Name: La expansión de los linfocitos T citotóxicos sangre del cordón umbilical que Citomegalovirus Target, Virus de Epstein-Barr, adenovirus y (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: Aprende a generar linfocitos T citotóxicos específicos contra múltiples virus a partir de sangre de cordón umbilical usando un método compatible con GMP. Esta técnica permite producir células inmunitarias para aplicaciones clínicas.

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Este trabajo fue apoyado por un Dan L. Duncan beca de investigación colaborativa (CMB y EJS), el Instituto Nacional del Corazón Pulmón, y Sangre (US4HL081007), una Sociedad de Leucemia y Linfoma Investigación Clínica premio Scholar (CMB), y el Instituto Nacional del Cáncer (RO1 CA06150816; EJS).

1. Aislamiento de células mononucleares (día 0) <ol><li> Insertar espiga de adaptador luer hembra en el puerto de salida de la fracción de 20% de la unidad de sangre del cordón umbilical, conecte la jeringa y retirar la sangre. Transferir sangre descongeladas a 20 ml de RPMI calentó en tubo de centrífuga 50 mL. Enjuague la bolsa de sangre de cordón con 5 ml de RPMI y transferir al tubo de centrífuga mismo. </li><li> Centrifugar las células durante 10 minutos a 400 x g. Aspirar el sobrenadante. </li><li> Resuspender las células en 20 ml de RPMI caliente. Células de capa en 15 ml de Lymphoprep en 50 ml tubo de centrífuga. Centrifugar 40 minutos a 400 x g. </li><li> Cosechar la interfaz que contiene las células mononucleares y se lava en 20 ml de RPMI. Centrifugar durante 10 minutos @ 450 x g. </li><li> Aspirar el sobrenadante y lavar con 20 ml de RPMI. Contar las células y centrifugar durante 5 minutos a 400 x g. </li><li> Aspirar el sobrenadante y volver a suspender las células a 5 x 10 6 células mononucleares / mL de CellGenix DC medios de comunicación (sin suero). Retirar 1 mL para EBV-LCL generación y puesta en 15 ml centrifuge tubo. </li></ol> 2. Generación de células dendríticas (comenzando en el día 0) <ol><li> Placa de 2 ml de células (ya se encuentran en 5 x 10 6 células / ml de medios de comunicación DC) por pocillo en una placa de 6-así. Dejar en incubación durante 1-2 horas. </li><li> Después de 1-2 horas, se lavan las células no adherentes por lavado 3-4 veces con PBS. Recoger las células no adherentes y congelar. Añadir 2 ml / pocillo de medio de DC que contienen 1000 U / ml de IL-4 y 800 U / ml de GM-CSF. </li><li> 3-4 días después de la iniciación DC, reponer la IL-4 y GM-CSF mediante la adición de 100 l / pocillo de medio que contenía una concentración final de 1000U/mL IL-4 y 800 U / ml de GM-CSF. </li><li> En el día 5-6, la cosecha DC raspando el pocillo con una pipeta de transferencia. Contar las células grandes y centrifugar durante 5 minutos @ 400 x g. Aspirar los medios de comunicación y DC resuspender en 2x10 6 células / ml de los medios de comunicación de CC. Añadir 0,5 ml / pocillo de una placa de 24 pocillos. </li><li> Transducir la DC usando el vector Ad5f35pp65 en una celda por MOI de 10 unidades infecciosas. Añadir vector a cada pocillo en una placa de 24 pocillos. Se incuban las células durante 1,5 horas. Después de 1,5 horas, agregar 1,5 ml / pocillo de medio que contiene DC: 1000 U / ml de IL-4, 800 U / ml de GM-CSF, 10 ng / ml de TNF-alfa, 1 mg / ml de PGE-1, 100 ng / mL IL-6, y 10 ng / ml de IL-1beta. Estas citoquinas madurar los países en desarrollo. </li></ol> 3. Generación de EBV-LCL (a partir del día 0) <ol><li> Centrifugar el tubo que contiene las 5 x 10 6 células mononucleares. Añadir 200 l de concentrado EBV B95.8 sobrenadante y 1,8 ml de medio completo (RPMI + 10% de FBS + 2 mM L-glutamina) que contiene ciclosporina (1 ug / ml). </li><li> Alícuota de 100 l de células en 10 pocillos de una placa de 96 pocillos y 200 mu l en 5 pozos. Añadir 100 l de medios de comunicación completa ciclosporina + a los pocillos que contienen sólo 100 l de células. Llenar los pocillos restantes con agua estéril. </li><li> Alimente el semanario LCL y ampliar de una placa de 96 pocillos a una placa de 24 pocillos después de 2 semanas. Después de otra semana, transferir a un matraz T25 y en la transferencia de semana posteriorun matraz T75. En esta etapa se recomienda congelar las alícuotas de LCL. Por lo general se toma 1 mes para generar un número suficiente de LCL. </li></ol> 4. CTL Iniciación - 7 días después del inicio de los DC <ol><li> Los países en desarrollo Harvest e irradiar a los 30 Gy. Lave 4 x y el recuento. Resuspender DC en los medios de células T que contienen suero humano (45% de RPMI, 45% CLICK, 10% de suero humano, 2 mM de L-glutamina) @ 1 x 10 5 DCS / ml. </li><li> Descongelar las células no adherentes de la etapa 2.2. Lavar las células, y contar. Resuspender en 2 x 10 6 células no adherentes / mL en medio de células T que contienen suero humano. Añadir 10 ng / ml de IL-7 e IL-12-, y 5 ng / ml de IL-15. Añadir 1 ml de células por pocillo en una placa de 24 pocillos. Añadir 1 ml de DC por pocillo. Llenar los pocillos vacíos de 24-así placa con agua estéril. </li><li> 7 días después de la iniciación de células T, la alimentación y / o dividir las células con medio de células T que contienen suero humano. </li><li> 9-12 días después de la iniciación de células T, las células T congelar hasta que la LCL están listos. </li><li> ONCE LCL se han expandido y se pasan en matraces T75, la transducción de la LCL por centrifugación durante 5 minutos a 400 x g. Añadir el vector al sedimento de células en una MOI de 100 unidades infecciosas por célula. Incubar durante 1,5 horas. Después de 1,5 horas, resuspender en medio completo a 5 x 10 5 LCL / ml y añadir 2 ml por pocillo en una placa de 24 pocillos. 12 </li><li> Después de 2 días, la cosecha de la LCL e irradiar a los 40 Gy. Lave 4 x y el recuento. Resuspender el LCL en los medios de comunicación de células T que contienen suero humano a 2,5 x 10 5 células / ml. Añadir 1 ml de LCL por pocillo de una placa de 24 pocillos. Además, añadir 5 x 10 6 LCL a un dispositivo de cultivo Grex40 así como 5 ng / ml de IL-15. 13 </li><li> Recoger las células T. Centrifugar durante 5 minutos a 400 x g, aspirar el sobrenadante y se resuspenden en medios de células T que contienen suero humano a 1 x 10 6 células T / mL. Añadir 5 ng / ml de IL-15 y se añade 1 ml / pocillo de células T (un total de 1 x 10 6 células T) para el LCL que ya están en la placa de 24 pocillos. En el Grex40, llevarel volumen total de medios de hasta 30 ml. </li><li> En días 3-4 después de la estimulación, si las células son confluentes después dividir (en la placa) 1:1 y añadir medio fresco que contenía 50 U / ml de IL-2. Si ellos no son confluentes después simplemente aspirar ½ los medios de comunicación y sustituir con medio que contenía 50 U / ml de IL-2. En la Grex40, aspirar el medio de los medios de comunicación, reemplazar con medio fresco, y se añaden 50 U / ml de IL-2. </li><li> En el día 7, repetir como en el paso 4,6 pero el uso de IL-2 en el día de la estimulación no, IL-15. </li></ol> 5. Los resultados representativos Un esquema del protocolo de fabricación GMP aprobado por la FDA se representa en la figura 1. El proceso dura unos 50 días. Los métodos típicos de la generación de virus específicos de las células T expandir pre-existentes de células T de memoria, sin embargo, carece de experiencia en la sangre del cordón virus de las células T y por lo tanto necesitamos vivo prime ingenuo células T ex. Para ello, se utilizan células dendríticas, así como las citoquinas IL-7, IL-12 e IL-15,necesario para la generación de especificidad viral. Después de 3 estimulaciones, el rendimiento debería ser más de 100x10 6 células. Si las células no hay suficientes, estimulaciones adicionales se puede realizar hasta que el número deseado de CTLs están disponibles. La mayoría de estas células debe ser CD3 + con una mezcla de CD4 + y CD8 + células T. No debe ser menos de 15% de células NK (CD3-/CD56 +) y menos de 1% células B CD19 + (Figura 2). El CTL expandido debe reconocer el antígeno pp65 de CMV, hexón y pentón de adenovirus, así como numerosos antígenos de EBV que se expresan en EBV-LCL. Cuando se probó en un ensayo ELISPOT, CTL debería secretar más IFN-? en respuesta a estos antígenos que los antígenos irrelevantes (Figura 3). El CTL también debe lisar virales pulsadas con péptidos tales objetivos blastos PHA. En un ensayo de liberación de 51Cr, CTL lyse debe LCL, CMVpp65 de pulso y Adenovirus hexón y /o objetivos pentón de pulso pero no objetivos pulsadas con péptidos irrelevantes (Figura 4). <img src="/files/ftp_upload/3627/3627fig1.jpg" alt="Figura 1."/> Figura 1. Generación de múltiples virus CTL específicos de sangre del cordón umbilical. Esquemática que muestra todo el proceso de fabricación de CTL a partir de sangre del cordón umbilical. En primer lugar las células mononucleares de sangre de cordón umbilical se aíslan de la fracción de 20% de la unidad de sangre de cordón umbilical fraccionado. Con la excepción de 5x10 6 células que se guardan para la generación de LCL, todas las células se colocaron en placas en medio de células dendríticas durante 1-2 horas, momento en el cual las células no adherentes se recogieron y congelaron. La DC se alimenta entonces DC de medios que contiene IL-4 y GM-CSF. Después de 5 días de cultivo, la DC se maduran y transducidas con un vector adenoviral que contiene el antígeno inmunodominante CMV pp65. En la iniciación, estas DC se combinan con las células no adherentes, así como las citoquinas IL-7, IL-12,y IL-15. En estimulaciones posteriores, el vector adenoviral se utiliza el mismo para transducir EBV-LCL, que se utilizan como células presentadoras de antígeno. IL-15 se utiliza en la segunda estimulación y la IL-2 a partir de entonces. <img src="/files/ftp_upload/3627/3627fig2.jpg" alt="Figura 2."/> Figura 2. Fenotipo de las células T resultante. Se muestra el porcentaje de células vivas incluidas en la puerta de linfocitos. CTL son CD3 + y CD4 + o CD8 +, pero en gran parte CD3-/CD56- y CD19-. <img src="/files/ftp_upload/3627/3627fig3.jpg" alt="Figura 3."/> Figura 3. Funcionalidad de células T. Especificidad de las células T se ensayó por el IFN-γELISPOT. Las células T fueron pulsadas con péptidos solapantes que abarcan toda la proteína de hexón, pentón, pp65, y el antígeno irrelevante 1-IE. CTL solo indica los medios de comunicación solo. LCL autólogas fueron irradiadas y se añadió a 1x10 5 / pocillo. Se muestra el punto medio de la formación de células count de pocillos por triplicado. <img src="/files/ftp_upload/3627/3627fig4.jpg" alt="Figura 4."/> Figura 4. Actividad citolítica de CTL. La capacidad de los CTL resultante para lisar dianas que expresan antígenos virales fue probado en un ensayo de 51 Cr. 51 Cr-autólogas marcadas blastos PHA fueron pulsadas con péptidos solapantes que abarcan el antígeno completo o 51 Cr-LCL autólogas marcadas se cocultivaron con CTL. Después de 4 horas, la liberación gamma se contaron en un contador gamma.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

<html> Las actuales estrategias encaminadas a controlar las infecciones virales después de la TCC puede ser eficaz, pero están asociados con toxicidades significativas, son caros, y no confieren protección a largo plazo contra la infección posterior. De hecho, el uso de algunos fármacos antivirales pueden limitar la expansión de las células T específicas de virus que de otro modo serían de protección. 14 Otra opción es la infusión de las células derivadas del donante T específicos para el virus. Nosotros y otr...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 21870-076 </td></tr><tr><td> DC medios de comunicación </td><td> CellGenix </td><td> 20801-0500 </td></tr><tr><td> EHAA (Medio de Click) </td><td> Irvine Scientific </td><td> 9195 </td></tr><tr><td> Suero Humano </td><td> Gemini Bio Products </td><td> 100-110 </td></tr><tr><td> Gas Permeable Cultureware 18 </td><td> Wilson-Wolf </td><td> 80040S </td></tr><tr><td> IL-2 </td><td> Chiron (TCH Farmacia) </td><td></td></tr><tr><td> IL-12 </td><td> NCI / CTEP </td><td></td></tr><tr><td> IL-15 </td><td> CellGenix </td><td> 1013-050 </td></tr><tr><td> IL-7 </td><td> De I + D </td><td> AFL207 </td></tr><tr><td> IL-1 beta </td><td> De I + D </td><td> AFL201 </td></tr><tr><td> IL-6 </td><td> CélulaGenix </td><td> 1004-050 </td></tr><tr><td> GM-CSF </td><td> TCH Farmacia </td><td></td></tr><tr><td> IL-4 </td><td> De I + D </td><td> <a href="http://www.rndsystems.com/pdf/AFL204.pdf" target="_blank">AFL204</a> </td></tr><tr><td> TNF-alfa </td><td> De I + D </td><td> AFL210 </td></tr><tr><td> Ad5f35pp65 </td><td> BCM Vector CAGT Instalaciones de Producción </td><td></td></tr><tr><td> Transferencia de plasma con adaptador luer hembra </td><td> Carta Médica </td><td> 89-550-66J </td></tr><tr><td> Lymphoprep </td><td> Nycomed </td><td> 1114550 </td></tr></tbody></table>

la expansión de los linfocitos t citotóxicos sangre del cordón umbilical que citomegalovirus target, virus de epstein-barr, adenovirus y

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Las infecciones de virus después de un trasplante de células madre se encuentran entre las causas más comunes de muerte, sobre todo después de la sangre del cordón (CB) trasplante (CBT), donde el CB no contiene cantidades apreciables de células T del virus con experiencia que pueden proteger al destinatario de la infección 1. - 4 Nosotros y otros han demostrado que el virus de CTL específico generado a partir de donantes seropositivos y se infunde al destinatario son seguros y protectores. 5-8 Sin embargo, hasta hace poco, virus específicos de las células T no podría ser generado a partir de sangre de cordón, probablemente debido a la ausencia de virus específicos de las células T de memoria. En un esfuerzo para imitar mejor las condiciones en el cebado in vivo de las células T vírgenes, se estableció un método que utiliza CB-derivados de las células dendríticas (DC) transducidas con un vector adenoviral (Ad5f35pp65) que contiene el antígeno inmunodominante CMV pp65, por lo tanto, conducir especificidad de las células T hacia CMV y adenovirus. 9 Al inicio, utilizamos estas máquinasDCs estructurados, así como CB derivados de células T en la presencia de las citoquinas IL-7, IL-12 e IL-15. 10 En la segunda estimulación se utilizó el EBV de células B transformadas, o EBV-LCL, que expresan tanto latente y antígenos para el VEB lítico. Ad5f35pp65-EBV-LCL transducidas se utilizan para estimular las células T en presencia de IL-15 en la segunda estimulación. Estimulaciones posteriores utilizar Ad5f35pp65-EBV-LCL transducidas y IL-2. De 50x10 6 células mononucleares CB somos capaces de generar más de 150 x 10 6 virus específicos de las células T que lisan los impulsos de antígeno-objetivos y liberación de citoquinas en respuesta a la estimulación antigénica. 11 Estas células se fabrican de una manera GMP usando sólo la fracción de 20% de una unidad de sangre de cordón se fraccionó y se han traducido para el uso clínico.

Aquí se describe la primera práctica de fabricación (GMP)-cumple método de producción de virus específicos de los linfocitos T citotóxicos (CTL) de la sangre del cordón umbilical, una fuente de células T predominantemente ingenuo.

La expansión de los linfocitos T citotóxicos sangre del cordón umbilical que Citomegalovirus Target, Virus de Epstein-Barr, adenovirus y

Las infecciones víricas tras el trasplante de células progenitoras hematopoyéticas se encuentran entre las causas de muerte más comunes, especialmente después del trasplante de sangre de cordón umbilical (SCSU), donde...

El objetivo general de este procedimiento es generar linfocitos T citotóxicos (CTL) derivados de sangre de cordón que reconozcan antígenos de múltiples virus. Esto se logra primero aislado las células mononucleares de la sangre de cordón a partir de la fracción 20% de la unidad de sangre de cordón. El segundo paso consiste en utilizar las células mononucleares para generar células dendríticas, líneas celulares de linfoblastos del virus de Epstein-Barr, o E-B-V-L-C-L, y CTL específicos para el virus.Las células mononucleares, que contienen los linfocitos T, se estimulan con células que han sido transducidas con el vector A five F 35 PP 65. El paso final consiste en confirmar la especificidad de los CTL específicos frente a múltiples virus y congelar los CTL. En última instancia, la especificidad de la expansión de los CTL frente a al menos un antígeno viral puede evaluarse mediante análisis de Ellie SPA y ensayos de citotoxicidad.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque el volumen de sangre central disponible en la fracción al 20% es muy pequeño, lo que significa que hay muy pocas células con las que trabajar. El procedimiento también es bastant

expanding-cytotoxic-t-lymphocytes-from-umbilical-cord-blood-that

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Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Un protocolo de forma rápida, sencilla y rentable para la generación de donantes de origen multivirus CTL específicos (RCTL) para la perfusión del trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas de trasplante (HSCT) con riesgo de desarrollar infecciones por CMV, EBV o Adv. Este proceso de fabricación es conforme a las GMP y debe garantizar la aplicación más amplia de células T inmunoterapia más allá de los centros especializados.

Generación de células T Multivirus específicos para prevenir / tratar las infecciones virales después de trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas

Un nuevo método de CC independiente para la inducción y la expansión de células T específicas de antígeno se describe. HLA A2-Ig células antígeno artificial basada en la presentación (AAPC) se cargan con el HLA-A2 péptidos restringidos a expandirse de manera eficiente CTL del antígeno específico diverso. Esta tecnología tiene un gran potencial para el CTL basado inmunoterapia adoptiva.

HLA-Ig celdas en función de antígeno artificiales presentación para mejorar la eficiencia Ex vivo Ampliación de los Derechos Humanos CTL

El video muestra un ensayo que utiliza células T CD8+ derivadas de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC) para inhibir la replicación del virus de la hepatitis B (VHB) en ratones. Estas células T, modificadas con receptores específicos del VHB, se transfieren a ratones transgénicos. A continuación, los plásmidos del genoma del VHB competentes para la replicación se inyectan directamente en el hígado, lo que permite la absorción del ADN viral. Una vez que los antígenos virales son...

Supresión de la replicación del virus de la hepatitis B mediante linfocitos T específicos de antígenos virales

Las células T reguladoras CD4+ son potentes inmunomoduladores y cumplen funciones importantes en la homeostasis inmunitaria. La escasez de estas células en la sangre periférica dificulta los estudios funcionales, especialmente en el contexto de la infección por VIH-1. Aquí describimos un método para aislar y expandir las Tregs CD4+ funcionales de sangre periférica de individuos infectados por VIH-1.

Nuevas herramientas para expandir células T reguladoras de las personas VIH-1-infected

Novel generaciones de ensayos funcionales tales como el interferón gamma (IFN-γ) ELISPOT, que detectan la producción de citoquinas en el nivel de células individuales y proporcionar tanto la caracterización cuantitativa y cualitativa de las respuestas de células T pueden ser usados ​​para evaluar las respuestas inmunes mediadas por células dirigidas contra la varicela zoster (VZV).

Desarrollo de un Varicela-Zoster inmunidad mediada por células específicas del virus de IFN-γ ELISPOT ensayo para evaluar la raíz del cordón umbilical de Trasplante de Sangre

El objetivo de este protocolo es fabricar células T de grado clínico específicas para patógenos utilizando un dispositivo de enriquecimiento celular de segunda generación, automatizado y de sobremesa que incorpora un sistema cerrado de captura de citocinas y no requiere personal dedicado ni el uso de una instalación GMP. Las células T específicas del citomegalovirus pp65 generadas pueden administrarse directamente a los pacientes.

Enriquecimiento de la célula automatizada de citomegalovirus células T específicas para aplicaciones clínicas utilizando el Sistema de citoquinas de captura

Aquí, demostramos cómo se aíslan los monocitos mediante la separación magnética de perlas de las células mononucleares de sangre periférica después de la centrifugación en gradiente de densidad de la sangre humana anticoagulada. Después de la incubación durante 5 días, los monocitos humanos se diferencian en células dendríticas inmaduras y están listos para procedimientos experimentales en un entorno no clínico.

Generación de células dendríticas derivadas de monocitos humanos de sangre entera

Aquí presentamos una aplicación de una técnica inmunológica estándar (CFSE manchado OT-I proliferación) pretende monitorear rápidamente mediada por el adyuvante de linfocitos T citotóxicos (CTL) generación en vivo. Esta estimación rápida de la capacidad CTL es útil para el desarrollo de vacunas profilácticas contra patógenos intracelulares así como vacunas contra el cáncer terapéutico.

Rápida In Vivo evaluación de las capacidades de generación de linfocitos T citotóxicos de coadyuvante para el desarrollo de una vacuna

Aquí se presenta un protocolo para la supresión efectiva de la replicación del virus de la hepatitis B (VHB) en ratones mediante la utilización de la transferencia de células adoptivas (ACT) de linfocitos T específicos de antígeno viral derivado de células madre (Ag). Este procedimiento puede adaptarse para una posible inmunoterapia basada en ACT de infección por VHB.

Linfocitos T virales derivados de células madre suprimen la replicación del VHB en ratones

Delineamos un protocolo de 9 días para la transducción y expansión de células mononucleares de sangre periférica de rhesus macaque que produce células con excelente coexpresión de los genes de interés en número suficiente para estudios de infusión de eficacia celular.

Transducción y expansión de células T primarias en nueve días con mantenimiento del fenotipo de memoria central

Se presenta un protocolo para la expansión del producto farmacológico de células T Gamma-Delta (γδ). Los linfocitos se aíslan por elutriación y se enriquecen con γδ con ácido zoledrónico e interleucina-2. Las células T alfa-beta se agotan utilizando un dispositivo de separación magnética de grado clínico. Las células γδ se cocultivan con células artificiales presentadoras de antígenos derivadas de K562 y se expanden.

Expansión y enriquecimiento de células T gamma-delta (γδ) a partir de productos humanos aféridos

Aprende a generar linfocitos T citotóxicos específicos contra múltiples virus a partir de sangre de cordón umbilical usando un método compatible con GMP. Esta técnica permite producir células inmunitarias para aplicaciones clínicas.

La expansión de los linfocitos T citotóxicos sangre del cordón umbilical que Citomegalovirus Target, Virus de Epstein-Barr, adenovirus y (Video) | JoVE Journal

La expansión de los linfocitos T citotóxicos sangre del cordón umbilical que Citomegalovirus Target, Virus de Epstein-Barr, adenovirus y

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