Simple y robusto En vivo Y In vitro Enfoque para el estudio de ensamblaje del virus

El objetivo general de este procedimiento es estudiar el ensamblaje viral in vivo e in vitro. Esto se logra primero expresando ARN del virus mosaico de la col y bacterias, y exponiendo estos a células vegetales mediante infiltración agro. A continuación, los viriones del virus mosaico de la col se purifican a partir de hojas infiltradas.

Luego se preparan subunidades de proteína de cápside para ensamblaje in vitro. Finalmente, los varians del BMV se ensamblan in vitro utilizando la proteína de cápside y el colorante verde indocianina. En última instancia, los resultados muestran varians del mosaico del bro ensamblados in vitro mediante la formación de fantasmas ópticos, que pueden determinarse por la absorbancia y la emisión de fluorescencia.

Hoy vamos a mostrar una técnica conocida como filtración, la cual es útil para entregar componentes virales a las plantas. La principal ventaja de esta técnica es eliminar la necesidad de generar transcritos in vitro y, al mismo tiempo, permite entregar múltiples componentes a una misma célula, lo que posibilita una infección sincronizada. El trabajo que actualmente estamos desarrollando consiste en el uso del virus del mosaico del brócoli en combinación con un cromóforo aprobado por la FDA en el verde cianina para fabricar un nuevo tipo de nanopartícula para aplicaciones biomédicas.

Y específicamente, nuestra intención es utilizar estos constructos a los que denominamos fantasmas de hilo óptico u OB gs para modalidades de imagen óptica, incluyendo imágenes de fluorescencia y de fotoacústica, y también como vehículo para la terapia láser. Una aplicación clínica específica que estamos investigando actualmente es el uso de estos constructos para la imagen del cáncer de ovario en conjunto con procedimientos intraoperatorios. Y la idea es que podemos funcionalizar estos constructos.

El OBG con el motivo de direccionamiento específico que puede reconocer células tumorales residuales, que en el caso del cáncer de ovario podrían estar especialmente dentro de la cavidad peritoneal. A partir de una placa de Agrobacterium previamente preparado que alberga el ARN del virus del mosaico marrón uno, dos o tres, seleccione una colonia individual para inocular dos mililitros de LB que contenga 50 microgramos por mililitro de canamicina y 100 microgramos por mililitro de rifampicina. Incube el cultivo durante un día a 28 grados Celsius en un agitador orbital a 250 RPM. Inocule 50 mililitros de LB en un matraz Erlenmeyer de 500 mililitros con un mililitro del cultivo y incube durante 16 horas a 28 grados Celsius en un agitador orbital a 250 RPM al día siguiente. Cuando los cultivos hayan alcanzado una DO 600 de 1,0, transfiéralos a tubos estériles de 30 mililitros y centrifugue durante 10 minutos.

A 5.000 RPM y cuatro grados Celsius, disuelva los pellet en 10 mililitros de cloruro de magnesio 10 milimolar y centrifugue durante 10 minutos a 5.000 RPM y cuatro grados Celsius. Repita este paso una vez más para asegurar la eliminación completa del antibiótico. A continuación, suspenda los pellet en 10 mililitros de tampón que contenga MES 10 milimolar y cloruro de magnesio 10 milimolar.

Mida la DO a 600 nm para cada cultivo y ajuste a una DO a 600 nm de 0,1 utilizando cloruro de magnesio 10 milimolar y MES 10 milimolar. Luego, combine 10 mililitros de cada una de las tres suspensiones de cultivo con DO 600 nm de 0,1. Añada acetofenona hasta una concentración final de 100 milimolar.

Mezcle suavemente y mantenga la mezcla sin agitar a temperatura ambiente durante tres horas. Después de la incubación, aspire el cultivo en una jeringa de un mililitro sin aguja. Infiltra la suspensión del cultivo en el lado adaxial de dos o tres hojas bien expandidas de N. benthamiana presionando suavemente la jeringa contra una mitad de la superficie abaxial de cada hoja.

Mantenga las plantas infiltradas en el invernadero a 24 grados Celsius durante tres o cuatro días antes de cosechar las hojas. Después de purificar los viriones de BMV, prepare un litro de tampón de disociación de virus 1x. A continuación, prepare la membrana de diálisis.

Según el método de Sambrook et al., distribuya de cinco a 10 miligramos por mililitro de virus purificado en una bolsa de diálisis y coloque la bolsa en un matraz con tampón de disociación 1 x virus. Diализe el virus durante 24 horas a cuatro grados Celsius bajo agitación.

Recolecte la solución de la bolsa de diálisis y centrifúguela a 30.000 RPM durante 30 minutos a cuatro grados Celsius para obtener un sedimento de partículas virales no asociadas. Centrifugue el sobrenadante a 30.000 RPM durante tres horas a cuatro grados Celsius. Después de preparar los transcritos de ARN para ser reensamblados en viriones, mezcle las subunidades de la proteína de la cápside y los transcritos de ARN en una proporción de uno a cinco.

Dispense la mezcla en una bolsa de diálisis y asegúrela adecuadamente para evitar fugas. Después de preparar un litro de tampón de ensamblaje de ARN 1X, diализar la mezcla de reacción de reensamblaje en el tampón a cuatro grados Celsius durante 24 horas al día siguiente, retire la mezcla de la bolsa de diálisis y agregue 1,5 mililitros de tampón de ensamblaje de ARN; luego centrifugue nuevamente a 30.000 RPM durante tres horas a cuatro grados Celsius. A continuación, retire el sobrenadante y resuspenda el precipitado.

A continuación, estime la concentración de viriones a 260 nanómetros de OD. Luego, determine la concentración de subunidades proteicas del capsido a 280 nanómetros de OD o mediante otros métodos, como el ensayo de Bradford, para evaluar la integridad de las subunidades proteicas del capsido disociadas. Realice un SDS-PAGE al 12-15 % seguido de inmunotransferencia. Finalmente, siga el procedimiento descrito en el protocolo escrito para generar fantasmas virales ópticos u ov cheese.

Se muestra aquí una imagen de microscopía electrónica de transmisión de BMV Varion teñido negativamente, purificado de plantas end hamana agroinfiltradas con una mezcla de los tres constructos agri de BMV tipo silvestre. Esta imagen de MET muestra ghost virales ópticos que contienen verde de indocianina teñidos negativamente. Aquí se muestran los espectros de absorción y fluorescencia de los ghost virales ópticos una vez dominados.

Esta técnica puede realizarse en cinco minutos por muestra. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo encapsular componentes virales o no virales en subunidades de proteínas de cápside.