Cine Cultura de la Seda del sistema para In vitro Análisis y Diseño de Biomateriales

El objetivo general de este procedimiento es establecer un sistema de cultivo in vitro con película de seda. Esto se logra produciendo primero la solución de seda para hacer la película deseada. El segundo paso es fundir la solución de seda sobre la superficie de moldeo de caucho de silicona y dejar que la película se seque.

Posteriormente, la película de seda se procesa para el cultivo celular. A continuación, se ensambla el sistema de cultivo mediante técnica estéril. El paso final es sembrar las películas de seda con el tipo de célula deseado.

En última instancia, las superficies de cultivo de la película de seda se pueden obtener imágenes directamente o ensayar dentro del cultivo. Las placas o muestras se pueden extraer para su fijación y procesamiento posterior según sea necesario. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el cultivo en plástico de cultivo de tejidos estándar, es que los biomateriales de película de seda son altamente biocompatibles y pueden ser fácilmente transferidos por los investigadores a aplicaciones posteriores in vivo e in vitro.

Este método se puede utilizar para responder a preguntas clave en los campos de la biología celular y los biomateriales, como por ejemplo, ¿cómo se puede utilizar la topografía de la superficie para afectar la respuesta celular? Aunque este método puede proporcionar información sobre la respuesta epitelial de la córnea, también se puede aplicar a otros sistemas en los que los experimentos iniciales in vitro pueden proporcionar respuestas preliminares a sistemas in vivo más complejos. Para comenzar la fabricación de moldes de caucho de silicona, obtenga la superficie topográfica deseada para la fundición Para esta demostración.

Una oblea de silicio grabada estándar de 100 milímetros se usa mucho. Encapsulado PDMS y solución de catalizador en una proporción de nueve a uno, tal como se proporciona en un kit comprado. Mezcle bien las soluciones para iniciar el proceso de curado.

Después de colocar la superficie de la oblea de silicio dentro de un plato de fundición, pese 4,5 gramos de solución de PDMS sobre la oblea de silicona. Después de que la solución de PDMS se haya esparcido uniformemente sobre la oblea, cubra la oblea con una tapa de placa de Petri de 100 milímetros de diámetro y colóquela a 10 milímetros de mercurio durante dos horas. Para desgasificar las burbujas de aire de la solución de PDMS, coloque la configuración de fundición sobre una superficie plana en un horno a 60 grados centígrados durante la noche del día siguiente, coloque la oblea de silicona PDMS curada en un baño de etanol al 100%.

Antes de retirar el PDMS, comience a retirar el PDMS de la oblea utilizando una cuchilla de afeitar para levantar el borde de la circunferencia con pinzas Retire suavemente el PDMS dentro del baño de etanol al 100%. Teniendo cuidado de no rasgar la fundición de caucho de silicona, perfore los moldes PDMS individuales con un perforador de 14 milímetros. Este diámetro está diseñado para adaptarse a los pocillos de una placa de 24 pocillos.

Para preparar la solución de seda, ponga a hervir dos litros de agua destilada. En un altavoz de vidrio, corte cinco gramos de capullos de gusano de seda maorí bombex en tercios, deseche los capullos ampliamente contaminados según lo indique el exceso de partículas de insectos que cubren la superficie interna del capullo. Agregue 4,24 gramos de carbonato de sodio lentamente al volumen de agua hirviendo para evitar que hierva.

Una vez que el carbonato de sodio se haya disuelto, agregue los trozos de capullo al agua hirviendo y revuelva con una barra recubierta de teflón durante 40 minutos. Después de hervir, escurra con cuidado el agua destilada en el fregadero y exprima el extracto de seda con la mano para eliminar el exceso de agua. A continuación, lave el extracto de seda colocándolo en un vaso de precipitados de plástico con un litro de agua destilada y removiendo durante 20 minutos.

Repita este proceso de lavado con agua dulce dos veces. Toque el extracto de seda lavado con la mano y coloque el extracto de fibra de seda dentro de una campana química para permitir el secado durante un período de 12 horas. Al día siguiente, pesa las fibras de seda secas, que suelen ser de aproximadamente 3,5 gramos.

A continuación, prepare una solución de bromuro de litio de 9,3 molares para una solución de seda al 20% de peso a volumen de acuerdo con el protocolo escrito. Después de colocar el extracto de seda en el vaso de precipitados. Vierta la solución de bromuro de litio sobre las fibras de seda.

Asegúrate de que las fibras de seda estén sumergidas dentro de la solución. Con una espátula de laboratorio, coloque la seda disuelta en un horno a 60 grados centígrados durante cuatro horas. Después de cuatro horas, use una jeringa de tamaño adecuado para extraer 12 mililitros de la solución de seda.

Después de la colocación de una aguja de calibre 18. En el extremo de la jeringa, inyecte la solución en un casete de diálisis. Después de llenar el casete, extraiga el aire restante del casete con la jeringa vaciada.

Coloque el casete de diálisis lleno en un litro de agua destilada. Cambie el agua después de una hora, cuatro horas, ocho horas y luego tres veces cada 12 horas para un total de seis cambios. Después de la diálisis.

Recoja lentamente la solución de seda de los casetes con la jeringa y transfiérala a los tubos de centrífuga. Centrifugar la solución a 10.000 g y cuatro grados centígrados durante 20 minutos después de la centrifugación. Coloque la súper natina en un tubo nuevo.

Después de repetir este proceso por segunda vez, pipetee dos muestras de solución de seda de 0,5 mililitros en platos de suero pequeños separados. Coloque los platos de suero dentro de un horno seco a 60 grados centígrados durante 12 horas o hasta que la solución de seda se mueva. La solución de seda a granel se puede almacenar a cuatro grados centígrados.

Pese la película de seda sólida restante de ambas muestras para medir la densidad de concentración de proteína de seda de la solución. Prepare las superficies de fundición de PDMS usando cinta adhesiva transparente para eliminar el polvo. A continuación, limpie los sustratos de PDMS sumergiéndolos en etanol al 100% durante un minuto.

Luego retíralos y déjalos secar. Para producir una película de 50 micrómetros de espesor, extienda 70 microlitros de solución de seda al 8% en moldes de PDMS. Usando una herramienta de esparcimiento de líquidos, como una punta de jeringa de un mililitro, deje que las películas de seda se sequen sin cubrir en un banco limpio de flujo laminar ejerciendo una presión de flujo de aire de 150 pascales durante un período de 90 minutos o hasta que las películas estén secas.

Una vez que las películas estén secas, coloque todo el conjunto de películas, incluidos los moldes de PDMS, en una cámara de agua y rodillas durante más de cuatro horas para producir una película insoluble en agua. Por lo general, se trata de una cámara desecada vacía con agua en el fondo de la cuenca, tirada a un vacío de 25 kilopascales después de retirar las películas de seda del agua y de la cámara de rodillas. Trabaje en un banco de limpieza de flujo laminar para preparar un baño de etanol al 70% en una placa de Petri de 35 milímetros.

A continuación, coloque los sustratos de control y los anillos de acero inoxidable en el plato durante al menos 10 minutos para esterilizarlos. A continuación, retire las películas de seda de los moldes de PDMS con pinzas. Sumérjalos en etanol al 70% y coloque cada película en un solo pocillo de una placa de 24 pocillos prellenada con un mililitro de etanol al 70%.

Asegúrese de que el lado del patrón esté hacia arriba para permitir la adhesión de las células. Para garantizar el éxito en este paso, es importante que las películas de seda se coloquen de manera correcta y estéril dentro de los pocillos. Coloque los anillos de acero inoxidable encima de las películas SILT y déjelas incubar durante 10 minutos. Después de la muestra Lavado de la película como se indica en el texto, Prepare la línea de celdas para sentarse como se indica allí. En esta demostración, se utiliza una línea celular epitelial limbal de córnea humana como paso final Muestra 500 microlitros de suspensión de HCLE por pocillo, normalmente utilizando una densidad de 10.000 células por centímetro cuadrado y se procede a ejecutar el protocolo experimental deseado. Aquí se muestran micrografías electrónicas de barrido de la línea celular HCLE, adheridas a películas de seda estampadas y planas en el segundo día.

En el cultivo HCLE, los cultivos continúan proliferando hasta confluir en superficies planas y modeladas hacia el octavo día. En el cultivo aquí, las células HCLE estampadas y planas de películas de seda se comparan con sustratos de control de vidrio en el primer día, el día cuatro y el día ocho. En la cuantificación en cultivo con el contenido de ácido nucleico SQU y los datos del ensayo de actividad metabólica MTT demuestran la viabilidad de HCLE en sustratos de película de seda planos y estampados en comparación con las superficies de control de vidrio a lo largo del tiempo.

Aquí se muestran imágenes de contraste de fase de lapso de tiempo de células HCLE migrando sobre una superficie de película de seda estampada. Durante un período de tiempo de 18 horas, las células se asentaron a una densidad de 10.000 células por centímetro cuadrado y se cultivaron durante dos horas antes de obtener imágenes para la obtención de imágenes de contraste de fase de lapso de tiempo de comparación de las células HCLE migrando sobre una superficie de control plana durante un período de tiempo de 18 horas en las mismas condiciones de cultivo. Una vez preparada la solución de seda y el moldeo de silicona, esta técnica se puede realizar en ocho horas si se realiza correctamente siguiendo este procedimiento.

Otros métodos, como el escaneo de inmunofluorescencia, la microscopía electrónica y las técnicas de biología molecular, como los Western blots y los inmunoensayos, junto con ensayos químicos como la viabilidad celular, la proliferación celular y la tasa metabólica, se pueden evaluar para comprender mejor la respuesta celular en estos diversos servicios de diseño personalizado. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo hacer una solución de seda, crear patrones personalizados, películas de seda y cultura. Cualquier tipo de célula en estos sustratos.