La producción de microarrays de tejidos, las técnicas de inmunohistoquímica y la digitalización En el Human Protein Atlas
31 de mayo de 2012
Microarrays de tejidos permite un método eficaz para obtener información simultánea de una multitud de tejidos. Piezas representativas de los tejidos se integran en un único bloque de parafina. Las secciones del bloque se utilizan para inmunohistoquímica y el análisis de patrones de expresión de proteínas. Exploración digital genera imágenes correspondientes para la distribución de datos.
El objetivo general de este procedimiento es utilizar un método eficiente para obtener simultáneamente información de múltiples tejidos sobre la expresión de proteínas en un proyecto de alto rendimiento, como el atlas de proteínas humanas. Esto se logra primero seleccionando áreas representativas de tejidos fijados en formalina e incluidos en parafina. A continuación, se perforan las áreas marcadas y los cilindros seleccionados se ensamblan en un único bloque de parafina, un microarreglo de tejidos.
Luego se cortan secciones del MAT y se realiza la inmunohistoquímica. Finalmente, se analiza el patrón de expresión proteica y los datos se publican en el atlas de proteínas humanas. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la expresión proteica en tejidos y células mediante microarreglos de tejidos e inmunohistoquímica.
La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como realizar inmunohistoquímica a partir de bloques individuales de parénquima tisular, es que se puede conservar material biológico valioso y los experimentos son más reproducibles. Otra ventaja de esta técnica es que se pueden reducir los costos de ENT, así como el tiempo de procesamiento en el laboratorio. Quien demostrará este procedimiento será Ian Call Bay, un técnico de laboratorio de mi laboratorio, para obtener una longitud estandarizada de los núcleos de tejido.
Marque el estilete. Se recomienda dejar márgenes de 2,5 a 3,0 milímetros en cada lado del bloque de parafina para evitar que se agriete al montar los punzones adecuados. Afloje los tornillos de cabeza hexagonal que sujetan el punzón y coloque el punzón de manera que la ranura del buje del punzón quede firmemente apoyada contra la varilla metálica en el bloque en V de plástico.
Ajuste los tornillos, asegurándose de que el borde del clip metálico esté horizontal. Inserte el punzón receptor a la izquierda y el punzón donante a la derecha. Utilice los botones de ajuste XY y sus lecturas digitales del micrómetro para mover los punzones a lo largo de los ejes X e Y.
Para reiniciar la máquina, presione el botón cero a BS para alternar entre pulgadas y milímetros; presione el botón de pulgadas y milímetros. Al utilizar un punzón de un milímetro para una plantilla de nueve por ocho, la separación entre los orificios debe ser de dos milímetros, medida entre los centros de los orificios, para evitar que el punzón receptor se inserte demasiado y se dañe. Establezca la profundidad máxima para el avance del punzón colocando un casete vacío en el soporte y utilizando el tornillo de tope de profundidad en la esquina superior izquierda de la guía Z. Ajuste la posición inferior del punzón receptor a un milímetro por encima del fondo del casete. Después de seleccionar y marcar el área relevante en una sección de tejido y diseñar una plantilla para la producción de microarreglos de tejidos, coloque el bloque receptor en el soporte y utilice el destornillador más pequeño para apretar los tornillos.
Evite apretar demasiado los tornillos para prevenir que la parafina se desprenda del casete. Empuje la punzón receptora aproximadamente cinco milímetros hacia abajo dentro del bloque receptor y use el mango del punzón para rotarlo hacia adelante y hacia atrás. Una vez hecho esto, libere lentamente la presión hacia abajo para que los resortes puedan mover el punzón hacia arriba.
Utilice el estilo para vaciar el punzón y deseche el núcleo de parafina. Luego, mueva la torreta para cambiar al punzón donador. A continuación, coloque el puente del bloque donador con el bloque donador sobre el soporte del bloque receptor.
Utilice un portaobjetos teñido con hematoxilina y eosina correspondiente en el que se haya marcado la región de interés para localizar el tejido que se va a muestrear. Sujete manualmente el bloque donante en posición con la mano izquierda y empuje la punzón con la mano derecha. No empuje el estilete. La tope de profundidad no detiene el movimiento del punzón en la posición adecuada para el bloque donante, por lo que es importante dejar de empujar cuando la segunda marca sea visible en el estilete.
Gire lentamente una vez la manija del punzón. Suelte la presión hacia abajo mientras sigue sosteniendo el bloque donador sobre el puente del bloque donador. Retire el puente y el bloque donador.
Asegúrese de que el punzón donador esté alineado con el orificio que se realizó anteriormente. Ajuste la posición del punzón utilizando los tornillos de fijación. Si el punzón donador y el orificio en el bloque receptor no están alineados, empuje cuidadosamente el punzón hacia abajo hasta que su punta alcance la parte superior del orificio en el bloque receptor.
Mientras mantiene esta posición, utilice el estilete para vaciar el núcleo de tejido en el orificio. La superficie del núcleo debe estar alineada con la superficie del bloque. Devuelva la torreta a la punzón receptora.
Mueva a la siguiente posición con los mandos de ajuste XY y repita el proceso perforando una muestra del bloque receptor hasta que la matriz esté completa. Para retirar el bloque receptor, afloje los tornillos del soporte. Coloque el bloque boca abajo sobre un portaobjetos colocado en un bastidor adecuado y hornee el bloque a 42 grados Celsius durante 40 minutos.
Retire la placa y el bloque del horno y nivele la superficie del bloque pasando suavemente la placa de vidrio. Coloque el bloque con la placa de vidrio sobre una placa refrigerante durante 10 minutos. Retire la placa de vidrio del bloque.
El bloque ya está terminado y listo para el corte. Después del corte, tiña y digitalice la matriz de microarreglos de tejidos con un anticuerpo contra una proteína de interés. Busque la proteína en el Atlas de Proteínas Humanas ingresando al sitio web www.proteinatlas.org.
Ingrese el nombre de un conjunto de proteínas de interés, el número de acceso UniProt, o el nombre HGNC, por ejemplo, insulina. Haga clic en la proteína de interés y desplácese hacia abajo hasta el resumen de tejidos y órganos normales. La descripción general muestra la expresión proteica en el páncreas.
Haga clic en la pestaña. Más datos de tejidos. Aparecerá la vista de tejidos normales ordenada por órgano.
Haga clic en el páncreas para ver los resultados de inmunohistoquímica para tres anticuerpos dirigidos hacia la misma proteína. Haga clic en una imagen para ver una imagen de alta resolución del páncreas. En esta figura, se muestran ejemplos de la calidad de las matrices de microperforaciones de tejido: una matriz recta y adecuadamente alineada, con espacio suficiente entre las filas, columnas y el borde del parafina. Aquí, algunos de los núcleos están demasiado cerca del borde, lo que probablemente provocará problemas durante la sección.
Esta matriz de microarrays de tejido se horneó durante demasiado tiempo y colapsó sin la plantilla correcta. Aquí, una sección cortada adecuadamente con columnas rectas y alineadas está teñida con hematoxilina, eosina y tricrómica. Una hoja defectuosa o sucia podría provocar fisuras como se muestra aquí o secciones comprimidas como esta.
Las células del centro germinativo en los ganglios linfáticos muestran una titulación óptima del anticuerpo, lo que resulta en una tinción citoplasmática específica sin fondo, como se observa aquí. Se encuentra tinción negativa o débil cuando la concentración del anticuerpo primario es demasiado baja o si la proteína diana no está presente en los tejidos inmunomarcados. Esta sección de tejido está sobreteñida debido a una concentración demasiado alta del anticuerpo primario.
El color oscuro provoca dificultades para determinar la localización subcelular debido al desbordamiento, reactividad cruzada y falsos positivos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo producir una matriz de marcadores tisulares y cómo utilizarla al analizar la expresión proteica mediante inmunohistoquímica. También debería tener una buena comprensión de cómo explorar el atlas de proteínas humanas para conocer la expresión proteica en tejidos y células humanas.
Descripción general
Las matrices de microtejidos proporcionan un método eficiente para obtener simultáneamente información de múltiples tejidos para el análisis de expresión proteica. Esta técnica consiste en ensamblar muestras representativas de tejido en un único bloque de parafina, que luego se secciona para inmunohistoquímica e imagen digital.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología
- Histología
Antecedentes
- Las matrices de microtejidos permiten el análisis de alto rendimiento de la expresión proteica.
- Este método conserva el material biológico en comparación con los métodos tradicionales de bloques de tejido individuales.
- Mejora la reproducibilidad y reduce los costos y el tiempo de procesamiento.
- Los datos generados pueden integrarse en recursos como el Atlas de Proteínas Humanas.
Objetivo del estudio
- Demostrar el procedimiento para crear microarreglos de tejidos.
- Analizar los patrones de expresión de proteínas en diversos tejidos.
- Proporcionar un método estandarizado para el análisis de tejidos de alto rendimiento.
Métodos Utilizados
- Selección y marcado de áreas representativas de tejidos incluidos en parafina.
- Extracción de núcleos de tejido y su ensamblaje en un bloque de matriz de tejidos.
- Realización de inmunohistoquímica en cortes procedentes de la matriz.
- Análisis de los patrones de expresión proteica y publicación de resultados.
Resultados principales
- Ensamblaje exitoso de microarreglos de tejidos para el análisis de proteínas.
- Demuestra la reproducibilidad y eficiencia en estudios de expresión proteica.
- Integración de los hallazgos en el Atlas de Proteínas Humanas.
- Representación visual de los patrones de expresión proteica mediante imágenes digitales.
Conclusiones
- Las matrices de microtejidos son una herramienta valiosa para el análisis de expresión proteica de alto rendimiento.
- Este método mejora la eficiencia y conserva las muestras biológicas.
- Los resultados contribuyen a una mejor comprensión de la distribución de proteínas en los tejidos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La tecnología de microarrays de tejidos permite el análisis de expresión proteica de alto rendimiento conservando material biológico escaso, lo que apoya esfuerzos a gran escala de validación de dianas en el descubrimiento de fármacos. Al integrar datos en recursos públicos como el Atlas de Proteínas Humanas, proporciona una base escalable para la desviación mecanicista de riesgos y la identificación de biomarcadores traslacionales en diversas áreas de enfermedades. Este enfoque mejora la confianza predictiva en las primeras etapas del descubrimiento al generar perfiles reproductibles y cuantitativos de expresión proteica a partir de muestras limitadas de pacientes.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar hipótesis terapéuticas en tejidos normales y patológicos para aclarar los patrones de expresión del blanco.
- Valor operativo: Reduce el consumo de muestras biológicas mientras aumenta el rendimiento en campañas de cribado de anticuerpos o dianas.
- Valor predictivo: Facilita la selección de carteras al proporcionar evidencia temprana de la especificidad del blanco y su distribución tisular.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera lecturas cuantitativas estandarizadas de inmunohistoquímica para evaluar la especificidad de reactivos en cientos de núcleos de tejido.
- Valor operativo: Permite condiciones de ensayo reproducibles mediante un único protocolo de tinción, minimizando la variabilidad experimental en cribados a gran escala.
- Valor de plataforma: Crea bloques de microarreglos reutilizables para el perfilado longitudinal de paneles de proteínas en cohortes de enfermedades.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Se alinea con sistemas relevantes para enfermedades mediante el perfilado de la expresión proteica en tejidos cancerosos procedentes de cohortes de pacientes bien anotadas.
- Valor operativo: Facilita la validación de biomarcadores mediante corte consistente e imagen digital de secciones de TMAs.
- Valor traslacional: Apoya el avance ajustado al riesgo mediante la vinculación de la expresión del blanco con datos de patología clínica en bases de datos públicas.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
La producción de matrices microtisulares se enmarca dentro del continuo de descubrimiento, desde la identificación de dianas hasta la validación preclínica, permitiendo el perfilado eficiente de la expresión proteica a gran escala.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante el análisis simultáneo de la expresión proteica en múltiples tipos de tejidos y estados patológicos.
- Selección: Proporciona secciones de tejido listas para ensayos y reproducibles, adecuadas para campañas de selección de inmunohistoquímica de alto rendimiento.
- Análisis: Genera datos cuantificables de expresión proteica mediante análisis digital de imágenes, lo que permite la evaluación comparativa entre condiciones.
- Investigación Traducional: Conecta los hallazgos del descubrimiento con la continuidad preclínica mediante mapas de expresión proteica vinculados a muestras de pacientes anotadas.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma estandarizada y escalable para su uso repetido en múltiples proyectos de validación de anticuerpos y caracterización de dianas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de dianas al reducir la ambigüedad mecanicista mediante un análisis tisular multiplexado.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y la estandarización entre laboratorios al minimizar la variabilidad entre portaobjetos.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al maximizar el rendimiento de datos a partir de muestras clínicas o preclínicas limitadas.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización basada en riesgos de dianas mediante perfiles integrales de expresión en tejidos normales y patológicos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en histología, manipulación de tejidos y técnicas de ensamblaje de microarreglos.
- Depende de instrumentación de precisión para el perforado de núcleos, alineación y corte.
- Necesita protocolos estandarizados para tinción, obtención de imágenes y anotación de datos para garantizar la comparabilidad entre estudios.
- Incluye consideraciones de adaptación al aplicarse a diversos sistemas modelo o tejidos no humanos.
- Comprende limitaciones prácticas relacionadas con la alineación de núcleos, integridad de los cortes y optimización de la tinción, tal como se indica en las demostraciones del procedimiento.
