Métodos de estudio de la morfogénesis neuronal:

El objetivo general del siguiente experimento consiste en realizar una evaluación rápida de la función génica en el desarrollo de la corteza cerebral mediante el uso de cortes organotípicos. Esto se logra introduciendo plásmidos, coex, que expresan un ARN inhibidor y un marcador GFP, en la corteza cerebral embrionaria. Se aplican breves pulsos eléctricos al cerebro, lo que permite que el ADN plasmídico transfecte las células progenitoras neuronales.

A continuación, los cerebros se disecan, incluyen e incrustan, y luego se seccionan para producir cortes organotípicos que pueden experimentar morfogénesis neuronal ex vivo. Los cortes organotípicos pueden examinarse en busca de subpoblaciones de neuronas corticales con defectos migratorios o morfológicos mediante la observación directa de las células marcadas con GFP. Hola, bienvenidos a mi laboratorio en la Universidad Brown, en el departamento de biología molecular. Hoy, la Dra. Liza y dos estudiantes, Kat Zer y Mark Seba, demostrarán la técnica de electroporación ex vivo y el cultivo de cortes organotípicos, una técnica muy útil para estudios del desarrollo neurológico.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en diversos aspectos del desarrollo neuronal, incluyendo neurogénesis, migración neuronal y morfogénesis neuronal. Dado que este análisis se realiza en una aproximación cercana al entorno IBU, proporciona una alternativa de bajo costo y rápida frente a la generación de animales transgénicos o knock-out para genes de función desconocida. Por último, en comparación con la tecnología de electrooperación in vivo, el éxito de estos experimentos de electrooperación in vivo no depende de una cirugía experta ni del desarrollo de habilidades especializadas, y puede realizarse con un tiempo de entrenamiento más corto y menor destreza.

Después de sacrificar una hembra de ratón preñada, diseccionar los embriones en HBSS completo frío, manteniéndolos dentro de sus bolsas placentarias individuales. A continuación, en la solución fría de HBSS, liberar un embrión de la bolsa y cortarle la cabeza tras la primera vértebra para realizar una inyección; colocar la cabeza sobre un trozo de papel paraformado colocado encima de una placa de Petri utilizando una jeringa Hamilton hecha a medida. Inyectar seis a ocho microlitros de mezcla de ADN con verde rápido a través del tercer ventrículo.

A partir de ahí, la mezcla llenará ambos ventrículos laterales en las vesículas corticales. Para la electroforesión, se utilizan electrodos de platino en forma de pinza BTX. Coloque el electrodo positivo hacia el lado de la corteza que se va a electroforizar.

Por ejemplo, el electrodo debe colocarse en la parte superior de la cabeza para el cortex dorsal. Para obtener una alta eficiencia de transfección, ajuste siempre la concentración de ADN a un microgramo por microlitro y utilice ADN aislado mediante un Maxi prep. Si es necesario, use un kit libre de endotoxinas para purificar el ADN después de la electroforesis.

Incube la cabeza sobre hielo durante al menos cinco minutos antes de diseccionarla. Es muy importante utilizar la cantidad adecuada de pulsos eléctricos y corriente al realizar la electroforesis para evitar dañar los cerebros embrionarios más jóvenes. Después de la electroforesis, el tejido se vuelve muy frágil.

Es importante realizar las disecciones con mucha precaución, ya que la piel y el cráneo pueden ejercer tracción sobre las meninges de las vesículas corticales, lo que podría dañar las vesículas corticales al extraerlas del cráneo. Después de cinco minutos, diseque el cerebro en frío. HBSS comience haciendo una pequeña incisión en el lado de la cabeza y retire la piel de los lados de la cabeza.

A continuación, con pinzas finas, retire suavemente la pía del cerebro. Extraiga el cerebro intacto del cráneo. Una vez finalizado, mantenga el cerebro en HBSS frío con hielo y prepare el tejido para inclusión.

Comience a llenar los moldes con Agros al 3 % de punto de fusión bajo. Coloque los moldes sobre hielo para que el Agros se solidifique cerca de la parte inferior del molde. Primero, asegúrese de que los cerebros permanezcan sostenidos y centrados.

Ahora, con pinzas finas, retire suavemente un cerebro del HBSS, absorba el exceso de tampón con una toalla de papel absorbente o papel filtro, y coloque el cerebro en el punto de fusión baja. Agros. Luego, use la punta de una pipeta para girar el cerebro dentro del molde y maximizar el contacto entre el agros y el tejido. Una vez transferidos todos los cerebros, coloque cada cerebro en aproximadamente la misma orientación y profundidad dentro de su molde.

Los aros se solidificarán en aproximadamente cinco minutos. Trabaje rápidamente. Deje que los aros se solidifiquen completamente incubándolos cinco minutos adicionales en hielo.

Recorte el exceso de aros antes de montar los bloques. Luego, fije los bloques de agros entre sí utilizando un adhesivo plástico de unión rápida, colocando cada cerebro en la pila con sus bulbos olfativos hacia arriba. Una vez unidos los bloques, recorte los aros para asegurar que cada cerebro sea seccionado por el vibrátomo.

Luego, sumérjalos inmediatamente en HBSS frío con hielo. Para cortar los bloques, configure la velocidad del vibrátomo en una velocidad baja, aproximadamente la mitad de la máxima, y ajuste la frecuencia de vibración de la hoja en el valor más alto. A continuación, genere cortes coronales de 250 micrones de grosor, retire los cortes utilizando una espátula fina doblada y transfiéralos a pozos para tejidos con un pincel fino o pinzas.

Si el tejido sale del agaros, el contacto entre el tejido y el agaros no se formó adecuadamente en una cabina de cultivo celular; prepare una placa de seis pocillos con 1,8 mililitros de medio de cultivo de láminas por pocillo, y coloque en cada uno insertos organotípicos con código de lisina de laminina. Añada 500 microlitros de medio de cultivo de láminas en la parte superior de los insertos de láminas organotípicas. Luego transfiera hasta cinco láminas a cada inserto.

A continuación, retire cualquier medio en exceso de la superficie de los cortes para asegurar que conserven su morfología en la mayor medida posible y presenten una muerte celular mínima. Es importante mantener una interfase aire-líquido saludable y que los cortes no floten en el medio. Finalmente, incube los cortes a 37 grados Celsius en un incubador humedecido.

Reemplace la mitad del volumen de medio debajo de la membrana cada dos días. Las secciones no deben flotar en el medio; las neuronas que expresan los constructos electroporados pueden visualizarse tan pronto como ocho horas después de la electro poración, tras los días deseados de cultivo. Fije las secciones en la membrana para su análisis.

Lave cada inserto orgánico tópico con PBS tibio durante cinco minutos. Realice un total de tres lavados con PBS, y luego fije el tejido con paraformaldehído al 4 % durante una hora a cuatro grados centígrados. Tras la fijación, los tejidos pueden analizarse con marcadores celulares o simplemente teñirse con tinción de hematoxilina. Después de una hora, lave las secciones con tres lavados de diez minutos cada uno en PBS 1X.

A continuación, permeabilice las secciones durante dos horas a temperatura ambiente en una solución de suero de cabra al 10 % en un XPBS con agitación suave. Luego, tiña los tejidos con anticuerpos durante una hora a temperatura ambiente con agitación suave. Elimine la tinción mediante tres lavados de 10 minutos cada uno en un XPBS con agitación suave mientras espera.

Coloque portaobjetos de vidrio esmerilado en una cámara de agua lo suficientemente profunda como para cubrir los tejidos después de colocarlos sobre los portaobjetos. Para montar las secciones, primero corte libremente la membrana con un escalpelo.

Segundo, utilizando pinzas finas, transfiera hasta cinco secciones con membrana adherida a cada portaobjetos sumergido en agua. Tercero, elimine cualquier exceso de agua de cada portaobjetos. Cuarto, aplique una gota de solución de montaje permanente a cada sección cerebral.

Y por último, coloque suavemente un cubreobjetos encima de las secciones y elimine cualquier burbuja de aire. Las secciones estarán entonces listas para la microscopía, dependiendo de la cantidad de ADN electrotransferido y del estadio embrionario. En el momento de la electrotransferencia, se observó que la eficiencia de transfección variaba.

Ocho horas después de la transfección con un silenciador P, las células del vector GFP comenzaron a expresar GFP. Durante un período de cultivo más prolongado, las células experimentan una secuencia normal de eventos neurogénicos, incluyendo proliferación, migración y diferenciación neuronal temprana. Estas láminas mantuvieron su morfología durante cinco días, siempre que se mantuviera adecuadamente la interfase aire-medio durante el intento de este procedimiento.

Es importante realizar todo el experimento desde el momento en que el animal es sacrificado hasta el momento en que los cortes se colocan en los insertos de membrana en menos de dos horas para minimizar la muerte celular tras este procedimiento. También se pueden realizar otras adiciones de factores exógenos a la lisate organotípica para responder preguntas como, ¿cuál es el papel de diferentes factores de crecimiento o agentes farmacológicos en los diversos mecanismos del neurodesarrollo?