Métodos de estudio de la morfogénesis neuronal: Ex vivo RNAi electroporación en la corteza cerebral embrionario murino

El objetivo general del siguiente experimento es realizar una evaluación rápida de la función génica en el desarrollo de la corteza cerebral utilizando cortes organotípicos. Esto se logra mediante la introducción de plásmidos, coex, ARN expresante e inhibidor y marcador GFP A en la corteza cerebral murna. Se aplican ráfagas eléctricas cortas al cerebro, lo que permite que el ADN plasmídico transfecte las células progenitoras neuronales.

A continuación, los cerebros se diseccionan, se incrustan y se seccionan para producir cortes organotípicos que pueden sufrir morfogénesis neuronal ex vivo. Los cortes organotípicos se pueden buscar en busca de subpoblaciones de neuronas corticales con defectos migratorios o morfológicos mediante la observación directa de las células marcadas con GFP. Hola, bienvenidos a mi laboratorio en la Universidad de Brown en el departamento de biología molecular hoy, la Dra. Liza y dos estudiantes, Kat Zer y Mark Seba, demostrarán la técnica de electroporación ex vivo y el cultivo de cortes organotípicos, que es una técnica muy útil para los estudios de neurodesarrollo.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en varios aspectos del neurodesarrollo, incluida la neurogénesis, la migración neuronal y la morfogénesis neuronal. Debido a que este análisis se realiza en una aproximación cercana al entorno de IBU, proporciona una alternativa rápida y de bajo costo a la generación de animales transgénicos o knockout para genes de función desconocida. Finalmente, en comparación con la tecnología de operación eléctrica in vivo, el éxito de estos experimentos de operación eléctrica en vivo no depende de la cirugía competente, el desarrollo de habilidades y se pueden realizar con un tiempo de entrenamiento más corto y una habilidad.

Después de sacrificar a una rata hembra preñada, diseccione los embriones en HBSS completo y helado, manteniéndolos en sus sacos placentarios individuales. A continuación, en la solución fría de HBSS, libere un embrión del saco y corte su cabeza después de la primera vértebra para una inyección, coloque la cabeza en un trozo de papel paraformado encima de una placa de Petri utilizando una jeringa Hamilton hecha a medida. Inyecte de seis a ocho microlitros de mezcla verde rápida de ADN a través del tercer ventrículo.

A partir de ahí, la mezcla llenará ambos ventrículos laterales en las vesículas corticales. Para la electroporación, se utilizan electrodos de platino BTX clamper. Coloque el electrodo positivo hacia el lado de la corteza que se electroporará.

Por ejemplo, el electrodo debe estar en la parte superior de la cabeza para la corteza dorsal. Para una alta eficiencia de transfección, siempre ajuste la concentración de ADN a un microgramo por microlitro y use ADN aislado de una preparación Maxi. Si es necesario, utilice un kit libre de endotoxinas para purificar el ADN después de la electroporación.

Incuba la cabeza en hielo durante al menos cinco minutos antes de diseccionarla. Es muy importante utilizar la cantidad correcta de pulsos eléctricos y corriente al realizar la electroporación para evitar dañar los cerebros embrionarios más jóvenes. Después de la electroporación, el tejido se vuelve muy frágil.

Es importante hacer las disecciones con mucho cuidado, ya que la piel y la escuela pueden tirar de las meninges de las vesículas corticales, y esto podría dañar las vesículas corticales al ser extraídas del cráneo. Después de cinco minutos, disecciona el cerebro en frío. Los HBSS comienzan haciendo una pequeña incisión en el costado de la cabeza y pelando la piel de los lados de la cabeza.

A continuación, con pinzas finas, retire suavemente la pia del cerebro. Extrae el cerebro intacto del cráneo. Cuando termine, mantenga el cerebro en HBSS helado y prepárese para incrustar el tejido.

Comience a llenar los moldes con un 3% de punto de fusión bajo. Agros. Coloque los moldes sobre hielo para que los agros se solidifiquen cerca del fondo del molde. En primer lugar, asegurarse de que el cerebro permanezca apoyado y centrado.

Ahora, con pinzas finas, retire suavemente un cerebro del HBSS, absorba el exceso de tampón con una toallita kim o papel de filtro y coloque el cerebro en el punto de fusión bajo. Agros. A continuación, utilice una punta de pipeta para hacer girar el cerebro dentro del molde y maximizar el contacto entre los agros y el tejido. Con todos los cerebros transferidos, coloque cada cerebro aproximadamente en la misma orientación y profundidad dentro de su molde.

Los aros se solidificarán en unos cinco minutos. Así que trabaja rápido. Deje que los aros se solidifiquen por completo incubando cinco minutos adicionales en hielo.

Recorte el exceso de aros antes de montar los bloques. A continuación, fije los bloques de agros entre sí con un adhesivo plástico de unión rápida, cada cerebro de una pila debe colocarse con sus bulbos olfativos hacia arriba. Una vez que los bloques estén unidos, recorta los aros para asegurarte de que cada cerebro sea cortado por el vibrato.

Luego, sumérjalos inmediatamente en HBSS helado. Para cortar los bloques, ajuste la velocidad de los vibratos a una velocidad baja, aproximadamente la mitad del máximo, y ajuste la frecuencia de vibración de la cuchilla en el ajuste más alto. A continuación, genere cortes coronales de 250 micras de grosor, recupere los cortes con una espátula fina doblada y transfiéralos a los pocillos de tejido con un cepillo fino o pinzas.

Si el tejido se cae fuera de los agros, el contacto con los agros de tejido no se formó lo suficiente en una campana de cultivo de tejidos, prepare una placa de seis pocillos con 1,8 mililitros de medios de cultivo en rodajas por pocillo y coloque insertos organotípicos de laminina política lisina en cada uno. Bueno, agregue 500 microlitros de medios de cultivo en rodajas a la parte superior de los insertos de rodajas organotípicas. A continuación, transfiera hasta cinco rebanadas a cada inserto.

A continuación, retire el exceso de medios de la parte superior de las rodajas para asegurarse de que las rodajas conserven su morfología tanto como sea posible y tengan una muerte celular mínima. Es importante que se mantenga una interfaz de aire líquido saludable y que las rodajas no floten en el medio. Finalmente, incube las rodajas a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada.

Reemplace la mitad del volumen de medios debajo de la membrana cada dos días. Las rodajas no deben estar flotando en el medio, las neuronas que expresan construcciones electroporadas se pueden visualizar tan pronto como ocho horas después de la electroporación después de los días deseados de cultivo. Fije las rodajas en la membrana para su análisis.

Lave cada inserto típico orgánico con PBS tibio durante cinco minutos. Realice tres lavados de PBS en total y luego fije el tejido con aldehído de paraformado al 4% durante una hora a cuatro grados centígrados. Después de la fijación, los tejidos se pueden analizar con marcadores celulares o simplemente teñir con tinción de ganchos Después de una hora, lavar las rodajas con tres lavados de 10 minutos en un XPBS.

A continuación, permear las rodajas durante dos horas a temperatura ambiente en una solución de suero de cabra al 10% en un XPBS con una suave agitación. A continuación, tiñe los pañuelos con ganchos durante una hora a temperatura ambiente agitando suavemente. Elimine la mancha con tres lavados de 10 minutos en un XPBS con una suave agitación mientras espera.

Coloque los portaobjetos de vidrio esmerilado en una cámara de agua que sea lo suficientemente profunda como para bañar los pañuelos después de colocarlos en los portaobjetos. Para montar las lonchas. Primero, corte la membrana con un bisturí.

En segundo lugar, con pinzas finas, transfiera hasta cinco rodajas unidas a la membrana a cada portaobjetos sumergido en agua. En tercer lugar, retire el exceso de agua de cada portaobjetos. En cuarto lugar, aplique una gota de solución de montaje en el suelo a cada corte de cerebro.

Y, por último, coloque suavemente un cubreobjetos encima de las rodajas y elimine las burbujas de aire. A continuación, los cortes están listos para la microscopía en función de la cantidad de ADN electroporado y de la fase embrionaria. En la electroporación, se encontró que la eficiencia de la transfección varía.

Ocho horas después de la transfección con un silenciador de P, las células vectoriales de GFP comenzaron a expresar GFP. Durante un período de cultivo más largo, las células experimentan una secuencia normal de eventos neurogénicos que incluyen proliferación, migración y diferenciación neuronal temprana. Estos cortes mantuvieron su morfología durante cinco días, siempre que la interfaz del aire del medio estuviera bien mantenida mientras se intentaba este procedimiento.

Es importante llevar a cabo todo el experimento desde el momento en que se sacrifica al animal hasta el momento en que se colocan las rodajas en los insertos de la membrana en menos de dos horas para minimizar la muerte celular después de este procedimiento. Se pueden realizar otras adiciones de factores exógenos a la lisis organotípica para responder a preguntas como, ¿cuál es el papel de los diferentes factores de crecimiento o agentes farmacológicos en los diversos mecanismos del neurodesarrollo?