En la Asamblea in vitro de la semi-artificial de la máquina molecular y su utilización para la detección del daño del ADN

El objetivo general de este procedimiento es demostrar cómo ensamblar y utilizar un sensor de daño en el ADN con doble marcado que etiqueta dos tipos principales de roturas en el ADN en secciones de tejido. El sensor está compuesto por un oligonucleótido de ADN de 30 tumores, marcado con ZI y Rumina, y una enzima, la topo isomerasa vaccinia tipo uno o vac topo, que se autoensambla. Cuando la vac topo se une al oligonucleótido de 30 tumores, el funcionamiento del sistema comienza cuando la topo isomerasa escinde el oligonucleótido en el extremo tres prima de la secuencia de reconocimiento, dando lugar a una unidad marcada con fitzina activada por vac topo y un hairpin libre marcado con amina.

Con un hidroxilo terminal en la posición tres prima, las unidades tienen una vida breve y se reensamblan rápidamente en la construcción original, que posteriormente se escinde. En ausencia de roturas adicionales de ADN de carácter extra molecular, estas dos unidades se separan y relegan continuamente de manera cíclica. Cuando el sensor molecular se aplica a secciones de tejido con daño en el ADN, la unidad detectora marcada con Fitz se une selectivamente a las roturas de ADN con extremos romos que poseen hidroxilo en la posición cinco prima.

La unidad detectora marcada con dominio R ligará un extremo romo con fosfato en cinco primas. Si está presente la ADN ligasa T4, los resultados obtenidos muestran la presencia y distribución de roturas de ADN tipo uno y tipo dos en las células, basándose en microscopía de fluorescencia. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes para la detección de HESIs, como la técnica de tunnel, es que es más específica y proporciona información adicional mediante el marcado tanto de las fases autoestables como fagocíticas de la apoptosis.

Desde la perspectiva de la nanotecnología, el sensor ejemplifica un enfoque habilitado por bioelementos que adapta estructuras y arquitecturas biológicas reales a la construcción de dispositivos moleculares no tóxicos. En general, las personas nuevas en este método podrían tener dificultades porque su éxito depende del uso de una preparación altamente activa de Toro SOM y del procesamiento adecuado de las secciones para evitar una digestión excesiva por la proteinasa K. Las secciones de tejido para este procedimiento deben prepararse antes del ensamblaje del dispositivo molecular. Secciones de cinco a seis micrones de grosor cortadas de paraformaldehído.

Se recomiendan bloques de tejido fijados en parafina. Coloque el portaobjetos con la sección de tejido en una gradilla y elimine la parafina con xilol durante 15 minutos. Después de 15 minutos, transfiera a un baño fresco de xilol durante cinco minutos adicionales.

Rehidrate la sección pasando la laminilla a través de estas concentraciones graduadas de etanol: 96 % de etanol dos veces durante cinco minutos cada vez, 80 % de etanol durante cinco minutos y luego agua.

Dos veces durante cinco minutos cada una. Después de la rehidratación, digerir la sección con proteinasa K. Usando 100 microlitros de una solución de 50 microgramos por mililitro por sección, incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente en una cámara humedecida. Dependiendo del tipo de tejido, es posible que sea necesario ajustar el tiempo de digestión, pero tenga cuidado de evitar una digestión excesiva, ya que provoca la desaparición de la señal y la alteración de la sección cuando la digestión está completa.

Lave el portaobjetos con agua destilada dos veces, durante 10 minutos cada vez. Aplique BSA al 2 % para el bloqueo previo e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente en una cámara humidificada. Durante este tiempo, ensamble la máquina molecular como se muestra a continuación en este video.

Todos los reactivos para el ensamblaje de la máquina molecular se preparan para un volumen total de 25 microlitros, lo cual es suficiente para una detección en una sección de tejido de tamaño promedio. El volumen puede aumentarse según sea necesario en un tubo plástico pequeño. Combine los siguientes reactivos en este orden mediante agua destilada.

Tampón de ADN ligasa al 15 % de polietilenglicol 8.000, oligonucleótido marcado con doble etiqueta de vaccinia topoisomerasa uno y ADN ligasa T4 mezclados suavemente mediante pipeteo. El constructo molecular se autoensamblará casi instantáneamente en esta solución y puede usarse inmediatamente a temperatura ambiente. Para comenzar el procedimiento de marcado de roturas de ADN, aspire la solución de prebloqueo del portaobjetos.

Aplique 25 microlitros de la mezcla de reacción completa a cada sección. Coloque un cubreobjetos de plástico sobre la sección y coloque el portaobjetos en una cámara humidificada. Proteja de la luz envolviendo la cámara con papel de aluminio e incube durante una hora a temperatura ambiente.

Aunque se pueden observar señales tanto de ligasa como de topo después de la incubación de una hora, en muchos casos, la señal de ligasa puede mejorarse aún más. Para potenciar la señal, vuelva a aplicar la mezcla de reacción sin vac topo y el oligonucleótido uno, pero con el oligonucleótido tres y la ligasa de ADN T cuatro, coloque una cubreobjetos de plástico sobre la sección e incube en una cámara humidificada durante 18 horas. Al día siguiente, a temperatura ambiente, sumerja suavemente la preparación verticalmente en un frasco Coplin que contenga agua a temperatura ambiente para retirar la cubreobjetos.

Luego, lave la sección con agua destilada tres veces durante 10 minutos cada vez. Enjuague la sección con tampón de bicarbonato sódico. Este enjuague con solución alcalina potencia la fluorescencia de fitzy, que es sensible al pH y se reduce significativamente por debajo de un pH de siete.

Finalmente, cubra la sección con una solución antidesvanecimiento que también contenga DPI para contraste, tiñendo los núcleos, y coloque una lámina de cobre. Las secciones ya están listas para la microscopía de fluorescencia. En esta figura se muestra una sección de tejido del timo tratado con dexametasona donde la máquina molecular ha detectado roturas de ADN tipo uno y roturas de ADN tipo dos con extremos romos, en las áreas corticales del timo que están experimentando apoptosis, con fluorescencia citoplasmática verde que indica roturas de tipo ADN dos, y macrófagos corticales que digieren el material nuclear de timocitos apoptóticos.

Esta señal es producida por vac topo y se localiza en lisosomas FGA con ADN que contiene hidroxilo en posición cinco prima. Roturas de doble cadena con fluorescencia roja indican etiquetas de un tipo de rotura del ADN, núcleos de timocitos apoptóticos no ingeridos por macrófagos. Grandes cantidades de timocitos experimentan simultáneamente apoptosis.

Acompañado por la generación de roturas de doble cadena con fosfato en el extremo cinco prime, visualizadas mediante marcado basado en ligasa. Estas roturas se localizan en la periferia nuclear y forman patrones en forma de anillo. Todos los núcleos celulares aparecen en azul, visualizados mediante tinción de contraste con dpi.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar no permitir que los cortes se sequen entre la adición de diferentes soluciones. Además, mantenga todas las preparaciones enzimáticas en hielo antes de añadir los cortes y proteja sus sondas fluorescentes de la luz durante la reacción de marcado después de su desarrollo. La técnica permitió la visualización de todas las fases de la desensamblaje celular heto.

Este sensor en sí mismo es un ejemplo del enfoque de nanotecnología verde en el diseño de partículas, sondas y máquinas a escala nanométrica. Este enfoque combina componentes artificiales con partes moleculares de máquinas naturales. El objetivo es eliminar la toxicidad y la reactividad biológica adversa de estos materiales nano dispersos altamente.