los artefactos que no sean metafásicos. Primero, retire la tinción de DPI con dos lavados con tampón XSSC, luego deshidrate las muestras mediante una serie de lavados con etanol. Deje secar la preparación al aire y después colóquela sobre una placa térmica a 37 grados Celsius durante cinco minutos.
Ahora, equilibre la sonda cromogénica, la cámara de hibridación de múltiples sondas y el tampón de hibridación en un baño de agua a 37 grados Celsius con el lado de la etiqueta hacia abajo. Coloque el dispositivo OC chrome en una placa calefactora a 37 grados Celsius. Añada dos microlitros de solución de hibridación precalentada a cada una de las ocho áreas.
Invierta y oriente cuidadosamente la plantilla. Deslícela sobre el dispositivo OC Chrome. Verifique que la diapositiva de la plantilla esté alineada con el dispositivo Octa Chrome.
Luego, baje cuidadosamente la cubierta sobre las gotas de la solución de hibridación y aplique una presión suave y uniforme para extender la solución de hibridación hasta los bordes de cada una de las áreas elevadas en el dispositivo OC chrome. Levante por el extremo esmerilado del portaobjetos y inviértalo para que la cubierta quede debajo del dispositivo OC chrome. Coloque sobre una placa calefactora a 37 grados Celsius durante 10 minutos.
Luego, transfiera la muestra a una placa caliente a 75 grados Celsius durante cinco minutos. Para desnaturalizar las muestras antes del paso de hibridación, colóquelas en una cámara de hibridación Chroma Probe, Multi Probe. Coloque la tapa y deje flotar la cámara en un baño de agua a 37 grados Celsius durante la noche.
Retire cuidadosamente la laminilla del dispositivo y lávela con 0,4 volúmenes excesivos de SC a 72 grados Celsius durante dos minutos. Realice el segundo lavado a temperatura ambiente durante 30 segundos. Proceda a añadir 20 microlitros de DPI al centro de cada mitad de la laminilla y coloque una cubreobjetos.
Incube las muestras a oscuras durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de observarlas mediante microscopía de fluorescencia. El ensayo de pesca Octa chrome permite el examen simultáneo de todos los 24 cromosomas humanos utilizando una única hibridación en un solo portaobjetos. Cada cuadrado lleva tres sondas diferentes de pintado completo del cromosoma marcadas directamente con fluorocromos de distintos colores.
La observación de una célula metafásica normal en el cuadro dos del sistema Octa CHRO muestra que los cromosomas 8, 21 y 12 están marcados con color rojo, verde y azul. Pueden visualizarse individualmente mediante filtros respectivos o simultáneamente a través de un filtro triple DAPI Fitzy, Texas Red. Este enfoque cromosómico tiene utilidad en la detección de células anormales con translocaciones cromosómicas específicas de leucemia y aneuploidía.
Por ejemplo, la translocación cromosómica T 8 21 es común en la leucemia mieloide aguda. La trisomía 21, con 3 copias del cromosoma 21, es una aneuploidía frecuente en la leucemia tras el desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los científicos en el campo de la citogenética molecular y la epidemiología molecular exploraran las reorganizaciones cromosómicas más comunes detectadas en la leucemia y el linfoma, y examinaran la ploidía selectiva entre todos los cromosomas humanos en pacientes clínicos o poblaciones expuestas a productos químicos tóxicos.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo examinar simultáneamente todos los 24 cromosomas humanos en una única hibridación sobre un portaobjetos mediante el ensayo Octo Chrome Fish. Y definimos esto como cromosomas.
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Descripción general
Este artículo describe un nuevo método de hibridación fluorescente in situ (FISH) conocido como el ensayo Octa Chrome Fish. Permite el examen simultáneo de todos los 24 cromosomas humanos en una única hibridación sobre un portaobjetos, centrándose en las alteraciones cromosómicas asociadas con la leucemia y el linfoma.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Hibridación fluorescente in situ (FISH)
- Análisis cromosómico
- Oncología
Antecedentes
- La hibridación in situ con fluorescencia (FISH) es una técnica utilizada para detectar y localizar la presencia o ausencia de secuencias específicas de ADN en los cromosomas.
- Las translocaciones cromosómicas son significativas en el estudio de la leucemia y el linfoma.
- El método permite un análisis completo de las alteraciones cromosómicas.
- Los métodos anteriores requerían múltiples hibridaciones, por lo que este enfoque resulta más eficiente.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método que simplifique la detección de anomalías cromosómicas.
- Mejorar la eficiencia del análisis cromosómico en entornos clínicos.
- Proporcionar una herramienta para comprender mejor la base genética de las malignidades hematológicas.
Métodos Utilizados
- Preparación de extensiones metafásicas en un portaobjetos especializado con ocho cuadrados.
- Escaneo automatizado del portaobjetos para localizar metafasis destinadas al análisis.
- Hibridación de sondas mediante el dispositivo Octa Chrome.
- Visualización de los resultados que muestran diferentes cromosomas completos marcados según sus disposiciones.
Resultados Principales
- El ensayo visualiza con éxito todos los 24 cromosomas en una sola hibridación.
- Los resultados pueden mostrar tres cromosomas marcados diferentes en cada cuadrado del portaobjetos.
- Facilita la reevaluación de las imágenes celulares para un análisis exhaustivo.
- Demuestra el potencial de aplicación en estudios de poblaciones humanas.
Conclusiones
- El ensayo Octa Chrome Fish representa un avance significativo en la metodología FISH.
- Este método puede mejorar la detección de anomalías cromosómicas en cánceres hematológicos.
- Ofrece un enfoque más eficiente para investigadores y clínicos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El ensayo OctoChrome-FISH permite la detección simultánea de alteraciones cromosómicas numéricas y estructurales en todos los 24 cromosomas humanos en una sola hibridación, abordando un cuello de botella clave en el análisis citogenético de las malignidades hematológicas. Al integrar el cribado del genoma completo en un único procedimiento basado en portaobjetos, mejora el rendimiento y la reproducibilidad en la investigación de leucemias y linfomas, apoyando la validación temprana de dianas y la reducción de riesgos mecanicistas en el descubrimiento preclínico. Esta capacidad mejora la confianza predictiva en la identificación de oncogenes impulsados por translocaciones y patrones de aneuploidía relevantes para la leucemogénesis inducida por benceno y otras exposiciones a tóxicos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la visualización de translocaciones específicas de leucemia, como t(9;22), t(15;17), t(8;21) y t(14;18), en su contexto cromosómico nativo.
- Valor operativo: Reduce la necesidad de múltiples hibridaciones FISH secuenciales, conservando muestras y acelerando la confirmación de objetivos en biología de descubrimiento.
- Valor predictivo: Facilita la selección de carteras al proporcionar una evaluación simultánea de reordenamientos estructurales y aneuploidía a nivel del genoma, mejorando la confianza en las asociaciones entre objetivos y enfermedades.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Prepara sistemas cromosómicos validados para análisis posteriores mediante el establecimiento de cariotipos de referencia y la detección de tasas de alteración basal en poblaciones expuestas.
- Valor operativo: Estandariza las lecturas citogenéticas mediante la marcación consistente de sondas y la arquitectura uniforme de portaobjetos, mejorando la reproducibilidad entre laboratorios y campañas de cribado.
- Valor de escalabilidad: Permite el análisis de alto contenido de extensiones metafásicas mediante escaneo automatizado, facilitando la reevaluación y el seguimiento longitudinal de la estabilidad cromosómica en estudios toxicológicos longitudinales.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor Translacional: Une el descubrimiento y la validación preclínica al permitir la comparación directa de alteraciones cromosómicas en modelos celulares, muestras de pacientes y cohortes poblacionales expuestas a leucemógenos como el benceno.
- Reducción Mecanicista de Riesgos: Aclara si las aneuploidias o translocaciones observadas son eventos aleatorios o patrones asociados a la exposición, lo que orienta la evaluación de riesgos en el desarrollo de biomarcadores traslacionales.
- Valor de Continuidad: Facilita la transición fluida desde hallazgos in vitro hasta su relevancia in vivo, manteniendo la resolución cromosómica a través de sistemas modelo y especímenes humanos.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El ensayo se integra en la continuidad de descubrimiento a preclínico, permitiendo el análisis cromosómico en etapas tempranas de prueba de hipótesis y apoyando la identificación de compuestos prometedores mediante la reducción mecanicista de riesgos asociados a la inestabilidad genómica.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis sobre mecanismos cromosómicos en la leucemogénesis mediante la posibilidad de realizar cribados simultáneos de múltiples alteraciones conocidas y novedosas en todo el genoma.
- Cribado: Proporciona resultados cuantitativos y multiplexados (por ejemplo, frecuencia de translocaciones, tasas de aneuploidía) que permiten comparar los efectos de compuestos o exposiciones entre distintas condiciones.
- Análisis: Genera señales fluorescentes multiplexadas compatibles con imágenes automatizadas y cariotipos asistidos por software, lo que posibilita la comparación objetiva de estados cromosómicos.
- Investigación Traducional: Conecta hallazgos in vitro con relevancia humana al detectar patrones cromosómicos idénticos en estudios poblacionales, apoyando la alineación de biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una plataforma citogenética reutilizable aplicable en programas de oncología, toxicología y farmacogenómica que requieran evaluación de la integridad cromosómica.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir los falsos negativos mediante una cobertura cromosómica completa.
- Valor operativo: Mejora la estandarización y la reproducibilidad mediante conjuntos de sondas y un formato de portaobjetos estandarizados, minimizando la variabilidad entre laboratorios.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al reducir el consumo de reactivos y el tiempo de manipulación manual en comparación con los enfoques secuenciales de FISH o SKY.
- Impacto en la cartera: Permite tomar decisiones de avance ajustadas al riesgo al proporcionar evidencia temprana de estabilidad o inestabilidad genómica en los candidatos principales.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microscopía de fluorescencia y preparación citogenética para la generación precisa de extensiones metafásicas y la interpretación de señales.
- Depende del acceso al dispositivo OctoChrome y a cámaras de hibridación compatibles para la administración simultánea de múltiples sondas.
- Necesita la estandarización de los protocolos de manejo de portaobjetos, desnaturalización y lavado para garantizar una penetración constante de las sondas y relaciones señal-ruido uniformes.
- La adaptación a sistemas modelo no humanos puede requerir una nueva validación de la especificidad de las sondas y de la eficiencia de la pintura cromosómica.
- Las limitaciones prácticas incluyen la dependencia de muestras de calidad metafásica y la posible superposición de señales en genomas altamente reorganizados, lo que requiere un desmezclado espectral cuidadoso.
