Name: En la Asamblea in vitro de la semi-artificial de la máquina molecular y su utilización para la detección del daño del ADN (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Aprende a ensamblar un sensor molecular de daño en el ADN con doble marcaje fluoróforo usando topoisomerasa de vaccinia. Este método permite visualizar roturas de doble cadena en secciones de tejido para estudios de biología molecular y cáncer.

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Esta investigación fue apoyada por conceder R01NS062842 del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares de los Institutos Nacionales de Salud (VVD) y por las subvenciones R21 NS064403 del Instituto Nacional de Desórdenes Neurológicos y Derrame Cerebral Instituto Nacional de Salud a través de la ARRA (VVD) y R21 EB006301 Instituto Nacional de Imágenes Biomédicas y Bioingeniería, Instituto Nacional de Salud (VVD).

Las secciones de la máquina molecular basado en la detección deben estar preparados, ya que su preparación requiere más tiempo que el montaje del dispositivo molecular. La construcción funciona bien con 5-6μm de espesor secciones cortadas de paraformaldehído-fijo, los bloques de tejido incluidos en parafina. Utilizar las marcas de diapositivas que conservan secciones, tales como ProbeOn Plus diapositivas cargado y precleaned (Fisher Scientific) o similar. Se recomienda en un primer momento con un tejido con un patrón bien conocido de los daños en el ADN que contiene DNasa I-II y se rompe DNasa tipo, como la dexametasona, tratados con la rata de apoptosis timo 13,14. 1. Preparación de las secciones <ol><li> Coloque las secciones en un rack de diapositivas y dewax en xileno durante 15 minutos, el traslado a un baño de xileno fresco durante 5 minutos. </li><li> Rehidratar al pasar por las concentraciones de etanol clasificado: 96% de etanol 2x5min, etanol al 80% - 5 minutos, el agua - 2x5 min. </li><li> Recopilación de la sección con Proteínase K. Use 100μL de una solución 50μg/mL por sección. Incubar 15 &#39;a temperatura ambiente (23 ° C) en una cámara húmeda. El tiempo puede necesitar un ajuste en función del tipo de tejido. Tejidos duros puede requerir más tiempo de digestión. Tiempos de 15-25 minutos se suelen utilizar. Digestión insuficiente puede resultar en la señal más débil. Overdigestion en los resultados por otra parte en la desaparición de la señal y la interrupción sección. </li><li> Enjuague con agua destilada para min 2x10. </li><li> Aplicar 100 L por parte del 2% de BSA para preblocking. Incubar durante 15 min a temperatura ambiente (23 ° C). Durante este tiempo, montar la máquina molecular. </li></ol> 2. Máquinas de ensamblaje molecular Todos los reactivos se escalan para 25 l de volumen total, lo cual es suficiente para una detección simple en una sección de tamaño del tejido medio (10x10mm). El volumen puede ampliarse según sea necesario. <ol><li> Combine en un pequeño tubo de plástico en este orden: </li></ol><table border="1"><tbody> &lt;tr&gt; <td><ol><li> Agua bidestilada; </li><li> 15% de polietilenglicol-8000; </li><li> Solución de 66 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl 2, 0,1 mM ditioeritritol, 1 mM ATP, (es decir, regulares amortiguación T4 ADN ligasa); </li><li> 70 pmoles de oligonucleótido 1, </li><li> 215 pmoles (1,76 a 7,1 mg) VACC TOPO </li><li> 10 unidades de T4 ADN ligasa (500 U / mL) </li></ol></td></tr></tbody></table><ol start="2"><li> Mezclar suavemente con la pipeta. La construcción molecular casi instantáneamente auto-ensambla en esta solución y se puede utilizar de inmediato a temperatura ambiente (23 ° C). El aumento de la temperatura a 37 ° C bloquea la T4 ADN ligasa componente basado en el etiquetado. </li></ol> 3. Uso de máquinas moleculares en secciones de tejido de 5&#39;OH etiqueta de doble y 5&#39;PO4 roturas en el ADN <ol><li> Aspirar la solución preblocking y aplicar 25μL de la mezcla de reacción completa que contiene 70 pmoles de oligonucleótido 1, 53 a 215 pmoles (1,76 a 7,1 mg) VACCTOPO y 10 unidades de T4 ADN ligasa (500 U / ml) en solución de 66 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl 2, 0,1 mM ditioeritritol, 1 mM ATP, y el 15% de polietilenglicol-8000. La misma secuencia de oligonucleótidos llevar una sola etiqueta FITC, oligonucleótidos 2, se puede utilizar en lugar de para la detección de un solo tipo de roturas en el ADN. En tal caso, omitir ligasa de la reacción de marcaje. También en esta situación una solución de 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 15% de PEG-8000 puede utilizarse en lugar de tampón T4 ADN ligasa. </li><li> Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente (23 ° C) en una cámara húmeda con un cubreobjetos de plástico. Protegerlo de la luz. Descenso de la temperatura a 16 ° C reduce la señal de la ligasa basado, el aumento de la temperatura a 37 º C elimina por completo la señal de la ligasa basado. Una inhibición parcial de la ligasa a veces ocurre en la mezcla de reacción, posiblemente debido a los contaminantes introducidos en los preparativos topoisomerasa. Por lo tanto, ya la incubación (2-4 horas) puede ser necesario especialmente cuando snúmeros ignificant de la ligasa de la etiqueta se rompe están presentes. Aunque ambos ligasa y las señales de topo se puede observar en esta etapa, en muchos casos la señal de la ligasa puede ser reforzada por una nueva aplicación de la mezcla de reacción sin VACC TOPO y doble etiquetado de oligonucleótidos, pero que contiene un oligonucleótido en forma de horquilla (oligonucleótidos 3) (35 mg / ml) y T4 ADN ligasa (250 U / mL). Para mejorar la señal de siga con el paso 3, para ver la reacción sin aumento vaya al Paso 5. </li><li> Quitar los cubreobjetos con cuidado la inmersión del desliza verticalmente en un frasco de Coplin con agua a temperatura ambiente. Aspirar el exceso de agua. </li><li> Mejorar la señal de la ligasa mediante la aplicación de 25 l de mezcla de reacción sin VACC TOPO y oligonucleótidos 1, pero que contienen oligonucleótidos 3: 66 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl 2, 0,1 mM ditioeritritol, 1 mM ATP, y el 15% de glicol de polietileno 8000, 5 unidades de T4 ADN ligasa, 35 mg / mL de oligonucleótidos 3 (horquilla romos). El volumen total de la solución de etiquetado can ser ampliado para dar cabida a las secciones más grandes. Incubar durante 18 horas (overnight) a temperatura ambiente (23 ° C) en una cámara húmeda con un cubreobjetos de plástico. </li><li> Quitar los cubreobjetos con cuidado la inmersión del desliza verticalmente en un frasco Coplin con agua a temperatura ambiente. Lavar la sección de 3x10 minutos en agua destilada. </li><li> Enjuague con tampón de bicarbonato de sodio. Solución alcalina de enjuague mejora FITC fluorescencia, que es sensible al pH y se reduce significativamente por debajo de pH 7. </li><li> Cubierta de la sección con una solución antifading (Vectashield con DAPI), cubreobjetos y analizar la señal utilizando un microscopio de fluorescencia. De doble hebra de ADN se rompe con 5&#39;OH presenta fluorescencia verde, 5&#39;PO 4 se rompe - se presentan fluorescencia roja (Figura 2). </li></ol> 4. Resultados representante <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3628/3628fig2.jpg" /> Figura 1. Semi-artificial de la máquina molecular detecta dos tipos deDaños en el ADN in situ. La máquina fluorescente cuando se auto-ensambla VACC TOPO se une a la horquilla de doble-32-mer. La máquina empieza a funcionar por sí mismo la división en dos unidades de detector a través de la topoisomerasa-se corta en el extremo 3 &#39;de la secuencia de reconocimiento. Esto se traduce en un proceso cíclico en el cual la unidad marcada con FITC separa continuamente y religates de nuevo a la rodamina marcado con la unidad. Esto continúa hasta que una rotura del ADN detectable se encuentra. Cuando tal aceptor alternativo (5&#39;OH ruptura contundente ADN final) está presente en la sección de tejido, la parte FITC ligará a él. La parte restante de rodamina se adhieren a 5 &#39;PO 4 rompe extremo romo de ADN con la ayuda de T4 ADN ligasa. En consecuencia, ambos tipos de roturas en el ADN son a la vez detectado. <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3628/3628fig1.jpg" /> Figura 2. Etiquetas moleculares de la máquina de doble dos tipos de roturas en el ADNen una sección de tejido de dexametasona tratados con el timo. Romos roturas en el ADN de DNasa I y II DNasa tipo se detectan en las áreas corticales del timo en la apoptosis. Fluorescencia verde frente al citoplasma (5&#39;OH roturas en el ADN) marca macrófagos cortical digerir los materiales nucleares de los timocitos apoptóticos. Esta señal es producida por VACC TOPO, y se localiza en fagolisosomas con el ADN que contiene 5&#39;OH doble filamento se rompe 11,12. Fluorescencia roja (5&#39;PO cuatro descansos) los núcleos de las etiquetas de los timocitos apoptóticos no devorados por los macrófagos. Enorme número de timocitos al mismo tiempo la apoptosis acompañada por la generación de 5&#39;PO 4 de doble cadena se rompe, visualizado por la ligasa basado en el etiquetado. Estos descansos se encuentran en la periferia nuclear, la formación de patrones en forma de anillo. Todos los núcleos celulares son visualizados por la contratinción con DAPI (azul fluorescente).

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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

En este video, que muestra cómo montar y utilizar un doble marcaje de ADN sensor de daño. El sensor es una máquina molecular impulsado por bio-molecular del motor, un virus-proteína codificada TOPO VACC vinculados con componentes artificiales. El desarrollo presenta un ejemplo de un enfoque bio-permitió que aboga por la adaptación de las estructuras biológicas, arquitecturas y piezas reales y los componentes de las células en el diseño de productos no tóxicos dispositivos a escala molecular 12,15. Este enfoqu...

<ol><li> Xileno </li><li> 80 y 96% de etanol. </li><li> 2% de solución de albúmina de suero bovino (BSA) en agua destilada. </li><li> Oligonucleótido 1: una horquilla doble, doble etiquetado con fluoresceína y tetrametilrodamina: </li></ol> 5&#39;-AAG GGA CCT GC F GCA CCC GGT TTA ACG CAT I EN GCG TT-3 &#39;; F - FITC-dT; R - tetrametilrodamina-dT. Otros desplazada hacia el rojo fluoróforos como BODIPY TR, rodamina o TAMRA se puede utilizar en lugar de tetrametilrodamina como R. Alternativamente, puede utilizar oligonucleótidos 2 -. Un solo doble horquilla marcada con fluoresceína (para la detección de un solo tipo de roturas en el ADN (ADNasa II-único tipo) La sonda de un solo fluoróforo de carga es considerablemente menos costoso y es conveniente siempre que sea una sola tipo de rotura de ADN a etiquetar: 5&#39;-AAG GGA CCT GC F GCA CCC GGT TTA ACG CAT ATG CGT T-3 &#39;; F - FITC-dT </p&gt; <ol start="5"><li> Oligonucleótidos 3. Romos rodamina marcado con horquilla para la mejora de la señal ligadura situ con ADN ligasa T4: 5&#39;-GCG CTA GAC C R G GTC CGC TAG-3 &#39;, R - tetrametilrodamina-dT </li><li> Vaccinia DNA topoisomerasa l (VACC TOPO) - 3000 U / l (Tecnologías de Vivid). En los experimentos iniciales se utilizaron 215 pmoles (7,1 mg) de la TOPO VACC por cada l 25 de la mezcla de reacción. Sin embargo, la concentración de la topoisomerasa puede reducirse significativamente sin la pérdida de sensibilidad. Más tarde utilizó una cantidad cuatro veces menor de VACC TOPO por sección (1,76 g en 25 l de la mezcla de reacción por sección), con resultados similares. La reducción de la cantidad de la enzima a 880 ng (en 25 l de la mezcla de reacción) dio lugar a una señal más débil y 8,8 ng de VACC TOPO producido ninguna señal detectable. </li><li> ADN ligasa de T4 5 U / l (Roche). Esta preparación ligasa altamente concentrada ofrece la mejor señal en nuestras condiciones experimentales. </li&gt; <li> 10 x tampón de reacción de ADN ligasa T4: 660 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl 2, 10 ditioeritritol mM, 10 mM ATP, pH 7,5 (20 ° C) (Roche). ATP en tampón de reacción se destruye con facilidad en los ciclos repetitivos de descongelación-congelación. Alícuota del buffer en pequeñas porciones de 15-20 l y almacenar a - 20 ° C. Use una vez. </li><li> 30% (w / v) de PEG-8000 (Sigma) en agua bidestilada. 15% de PEG-8000 en la mezcla de reacción que estimula fuertemente la detección, el aumento de las concentraciones efectivas de sus componentes por la exclusión de volumen. </li><li> Proteinasa K (Roche) 20 mg / ml de la solución madre en agua destilada. Conservar a - 20 ° C. En la solución se aplica una reacción 50mg/ml en PBS, preparado a partir de las acciones. No vuelva a usar. </li><li> Vectashield con DAPI (Vector Laboratories). </li><li> Bicarbonato de sodio: 50 M NaHCO 3, 15m M NaCl, pH 8,2. </li><li> Vidrio 22x22mm o 22x40mm o cubreobjetos de plástico. Cubreobjetos de plástico son preferibles durante la reacción, ya que unare fácil de quitar de la sección. </li></ol>

en la asamblea in vitro de la semi-artificial de la máquina molecular y su utilización para la detección del daño del adn

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

De origen natural bio-molecular máquinas trabajan en todas las células vivas y mostrar una gran variedad de diseños 1-6. Sin embargo, el desarrollo de máquinas moleculares artificiales centros de dispositivos con capacidad de movimiento direccional, es decir, los motores moleculares, y en su reducida partes mecánicas (ruedas, ejes, etc colgantes) 7-9. Esto imita las máquinas macro-, a pesar de que las propiedades físicas esenciales para estos dispositivos, como la inercia y la conservación del momento, no se pueden usar en los entornos nanomundo 10. Diseños alternativos, que no siguen los esquemas mecánicos macromachines y utilizar los mecanismos desarrollados en la evolución de las moléculas biológicas, pueden tomar ventaja de las condiciones específicas del nanomundo. Además, la adaptación real de las moléculas biológicas con fines de nano-diseño reduce los peligros potenciales de los productos la nanotecnología puede plantear. Aquí se demuestra el montaje y la aplicación de uno de estos bio-permitió construir, comoemi-artificial dispositivo molecular que combina una máquina molecular de origen natural con componentes artificiales. Desde el punto de vista de la enzimología, nuestra construcción es un diseñador fluorescentes complejo enzima-sustrato juntos para realizar una función útil específica. Este conjunto es, por definición, una máquina molecular, ya que contiene un 12. Sin embargo, su integración con la parte de ingeniería - horquilla de doble fluorescente - que re-dirige a una nueva tarea de etiquetado daño en el ADN 12. Nuestra construcción ensambla de un ADN de 32-mer y una enzima topoisomerasa I vaccinia (VACC TOPO). La máquina usa su propio material para la fabricación de dos unidades de la etiqueta fluorescente detector (Figura 1). Una de las unidades (fluorescencia verde) lleva VACC TOPO covalentemente a su extremo 3 &#39;y la otra unidad (fluorescencia roja) es una horquilla libre con un 3&#39;OH terminal. Las unidades son de corta duración y rápidamente montamos de nuevo en la construcción original, que posteriormente recleaves.En la ausencia de ADN se rompe estas dos unidades separadas y religate continuamente de una manera cíclica. En secciones de tejido con daño en el ADN, el detector de la topoisomerasa-llevar selectivamente se une a roturas en el ADN de extremos romos con 5&#39;OH (DNasa II-tipo se rompe) 11,12, con fluorescencia que el etiquetado. El segundo, sin enzimas horquilla formada después de la escisión de oligonucleótidos, se ligan a un 5&#39;PO 4 romos break (DNasa I-tipo se rompe) 11,12, si la ADN ligasa de T4 está presente en la solución de 13,14. Cuando la ADN ligasa de T4 se añade a una sección de tejido o una solución que contiene ADN con 5&#39;PO cuatro extremos romos se rompe, la ligasa reacciona con 5&#39;PO cuatro extremos de ADN, formando semi-estable enzima ADN complejos. Las horquillas romos va a interactuar con estos complejos de la liberación de ganchos para el cabello ligasa y la vinculación covalente al ADN, por lo que el etiquetado 5&#39;PO 4 romos roturas en el ADN. Este desarrollo es un ejemplo de un nuevo enfoque práctico ªdiseño e de máquinas moleculares y ofrece un sensor de útiles para la detección de la apoptosis y el daño del ADN en las células y los tejidos fijos.

Demostramos la asamblea y la aplicación de un dispositivo a escala molecular, alimentado por una proteína de la topoisomerasa. La construcción es un sensor bio-molecular que las etiquetas de dos grandes tipos de ADN se rompe en secciones de tejido uniendo dos fluoróforos diferentes a sus fines.

En la Asamblea in vitro de la semi-artificial de la máquina molecular y su utilización para la detección del daño del ADN

Las máquinas biomoleculares presentes en la naturaleza funcionan en cada célula viva y presentan una gran variedad de diseños 1-6. No obstante, el desarrollo de máquinas moleculares artificiales...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar cómo ensamblar y utilizar un sensor de daño en el ADN con doble marcado que etiqueta dos tipos principales de roturas en el ADN en secciones de tejido. El sensor está compuesto por un oligonucleótido de ADN de 30 tumores, marcado con ZI y Rumina, y una enzima, la topo isomerasa vaccinia tipo uno o vac topo, que se autoensambla. Cuando la vac topo se une al oligonucleótido de 30 tumores, el funcionamiento del sistema comienza cuando la topo isomerasa escinde el oligonucleótido en el extremo tres prima de la secuencia de reconocimiento, dando lugar a una unidad marcada con fitzina activada por vac topo y un hairpin libre marcado con amina.Con un hidroxilo terminal en la posición tres prima, las unidades tienen una vida breve y se reensamblan rápidamente en la construcción original, que posteriormente se escinde. En ausencia de roturas adicionales de ADN de carácter extra molecular, estas dos unidades se separan y relegan continuamente de manera cíclica. Cuando el sensor molecular se aplica a secciones de tejido con daño en el ADN, la unidad detectora marcada con Fitz se une selectivamente a las roturas de ADN con extremos romos q

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Bioingeniería

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Visualización de miniSOG Tagged proteínas de reparación de ADN en combinación con Electron espectroscópico Imaging (ESI)

Aquí, se presenta un flujo de trabajo automatizado para modular montaje de "dispositivo" de ADN usando un método de montaje modular de clonación ADN sobre robots de manipulación de líquidos. El protocolo utiliza una herramienta de software intuitivo para la generación de listas de líquido controlador para combinatoria ADN dispositivo biblioteca generación, demostramos con dos plataformas de manejo de líquidos.

Automatizado de montaje robotizada manipulación líquido de dispositivos modulares de la DNA

Aquí se demuestra cómo se puede usar el Ensayo de Ligación de Proximidad in situ (PLA) para detectar y visualizar las interacciones directas proteína-proteína entre ATM y p53 en cultivos de células en suspensión expuestos al estrés genotóxico.

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Reparación de roturas del DNA de doble cadena es un proceso dinámico, que requiere no sólo la formación de complejos de reparación en los descansos, pero también su resolución después de la lesión se trata. Aquí, utilizamos microscopia de la inmunofluorescencia para roturas de doble hebra transitorias y duradera como una herramienta para diseccionar este mecanismo de mantenimiento del genoma.

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Se desarrolló un método no etiquetados, radio-isotópico para la corrección de la polimerasa de la DNA y un ensayo de reparación del ADN mediante espectrometría de masas MALDI-TOF alta resolución y una estrategia de extensión de un solo nucleótido. El ensayo demostró ser muy específico, simple, rápido y fácil de realizar para corregir y reparar los parches menor 9 nucleótidos.

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Este artículo introduce pasos esenciales de immunostaining y de la inmunoprecipitación de la cromatina. Estos protocolos se utilizan comúnmente para estudiar los procesos celulares relacionados con el daño del ADN y para visualizar y cuantificar el reclutamiento de proteínas implicadas en la reparación del ADN.

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La metodología ayuda en el análisis de la variación en la dinámica de replicación del ADN en presencia de nanopartículas. Se pueden adoptar diferentes metodologías basadas en el nivel de citotoxicidad del material de interés. Además, se proporciona una descripción del análisis de imágenes para ayudar en el análisis de fibras de ADN.

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Las nanomáquinas basadas en DNAzyme se pueden utilizar para la detección altamente selectiva y sensible de ácidos nucleicos. Este artículo describe un protocolo detallado para el diseño de nanomáquinas basadas en DNAzyme con un núcleo 10-23 utilizando software libre y su aplicación en la detección de un fragmento de virus de Epstein-Barr como ejemplo.

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Informamos de un ensayo híbrido de conjunto y de una sola molécula para obtener imágenes directas y cuantificar el movimiento de la helicasa Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) totalmente reconstituida y marcada con fluorescencia en moléculas de ADN lineales mantenidas en su lugar en una trampa óptica.

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Fabricación de ADN electroquímico biosensores para la detección Reagentless de ácidos nucleicos, proteínas y moléculas pequeñas

Aprende a ensamblar un sensor molecular de daño en el ADN con doble marcaje fluoróforo usando topoisomerasa de vaccinia. Este método permite visualizar roturas de doble cadena en secciones de tejido para estudios de biología molecular y cáncer.

En la Asamblea in vitro de la semi-artificial de la máquina molecular y su utilización para la detección del daño del ADN

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