La segmentación y la medición de los volúmenes de grasa en modelos murinos de obesidad Usando rayos X de tomografía computarizada

El objetivo general de este procedimiento es obtener imágenes no invasivas, cuantificar y visualizar el contenido de grasa en ratones vivos. Esto se logra primero realizando una tomografía computarizada (TC) de rayos X del ratón. El segundo paso del procedimiento consiste en segmentar y cuantificar los volúmenes de grasa dentro del ratón basándose en la densidad radiológica.

El tercer paso consiste en visualizar los datos de TC en tres dimensiones, con los volúmenes de grasa resaltados en rojo. En última instancia, los resultados pueden permitir la cuantificación y visualización del contenido de grasa durante estudios longitudinales in vivo utilizando una TC de rayos X albia, junto con los paquetes de software PMOD y vol view. Uno de los beneficios clave de esta técnica en comparación con métodos existentes como el análisis ex vivo, es que permite la evaluación no invasiva y longitudinal de la grasa en modelos animales pequeños de enfermedad.

Generalmente, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque el protocolo de segmentación y visualización incluye varios pasos que deben completarse en sucesión. Además, deben utilizarse los parámetros óptimos de rayos X durante la adquisición. Para obtener el mejor contraste del tejido adiposo, comience por anestesiar los ratones obesos de interés utilizando una cámara de inducción y luego transfiéralos a una mascarilla nasal.

Mantenga la anestesia durante la adquisición de imágenes y coloque a los ratones en una camilla estándar para ratas con las extremidades laterales respecto al tronco. Esto proporciona una adquisición uniforme de TC. Configure el sistema de TC para escanear una camilla de 115 milímetros de longitud utilizando 600 proyecciones.

Configure la fuente de rayos X a 200 microamperios y 45 kilovoltios pico, y utilice un filtro de aluminio de 0,5 milímetros para endurecer el haz. La dosis equivalente de radiación profunda que recibirá el ratón con esta configuración es aproximadamente 220 milisieverts, mientras que la dosis equivalente superficial es de 357,4 milisieverts en el ordenador. Seleccione el algoritmo FBP utilizando parámetros estándar para la reconstrucción de imágenes.

En última instancia, la imagen final está compuesta por píxeles isotrópicos de 125 micrones, foxholes, y puede utilizarse para el análisis de imágenes de animales completos. El análisis de imágenes se realiza utilizando el software de análisis PMOD; primero, PMOD segmenta las imágenes según la densidad del tejido y luego determina el volumen de grasa. Después de cargar la imagen, reduzca su tamaño para minimizar las demandas computacionales.

Diríjase a la pestaña de vista principal, seleccione herramientas seguido de reducir. Establezca los valores de reducción en dos para X, dos para Y y dos para Z, marque reemplazar y ejecute el proceso. Aparece un cuadro de mensaje cuando el proceso ha finalizado.

Para eliminar los elementos de la cama y del cono nasal de las imágenes, máscarelos antes del análisis de VOI. Navegue hasta diseños de planos, rotaciones, marcadores 3D espejo y seleccione planos y diseños. Seleccione mostrar el plano Z. Luego desplácese hasta el cono nasal en el plano Z.

A continuación, seleccione la pestaña principal VOI y elija dibujar vértices. Dibuje una ROI alrededor de la nariz, excluyendo la cama y el cono nasal, y seleccione copiar ROI real a cada uno. Corte con el elemento del cono nasal.

Pegue la ROI desde el buffer sobre la nariz según sea necesario. Utilice el comando del grupo de edición de vértices para ajustar las ROI. Cuando los conos nasales ya no sean visibles, elimine la ROI y genere una VOI para abarcar la circunferencia del animal.

Diríjase a las herramientas de VOI, seguidas por máscara y álgebra. Ingrese menos 1000 en el cuadro de diálogo proporcionado. Luego, seleccione el botón que dice Enmascarar vóxeles fuera de los VOI seleccionados.

Cuando aparezca el mensaje «¿Desea continuar con la operación de datos irreversible?», seleccione sí. Ahora diríjase a planos, diseños, rotaciones, marcadores 3D espejo y, finalmente, planos y diseños. Seleccione mostrar todos los planos.

Examine la integridad del VOI. Cuando el VOI tenga buen aspecto, guárdelo como un archivo analyze y cambie el prefijo del nombre del archivo. Continúe con la segmentación de la imagen para obtener el volumen total del animal.

Comience seleccionando herramientas y externas. Luego seleccione la casilla de verificación de segmentación. Ingrese un rango de menos 300 a más 3.500 y ejecute la segmentación.

Luego seleccione estadísticas de VOI, que informan estadísticas que representan el volumen total. Tome nota de este volumen. Ahora segmente la imagen para el volumen de grasa volviendo primero a la imagen de masas no segmentada.

En segundo lugar, cargue el archivo de datos de masa guardado y marque la casilla de análisis en la ventana de carga. A continuación, seleccione herramientas y externo. Luego, seleccione la casilla de segmentación.

Introduzca un rango de menos 200 a menos 50 y ejecute la segmentación. Tras aprobar los resultados, seleccione VOI.Statistics. Tenga en cuenta que las estadísticas informadas representan el volumen de grasa.

Guarde los resultados en el formato analizado y proporcione un prefijo único para el nombre del archivo. Sin embargo, si persisten la piel o la densidad periférica, utilice el protocolo de erosión y dilatación para eliminar estas regiones para el análisis de VOI. Antes de guardar, diríjase a herramientas externas y seleccione la casilla morfológica en el cuadro nuevo.

Seleccione erosión seguida de. A continuación, regrese al cuadro de verificación morfológico, seleccione dilatación y acepte; verifique que se haya resuelto el problema de densidad periférica o de la piel y guarde los resultados. Utilice el paquete de software Volvo View versión 3.2 para crear visualizaciones renderizadas en 3D de las imágenes segmentadas.

Comience por abrir el conjunto de datos de TC guardado en el formato analyze. Utilice la configuración predeterminada en la ventana emergente, luego abra el menú de complementos y en utilidades seleccione fusionar volúmenes. Desmarque la opción de reescalar componentes.

Haga clic en asignar Segunda entrada. Elija los datos de grasa segmentada para la segunda entrada y utilice la configuración predeterminada en la ventana emergente. Luego, aplique el complemento para obtener una vista más amplia del ratón sujeto.

Haga doble clic en la ventana de vista de volumen. Regrese a la pestaña de color/opacidad. El cuadro desplegable de componente indica qué conjunto de datos se está editando actualmente.

En la parte inferior de la pestaña hay dos controles deslizantes. Estos determinan el brillo relativo de cada conjunto de datos dentro de la superposición, utilizando valores entre cero y uno. Para cambiar el color a escala de grises, por ejemplo, vaya a la sección de asignación de color escalar.

Haga doble clic en uno de los controles deslizantes y arrástrelo fuera del cuadro. Agregue un segundo control deslizante haciendo clic en cualquier lugar dentro del área de los controles deslizantes. Haga que el control deslizante de color izquierdo sea negro y el control deslizante de color derecho sea blanco.

A continuación, vaya al cuadro de mapeo de opacidad del escalar y cree un nuevo punto haciendo clic dentro del cuadro. Esto dará un total de tres puntos en la ventana para el punto central. Cambie el valor escalar a aproximadamente menos 3000 y cambie el valor de opacidad a cero.

A la derecha de la ventana se encuentra el tercer punto; cambie su valor escalar a aproximadamente 32.000 y su opacidad a 0,25. El primer punto puede estar en cualquier lugar a la izquierda, siempre que el valor de opacidad esté establecido en cero. Con el ajuste escalar activado, cambie al componente dos, que debería modificar la apariencia de la grasa, y cambie cada control deslizante de color a rojo haciendo doble clic y moviendo el control deslizante de matiz H hasta el extremo.

Esto colorea falsamente la grasa en rojo. Para crear una película de rotación de tres paneles que muestre la grasa en TC y la superposición, primero haga clic y arrastre el ratón sujeto a una posición vertical con la espalda orientada hacia arriba. En segundo lugar, en pesos de componente, establezca el valor del componente dos en cero para que solo se muestre la exploración de TC. Tercero, haga clic en revisar, seguido de cámara, y seleccione un número de cuadros para la película de rotación. Cuarto, cambie el valor de rotación en X a 360 grados.

En quinto lugar, seleccione crear en el cuadro de diálogo emergente. Cree una nueva carpeta denominada CT y guarde el archivo en formato TIF, lo que generará una serie de imágenes de rotación. Repita estos pasos para la imagen de grasa, así como para la imagen de CT de grasa superpuesta, guardando sus imágenes de rotación en carpetas separadas. Para generar una película de rotación a partir de las imágenes resultantes, abra ImageJ e importe las secuencias de imágenes.

Seleccione la primera imagen en la carpeta de TC y las demás se seleccionarán automáticamente. Repita este proceso para las secuencias de grasa y superposición con una de las pilas. Todavía abierta.

Abra el administrador de ROI. Se encuentra en las herramientas de análisis y luego en el administrador de ROI; dibuje una ROI alrededor del ratón sujeto excluyendo píxeles de fondo innecesarios. Al completar, haga clic en agregar en el administrador de ROI.

Luego, aplique la misma ROI a cada secuencia de imágenes. Cuando la ROI esté en todas las pilas, haga clic con el botón derecho. Dentro de la ROI, seleccione duplicar y elija. Verifique la pila duplicada.

Esto separa la región de interés (ROI) del resto de la imagen. Ahora cierre las pilas de imágenes más grandes y repita este procedimiento para las tres secuencias de imágenes. Para combinar las pilas, utilice el comando combinar, que se encuentra bajo pilas y luego herramientas.

Seleccione la pila de TC para la pila uno y la pila de grasa para la pila dos. Luego repita el proceso. Seleccione las pilas recién combinadas para la pila uno y la pila superpuesta para la pila dos.

Esto completa la creación de una pila de rotación de imagen con tres paneles. Previsualice la pila seleccionando reproducir en la esquina inferior izquierda de la ventana de la imagen. Luego, guárdela como una película AVI.

Se utilizaron ratones obesos B seis V LE OB J para ilustrar la viabilidad del sistema Alber CT. Para mediciones del contenido de grasa basadas en CT, se compararon con los tipos silvestres C 57 negro seis. A la izquierda se muestra el volumen total de CT de un ratón obeso.

En el centro se muestra el volumen de grasa en rojo, y a la derecha aparece la superposición. Un análisis similar en animales de tipo salvaje muestra la diferencia sustancial en el contenido de grasa en comparación con el ratón obeso. Se calculó el volumen total, el volumen de grasa y las proporciones de volumen para cada animal.

La proporción promedio de grasa respecto al volumen total para el grupo de tipo silvestre y el grupo obeso fue de 0,09 y 0,42, respectivamente. Estos valores difirieron significativamente con un valor de P de 0,001. Después de ver este video, se deberá tener una comprensión sólida de cómo segmentar los volúmenes de grasa dentro de un conjunto de datos de TC de un ratón vivo una vez dominado el procedimiento.

Esta técnica debería llevar menos de 30 minutos realizarla. Gracias por vernos, y nos veremos la próxima vez.