Name: Cine Cultura de la Seda del sistema para In vitro Análisis y Diseño de Biomateriales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Aprende a establecer un sistema de cultivo in vitro con películas de seda para análisis biomateriales. Este método versátil permite optimizar superficies antes de aplicaciones in vivo en biología celular.

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La financiación de los NIH K08EY015829, R21EY019561, R24EY015656, P41 EB002520, y R01 EY020856 Investigación para Prevención de la Ceguera Premio al Desarrollo de Carrera, y Tri-Institucional Iniciativa de Células Madre. Línea celular HCLE proporcionados por cortesía de la Dra. Ilene Gipson. Los autores desean agradecer al Dr. Aihong Liu en Weill Cornell Medical College, por su asistencia técnica y orientación con el cultivo celular, Anthony Labissiere en el Hospital para Cirugías Especiales para su asistencia técnica con el SEM de imágenes, la Ingeniería de Tejidos del Centro de Recursos (TERC) en la Universidad de Tufts para el apoyo técnico con el desarrollo material, y el Centro de Cornell para la ciencia a nanoescala y el Fondo para la Tecnología (CNF) para obtener ayuda en la fabricación de obleas de silicio.

1. Fabricación de moldes de caucho de silicona <ol><li> Producir o adquirir una superficie topográfica deseada para la fundición. Para esta publicación un estándar de 100 mm de la oblea de silicio grabada se ha descrito (Figura 1). </li><li> Pesar polidimetilsiloxano (PDMS) encapsulamiento (componente A) y catalizador (componente B) solución en una relación 1:9 (9 g encapsulamiento y 1 g de catalizador) según lo dispuesto en el kit comprado. </li><li> Mezcle las soluciones de fondo para iniciar el proceso de curado. </li><li> Colocar oblea de silicio superficie dentro de un plato de colada. </li><li> Pesar 4,5 g de solución de PDMS sobre obleas de silicio. </li><li> Propagación PDMS solución como para cubrir un área de 100 mm de diámetro de la superficie de la oblea. </li><li> Incline la oblea para difundir solución de PDMS de manera uniforme. </li><li> Cubrir oblea con 100 mm de diámetro tapa placa de Petri. </li><li> Lugar de fundición de instalación en estufa a 60 º C durante la noche, asegurándose de que el curado se lleva a cabo sobre una superficie plana. </li><li> Colocar curado PDMS / obleas de silicio en 70% de etanolbaño antes de la eliminación. </li><li> Comienza la eliminación de PDMS de obleas mediante el uso de hoja de afeitar para levantar el borde (circunferencia) en primer lugar. </li><li> Tire suavemente de PDMS fuera de uso de fórceps en un baño de etanol al 70% teniendo cuidado de no romper la fundición de caucho de silicona. </li><li> Rompa los moldes individuales con PDMS 14 perforadora mm. Este diámetro está diseñado para encajar en una configuración de placa de 24 pocillos. </li></ol> 2. La producción de solución de seda <ol><li> Llevar 2 L de agua destilada (dH 2 O) a ebullición dentro de un vaso de vidrio 7. </li><li> Cortar 5 g de Bombyx mori capullos de seda en tres partes. </li><li> Elimine los capullos ampliamente contaminados por insectos, como se indica exceso de recubrimiento de las partículas en la superficie del capullo interior. </li><li> Medir 4,24 g de carbonato de sodio. </li><li> Añadir carbonato de sodio lentamente hasta ebullición dH 2 O volumen para evitar que se desborde de agua, y permitir la completa disolución antes de continuar. </li><li> Agregue los trozos de capullo hasta que hierva dH <sub&gt; 2 O durante 40 min., y usar una barra de teflón recubierto revuelo para agitar capullos durante el proceso de ebullición. </li><li> Después de hervir, escurrir con cuidado DH 2 O en el fregadero y el anillo de extracto de seda a mano para eliminar el exceso de agua. </li><li> Lavar seda extraer tres veces durante 20 min. cada uno en 1 L de H 2 O en un vaso de precipitados de laboratorio, y utilizar una barra de agitación para hacer circular el volumen dentro de vaso de precipitados. </li><li> Después de lavar, el anillo a cabo el extracto de seda a mano y el extracto de seda fibra lugar dentro de una campana química para permitir el secado de una hora 12. período. </li><li> Al día siguiente, pesan las fibras de seda secas, que es típicamente ~ 3,5 g: ___________-g </li><li> Preparar 9,3 solución LiBr M para un 20% w / v de seda. Utilizar siguientes ecuaciones para calcular el peso necesario y volúmenes: <ol class="lalpha"><li> (Peso de la Seda extracto de la etapa 10) x (4) = ___________ ml de solución total de 9,3 M LiBr </li><li> [(807.705) x (volumen de la parte LiBr 11.a)] / 1000 = ___________ g de LiBr para añadir a DH 2 O </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Añadir peso medido LiBr en un vaso de vidrio de la siguiente volumen de DH 2 O: <ol class="lalpha"><li> (0,8) x (volumen calculado a partir del paso 11.a) = ___________ ml de H 2 S </li></ol></li><li> Verter esta solución en un tamaño adecuado cilindro graduado, y llevar solución hasta el volumen final, calculado en la parte 11.a. </li><li> Coloque el extracto de seda en el vaso y vierta la solución LiBr sobre las fibras de seda que hacen que las fibras de seda están inmersas en la solución LiBr con una espátula de laboratorio. </li><li> Colocar la seda disuelto en 60 ° horno C durante 4 horas: Hora de inicio: ___________ Hora de finalización: ___________ </li><li> Usando una jeringa de tamaño adecuado elaborar 12 ml de la solución de seda. Coloque una aguja 18G en el extremo de la jeringa, y luego inyectar la solución en un casette de diálisis (3.500 MW coutoff, Slide-A-Lyzer, Thermo Scientific). Después de llenar la bandeja, sacar el aire que queda fuera de la cinta con la jeringa vacía. </li><li> Lugar ficasete de diálisis lled el plazo de 1 L de H 2 O. </li><li> Cambiar DH 2 de O después de 1 hora, 4 horas, de 8 horas y luego cada 12 horas 3 veces para un total de 6 cambios: <ol class="lalpha"><li> Inicio: ___________ </li><li> 1 hora: ___________ </li><li> 4 horas para situaciones: ___________ </li><li> 8 horas: ___________ </li><li> 12 horas: ___________ </li><li> 12 horas: ___________ </li><li> 12 horas: ___________ </li><li> Final: ___________ </li></ol></li><li> Después de la diálisis, lentamente recoger la solución de la seda de cassettes con la jeringa. Coloque la solución en tubos de centrífuga de 10.000 g nominales. </li><li> Centrifugar la solución dos veces a 10.000 ga 4 ° C durante 20-minutos cada uno. Después de cada sobrenadante lugar centrifugación en un tubo nuevo. </li><li> Tienda thr solución de seda en 4 ° C refrigerador. </li><li> Pipeta 2 muestras de 0,5 ml de solución de seda en pequeños pesar la cápsula, y el lugar pesan los platos dentro de un horno a 60 ° C en seco durante 12 horas o hasta que se seque de seda de la solución. </li><li> Pesar la película restante de seda sólido a partir de both muestras para medir solución de seda por ciento en peso de concentración en volumen de proteína: <ol class="lalpha"><li> Peso de la combinación de 2 muestras de cine de seda: ___________ mg </li><li> (Peso de la 23.a) x (100) = seda ___________% </li></ol></li></ol> 3. Preparación de las películas de seda y de instalación de sistema de cultivo <ol><li> Prepare las superficies de PDMS de fundición de una limpieza con cinta adhesiva transparente para eliminar el polvo. </li><li> Limpieza PDMS sustratos por inmersión en el 70% de etanol y lavar tres veces con dH 2 O. </li><li> Colocar 14 mm moldes PDMS en el plato de soporte, que es típicamente una tapa 24 y placa. </li><li> Para producir una película de 50 micras de espesor, se extendió 70 μls de solución de seda 8% en moldes de PDMS utilizando una herramienta de propagación líquido que es típicamente un 1 ml jeringa con punta 2. </li><li> Permitir las películas de seda para secar cubierto en un banco corriente limpia una presión de flujo de aire de 150 Pa durante un período de 90 minutos o hasta que las películas están secos. </li><li> Una vez que las películas son un lugar seco todo el conjunto de películas, incluyendo PDMS medad, en una cámara de agua-recocido durante más de 4 horas para producir una película insoluble en agua. Esto es típicamente una cámara de vacío desecador con agua en el fondo de la cuenca tiró de un vacío kPa 25 15. </li><li> Quite las películas de seda de agua la cámara de recocido y coloque en una mesa de trabajo limpia. </li><li> Preparar un baño de EtOH 70% en un 35 mm placa de Petri, y sustratos lugar de control (es decir, vidrio o plástico) y anillos de acero inoxidable dentro de los pozos por lo menos durante 10 minutos para esterilizar. </li><li> Quite las películas de seda a partir de moldes de PDMS con fórceps, a sumergirse en EtOH al 70%, y muestra el lugar en placa de 24 pocillos prellenada con 1 ml de EtOH al 70% haciendo que el lado estampado quede hacia arriba para permitir la adhesión celular. </li><li> Después de colocar cada muestra de cine de seda en un lugar así correspondientes inoxidable pesos de acero del anillo (11,65 mm de diámetro interior, 15,45 mm de diámetro exterior y 1,18 mm de espesor) en la parte superior. </li><li> Deje que las muestras con anillos de incubar durante 10 minutos para mantener la esterilidad. </li><li> RemoVe EtOH y lavar cada muestra 3 veces con 1 ml de PBS. Que cada lavado reposar durante 5 min para permitir la difusión completa. </li><li> Retire PBS utilizando una pipeta de aspiración de vidrio, mientras se asegura de eliminar la mayoría de las burbujas por debajo de las muestras de cine de seda. </li><li> Preparar la línea celular para la siembra. Como un ejemplo, trypsinize humano corneal limbal-epitelial (HCLE) línea celular con 0,25% de tripsina y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) para solución de 7-min. Desactivar el uso de la tripsina 01:01 volumen de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM), los medios de comunicación de paso con FBS al 10% añadido. Centrifugar las células con tripsina HCLE, añadir 8 ml de queratinocitos medio libre de suero (K-SFM) al pellet de células, agitar suavemente para dispersar HCLEs, y generar el recuento de células. </li><li> Muestra de 500 l de la suspensión HCLE por pozo típicamente usando una de cada 10.000 células / cm 2 de la densidad. </li><li> Coloque las culturas dentro de la incubadora a 37 ° C y 5% de CO 2 y ejecutar el protocolo que desee experimental. </li></ol> 4. Los resultados representativos &lt;clase p = &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3646/3646fig1.jpg" /> Figura 1. Flujograma que ilustra resumida proceso de 10 pasos de la producción de seda, el cine y la preparación del sistema de cultivo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3646/3646fig2.jpg" /> Figura 2. (A) 21-colorante matriz de topografías superficiales estampadas línea producidas sobre una oblea de silicio de 90 mm ​​de diámetro empleando técnicas estándar de grabado fotolitográficas y seco. (B) las películas originales de seda conservan características de la línea en paralelo con dibujos después de la fundición de moldeo en las superficies de PDMS. (C) Esquema mostrando el diseño tamaño de la característica elegida para facilitar la alineación celular. (D) Sección transversal de la película de seda que ilustra retenido superficie paralela alineada con dibujos. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3646/3646fig3.jpg" /> Figura 3. Micrografías electrónicas de barrido de línea celular HCLE adherirse a (A) con patróny (B) las películas planas de seda en el día 2 en cultivo. Culturas HCLE siguen proliferando en la confluencia de (C) con dibujos y (D) las superficies planas el día 8 en la cultura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3646/3646fig4.jpg" /> Figura 4. (A, D, G) con dibujos y (B, E, H) películas planas de seda de cultivo las células HCLE comparativamente a (C, F, I) sustratos de vidrio de control en (AC) el día 1, (DF) el día 4, y (GI) el día 8 en la cultura. (J) contenido CyQuant ácido nucleico y (K) (3 - (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT) datos de la actividad metabólica de ensayo que demuestran la viabilidad HCLE tanto en estampado y planas sustratos de película de seda cuando se compara con las superficies de control de vidrio en el tiempo (barras de escala = 100 micras). Video 1. Lapso de tiempo de contraste de fases de imágenes de células que migran HCLE sobre una superficie de película de estampado de seda durante una hora 18. período de tiempo. Las células se sembraron a 10k/cm 2 densidad y se cultivaron durante 2 h. antes de la exploración. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3646/3646movie1.MOV" target="_blank">Haga clic aquí para ver la película</a> . Video 2. Lapso de tiempo de contraste de fases de imágenes de células que migran HCLE sobre una superficie plana de control de TCP durante una hora 18. período de tiempo. Las células se sembraron a 10k/cm 2 densidad y se cultivaron durante 2 h. antes de la exploración. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3646/3646movie2.MOV" target="_blank">Haga clic aquí para ver la película</a> .

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No hay conflictos de interés declarado.

El uso de películas de seda regeneradas como un sustrato para el cultivo celular se ha ganado en popularidad en las últimas dos décadas debido a la amplia caracterización de las propiedades de los materiales de esta proteína y mayor comprensión de su utilidad biomaterial 3,8. El sistema de cultivo descrito aquí representa una novela en el sistema de ensayo in vitro para la evaluación de las interacciones de la superficie celular de la seda con dibujos de cine biomaterial sustratos 7. El sistema permite un análisis en profundidad de las interacciones celulares en el tiempo que puede ser fácilmente adoptados para alto rendimiento de recolección de datos. Esto es en gran medida permitido por las películas de seda poseen un número de propiedades sintonizables biomaterial que puede ser modificado para afectar directamente la función celular 8,9,12, incluyendo: control de la superficie de micro / nano topografía de la superficie 7; químicas diferentes de la superficie mediante la modificación covalente o adsorción de moléculas biológicamente activas 13; robusta mechpropiedades anical 15,16, control de material de hidrofilicidad / hidrofobicidad 16, la carga a granel de compuestos biológicos para la liberación de 4,8,17, y de disolución controlada / las tasas de degradación enzimática a través del control de la estructura secundaria (el contenido de la hoja beta) 11,18,19 . La transparencia de las películas de seda se consigue a través de las películas de recocido durante un período de tiempo en vacío en la presencia de vapor de agua 7,15. Este enfoque permite el procesamiento para la formación de la estructura β-lámina secundaria, fomentando la insolubilidad del material en agua al tiempo que permite difracción mínimo de luz 15. Esta transparencia de las películas es clave para permitir directa de imágenes en vivo de células que pueden ser empleados en virtud de una serie de modalidades de imagen (es decir, de gran campo y fluorescencia) con cualquier número de sistemas de microscopio 12,20. Además de imágenes de células vivas-, las películas de seda se puede quitar fácilmente de thsistema de correo para permitir que la cultura para la fijación y análisis adicionales. Así, la gran variedad de directos evaluaciones experimentales que se pueden realizar en este sistema son aplicables a una amplia variedad de fuentes de células / tejidos para muchos ámbitos técnicos 3,8,9,12,13,21. Los resultados de time-lapse de imágenes ilustran cómo en tiempo real los datos del cultivo puede ser recogida, y como ejemplo se utilizaron para ilustrar cómo la topografía de la superficie afecta a las interacciones celulares. Los resultados representativos demostrar cómo biomateriales de seda de película puede ser utilizada para soportar el crecimiento del cultivo HCLE, y son susceptibles de ser un número de proliferación celular estándar y ensayos metabólicos (Fig. 4). Además, los cultivos se fijaron y procesaron para la digitalización de imágenes de electrones u otros protocolos (Fig. 3). Sustratos de seda de la película se produce en el laboratorio con alta fidelidad, consistencia, y con un costo relativamente bajo (fig. 1). Esto permite reproducibilidaddad, tanto en la configuración del sistema cultural y los resultados experimentales. Se ha demostrado que el agua de recocido de procesamiento produce un material de seda película estable dentro de la cultura que ha definido tasas de degradación en espera de la concentración de las proteasas en solución 2,15,22. Como resultado, estos materiales pueden ser utilizados durante largos períodos de tiempo para el cultivo celular a largo plazo, o permanecer implantado durante meses o años, dependiendo de la ubicación fisiológica 8. Además, el trabajo reciente ha demostrado que tanto la estructura de la proteína y las propiedades del material de las películas de seda recocido de agua son consistentes de un lote a otro teniendo en cuenta los resultados del cultivo reproducibles como se muestra a través de diversos métodos de pruebas mecánicas y biofísicas 15,16. Además, la superficie del material ha demostrado una gran fidelidad entre los lotes de películas, como se indica por la SEM, la fuerza atómica micrscopy (AFM), y los estudios de cultivo celular {Lawrence: 2008wr, Omenetto: 2008tc, Bray: 2011kq} 7,23,24. Material de la estabilidaddad y la consistencia es un factor importante a la forma en la celda detectará el sustrato de cultivo a través de las vías mecanotransducción diferentes, y, finalmente, producir una respuesta celular deseada / no deseada 25,26. Normas Históricos para sustratos de cultivo, tales como plástico de cultivo de tejidos tratados o de vidrio, proporcionan sustratos adecuados para la fijación celular. Sin embargo, estos materiales no son modificables por utilidad adicional en vivo. Se puede prever que una película de seda biomaterial puede ser personalizado in vitro, y una vez que las expectativas de experimentación se han logrado de la película personalizado puede ser trasladada a un modelo in vivo. Tal diseño emparejamiento entre in vitro y la experimentación in vivo ofrece una gran ventaja para estos biomateriales de seda implantables más de otros sustratos que se utilizan rutinariamente in vitro.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del Material </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Los capullos de seda </td><td> Tajima Shoji Co., LTD. </td><td> NA </td></tr><tr><td> PDMS monómero y transversal enlazador- </td><td> Momentive </td><td> RTV615A 01P </td></tr><tr><td> Carbonato de Sodio </td><td> Sigma </td><td> S2127 </td></tr><tr><td> De bromuro de litio </td><td> Sigma </td><td> 213225 </td></tr><tr><td> Slide-A-Lyzer </td><td> Thermo Scientific </td><td> 66110 </td></tr><tr><td> 1 ml de jeringa </td><td> Becton-Dickenson </td><td> 309602 </td></tr><tr><td> Arandela de acero inoxidable </td><td> Lavadora Superior </td><td> 81610 </td></tr><tr><td> 24-pocillos </td><td> VWR </td><td> 353047 </td></tr></tbody></table>

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Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

Películas de seda son prometedores basados ​​en proteínas biomateriales que pueden ser fabricados con alta fidelidad y rentabilidad en un entorno de laboratorio de investigación 1,2. Estos materiales son deseables debido a que poseen características dimensionales y material altamente controlables, son biocompatibles y promover la adhesión celular, se puede modificar a través de patrón topográfico o por modificación de la superficie, y puede ser utilizado como un depósito para las moléculas biológicamente activas para aplicaciones de suministro de fármacos relacionados 3-8. Además, las películas de seda son relativamente sencillos de diseño personalizado, se pueden diseñar para disolver en cuestión de minutos o se degradan con el año in vitro o in vivo, y se producen con la ventaja añadida de ser transparente en la naturaleza y por lo tanto muy adecuado para aplicaciones de imágenes 9 - 13. La metodología de sistema de cultivo que aquí se presenta representa un enfoque escalable para la evaluación rápida de la superficie de la película de células de sedainteracciones. De particular interés es el uso de películas superficiales de seda estampadas para estudiar las diferencias en la proliferación celular y las respuestas de las células para la alineación 12,14. Los cultivos con semillas fueron cultivadas en tanto micro-patrones y planos sustratos de película de seda, y luego evaluaron a través de contraste de fase time-lapse de imágenes, microscopía electrónica de barrido, y la evaluación bioquímica de la actividad metabólica y contenido de ácido nucleico. En resumen, la película de seda en el sistema de cultivo in vitro ofrece una configuración adaptable experimental adecuado para el estudio de las interacciones de la superficie celular en un sustrato biomaterial, que luego pueden ser optimizadas y luego traducido a modelos in vivo. Las observaciones con el sistema de cultivo que aquí se presenta, actualmente se utilizan para ayudar en aplicaciones que van desde las interacciones celulares básicos para el diseño de dispositivos médicos, y por lo tanto son relevantes para una amplia gama de campos de la biomedicina.

Películas de seda son una nueva clase de biomateriales fácilmente personalizables para una amplia gama de aplicaciones biomédicas. La película presentó seda sistema de cultivo es altamente adaptable a una variedad de<em&gt; In vitro</em&gt; Análisis. Este sistema representa una oferta de diseño de plataforma de biomateriales<em&gt; In vitro</em&gt; Optimización de la traducción directa al<em&gt; En vivo</em&gt; Modelos.

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Las películas de seda son biomateriales basados en proteínas prometedores que pueden fabricarse con alta fidelidad y de manera económica dentro de un entorno de laboratorio de investigación...

El objetivo general de este procedimiento es establecer un sistema de cultivo in vitro de películas de seda. Esto se logra primero produciendo la solución de seda para fabricar la película deseada. El segundo paso consiste en verter la solución de seda sobre la superficie de moldeo de caucho de silicona y permitir que la película se seque completamente.La película de seda se procesa posteriormente para el cultivo celular. A continuación, se ensambla el sistema de cultivo utilizando técnica estéril. El paso final consiste en sembrar las películas de seda con el tipo celular deseado.En última instancia, las superficies de cultivo con películas de seda pueden ser directamente observadas o analizadas dentro del cultivo. Las placas o muestras pueden retirarse para su fijación y procesamiento adicional según sea necesario. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como el cultivo en plástico estándar para cultivo de tejidos, es que los biomateriales de película de seda son altamente biocompatibles y pueden transferirse fácilmente por parte de los investigadores a aplicaciones posteriores in vivo e in vitro.Este método puede utilizarse para responder preguntas clave en los campos de la biología celular y los biomateriales, como, ¿cómo puede utilizarse la topografía de superficie para afectar la respuesta celular? Aunque este método puede proporcionar información sobre la respuesta epitelial corneal, también puede aplicarse a otros sistemas donde experimentos iniciales in vitro puedan ofrecer respuestas preliminares a sistemas más complejos in vivo. Para comenzar la fabricación de moldes de caucho de silicona, obtenga la superficie topográfica deseada para el moldeado. Para esta demostración.Se utiliza una oblea estándar de silicio grabado de 100 milímetros. Solución de encapsulamiento de PDMS y solución catalizadora en una proporción de nueve a uno, según se proporcionan en un kit comprado. Mezcle bien las soluciones para iniciar el proceso de curado.Después de colocar la superficie del oblea de silicio dentro de un recipiente para vaciado, pese 4,5 gramos de solución de PDMS sobre el oblea de silicio. Una vez que la solución de PDMS se haya extendido uniformemente sobre el oblea, cúbralo con la tapa de una placa de Petri de 100 milímetros de diámetro y colóquelo a 10 milímetros de mercurio durante dos horas. Para desgasificar las burbujas de aire de la solución de PDMS, coloque el conjunto de vaciado sobre una superficie plana en un horno a 60 grados Celsius durante la noche; al día siguiente, coloque el oblea de silicio de PDMS curado en un baño de etanol al 100%.Antes de retirar el PDMS, comience a separarlo del oblea utilizando una cuchilla para levantar el borde periférico con pinzas. Retire suavemente el PDMS dentro del baño de etanol al 100 %. Tenga cuidado de no rasgar el elastómero de silicona; corte moldes individuales de PDMS usando un punzón de 14 milímetros. Este diámetro está diseñado para ajustarse a los pocillos de una placa de 24 pocillos.Para preparar la solución de seda, caliente dos litros de agua destilada hasta que hierva. En un vaso de precipitados, corte cinco gramos de capullos de gusano de seda Bombex mori en tercios, deseche los capullos extensamente contaminados, indicados por partículas de insecto excesivas que recubren la superficie interna del capullo. Añada lentamente 4,24 gramos de carbonato de sodio al volumen de agua hirviendo para evitar que hierva en exceso.Una vez que el carbonato de sodio se haya disuelto, agregue los trozos de capullo al agua hirviendo y agite con una barra de agitación recubierta de teflón durante 40 minutos. Después de hervir, drene cuidadosamente el agua destilada en el fregadero y escurra manualmente el extracto de seda para eliminar el exceso de agua. Luego, lave el extracto de seda colocándolo en un vaso de plástico con un litro de agua destilada y agitando durante 20 minutos.Repita este proceso de lavado dos veces con agua fresca. Escurra el extracto de seda lavado a mano y coloque el extracto de fibra de seda dentro de una campana química para que seque durante un período de 12 horas. Al día siguiente, pese las fibras de seda secas, que típicamente son aproximadamente 3,5 gramos.Luego, prepare una solución de bromuro de litio 9,3 molar para obtener una solución del 20% peso/volumen de seda según el protocolo escrito. Después de colocar el extracto de seda en el vaso de precipitados, vierta la solución de bromuro de litio sobre las fibras de seda.Asegúrese de que las fibras de seda estén sumergidas dentro de la solución. Con una espátula de laboratorio, coloque luego la seda disuelta en un horno a 60 grados Celsius durante cuatro horas. Después de cuatro horas, utilice una jeringa del tamaño adecuado para aspirar 12 mililitros de la solución de seda.Después de colocar una aguja de calibre 18, en el extremo de la jeringa, inyecte la solución en una cinta de diálisis. Posteriormente al llenado de la cinta, extraiga el aire restante de la cinta con la jeringa vaciada.Coloque el cassette de diálisis lleno en un litro de agua destilada. Cambie el agua después de una hora, cuatro horas, ocho horas, y luego tres veces cada 12 horas, para un total de seis cambios. Después de la diálisis.Recopile lentamente la solución de seda de las cassettes con la jeringa y transfiérala a tubos de centrífuga. Centrifugue la solución a 10,000 g y cuatro grados Celsius durante 20 minutos tras la centrifugación. Coloque el sobrenadante en un tubo nuevo.Después de repetir este proceso una segunda vez, pipetee dos muestras de solución de seda de 0,5 mililitros en platos pequeños de suero separados. Coloque los platos de suero dentro de un horno seco a 60 grados Celsius durante 12 horas o hasta que la solución de seda se seque. La solución de seda en bloque puede almacenarse a cuatro grados Celsius.Pese la película de seda sólida restante de ambas muestras para medir la densidad de concentración de proteína de seda de la solución. Prepare superficies de moldeo de PDMS utilizando cinta transparente para eliminar cualquier polvo. A continuación, limpie los sustratos de PDMS sumergiéndolos en etanol al 100 % durante un minuto.Luego, retírelos y deje secar. Para obtener una película de 50 micrómetros de grosor, extienda 70 microlitros de una solución de seda al 8% sobre moldes de PDMS. Utilizando una herramienta para extender líquidos, como la punta de una jeringa de un mililitro, deje secar las películas de seda descubiertas sobre un banco de flujo laminar, aplicando una presión de flujo de aire de 150 pascales durante un período de 90 minutos o hasta que las películas estén secas.Una vez que las películas estén secas, coloque todo el conjunto de películas, incluyendo los moldes de PDMS, en una cámara con agua y rodillas durante más de cuatro horas para producir una película insoluble en agua. Esta cámara suele ser un recipiente desecador vacío con agua en el fondo del recipiente, al que se aplica un vacío de 25 kilopascales tras retirar las películas de seda de la cámara con agua y rodillas. Trabaje en una cabina de flujo laminar para preparar un baño de etanol al 70 % en una placa de Petri de 35 milímetros.Luego, coloque los sustratos de control y los anillos de acero inoxidable en la placa durante al menos 10 minutos para esterilizarlos. A continuación, retire las películas de seda de los moldes de PDMS utilizando pinzas. Súmérjalas en etanol al 70 % y coloque cada película en un pozo individual de una placa de 24 pozos previamente llenada con un mililitro de etanol al 70 %.Asegúrese de que el lado del patrón esté orientado hacia arriba para permitir la adhesión celular. Para garantizar el éxito en este paso, es importante que las películas de seda se coloquen correctamente y de forma estéril dentro de los pocillos. Coloque los anillos de acero inoxidable encima de las películas SILT y déjelos incubar durante 10 minutos. Tras lavar la muestra según las instrucciones del texto, prepare la línea celular para su siembra tal como se indica allí. En esta demostración, se utiliza una línea de células epiteliales limbales corneales humanas como paso final. Muestree 500 microlitros de suspensión de HCLE por pocillo, utilizando típicamente una densidad de 10.000 células por centímetro cuadrado, y continúe con el protocolo experimental deseado. Aquí se muestran micrografías electrónicas de barrido de la línea celular HCLE, adheridas a películas de seda con patrón y lisas al segundo día.En cultivo HCLE, los cultivos continúan proliferando hasta alcanzar confluencia sobre superficies planas y con patrón al octavo día. En este cultivo, se comparan células HCLE en películas de seda planas y con patrón frente a sustratos de control de vidrio al primer día, cuarto día y octavo día. La cuantificación del cultivo mediante el contenido de ácido nucleico SQU y los datos del ensayo de actividad metabólica MTT demuestran la viabilidad de las células HCLE en sustratos de película de seda planos y con patrón en comparación con las superficies de control de vidrio a lo largo del tiempo.Se muestra aquí una imagen de contraste de fases con lapse de tiempo de células HCLE migrando sobre una superficie de película de seda con patrón. Durante un período de 18 horas, las células se sembraron a una densidad de 10.000 células por centímetro cuadrado y se cultivaron durante dos horas antes de la adquisición de imágenes; para comparación, se muestra una imagen de contraste de fases con lapse de tiempo de células HCLE migrando sobre una superficie de control plana durante un período de 18 horas bajo las mismas condiciones de cultivo. Una vez que se prepara la solución de seda y el moldeo de silicona, esta técnica puede realizarse en ocho horas si se lleva a cabo correctamente siguiendo este procedimiento.Otros métodos, como el escaneo de inmunofluorescencia, la microscopía electrónica y técnicas de biología molecular como las transferencias Western e inmunoensayos, junto con ensayos químicos como la viabilidad celular, la proliferación celular y la tasa metabólica, pueden evaluarse para comprender mejor la respuesta celular frente a estos diversos servicios de diseño personalizado. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar la solución de seda, crear patrones personalizados, películas de seda y cultivos. Cualquier tipo celular sobre estos sustratos.

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Research

Investigación

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Bioengineering

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