Name: La segmentación y la medición de los volúmenes de grasa en modelos murinos de obesidad Usando rayos X de tomografía computarizada (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 9 s
Description: Aprende a segmentar y cuantificar volúmenes de grasa en modelos murinos de obesidad mediante tomografía computarizada de rayos X. Este método no invasivo permite estudios longitudinales en ratones vivos.

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Agradecemos calurosamente a la catedral de Notre Dame Integrado Imaging Facility (NDIIF) y Carestream Health para el apoyo financiero para este proyecto.

1. Animales <ol><li> Por los resultados presentados a continuación, tres y cuatro ratones C57BL/6J B6.V-LEP ratones ob / J se obtuvieron de los Laboratorios Jackson (Bar Harbor, Principal, EE.UU.). B6.V-LEP ob / J ratones representan uno de los primeros modelos de la obesidad y se mantienen investigando activamente. B6.V-LEP ob / J ratones muestran un fenotipo caracterizado por aumento de tamaño y número de adipocitos y pueden pesar hasta tres veces más que los ratones de tipo salvaje. 7,8 En este caso, B6.V-LEP ob / J ratones se emplea como un hecho positivo de control para un fenotipo obeso para ilustrar la viabilidad del sistema de Albira CT para CT basados ​​en las mediciones del contenido de grasa. </li><li> Imágenes se realizó cuando los animales alcanzaron aproximadamente 12 semanas de edad. (La obesidad en B6.V-LEP ob / J ratones se manifiesta después de 4 semanas de edad). </li><li> Los ratones fueron anestesiados por el isofluorano (2,5% del caudal) y se mantiene en el 2,5% a través de una configuración de ojiva para la imagen. Untrado animales seropositivos se coloca boca abajo en el lecho de rata estándar (M2M Imaging Inc. de Cleveland, OH) en suministrado con la estación de imagen Albira. Las ramas laterales se colocaron en el torso de un uniforme de la adquisición del TC. </li><li> Después de la adquisición de la imagen se completó, los ratones fueron retirados del cono de la nariz y volvió a una jaula de recuperación hasta ambulatoria. </li></ol> 2. Adquisición de imágenes y reconstrucción <ol><li> Adquisiciones de imágenes se realizan utilizando el sistema de Albira CT (Carestream Molecular Imaging, Woodbridge, CT). Los ratones fueron anestesiados por el isofluorano (2,5% del caudal) y se mantiene en el 2,5% a través de una configuración de ojiva para la imagen. Las adquisiciones se realizaron para analizar una cama de 115 mm de longitud, con 600 proyecciones. La fuente de rayos X se fijó a una corriente de 200 mA y el voltaje de 45 kVp, y se utiliza un filtro de 0,5 mm de Al para endurecer la viga. </li><li> Equivalente aproximado de la dosis de radiación profunda para los ajustes de CT fue de 220 mSv, y ​​la dosis equivalente superficial fue 357,4 mSv. Estoslas dosis son más de 20 veces menor que el reportado valores de la DL50. 9 </li><li> Las imágenes se reconstruyen utilizando la FBP (proyección filtrada) a través del algoritmo de Albira Suite 5.0 Reconstructor &quot;Estándar&quot; con los parámetros. Se trata de adquisición combinada y la configuración de reconstrucción producir una imagen final con 125 voxels isotrópicos micras, considera suficiente para el análisis de animal entero. Para el análisis de la región específica y detallada, una reconstrucción con 35 vóxeles isotrópicos micras puede ser seleccionado para una resolución final de 90 micrómetros. </li></ol> 3. Análisis de Imagen El análisis de imágenes se realiza mediante el PMOD (PMOD Technologies Ltd, Zurich, Suiza) el software de análisis. Las imágenes son segmentados en PMOD de acuerdo a la densidad de los tejidos, primero para el volumen total y el volumen de grasa. 3.1 Las imágenes pueden ser reducido para el análisis de minimizar las exigencias de cálculo. <ol><li> Para reducir, vaya a la pestaña Vista principal. </li&gt; <li> Seleccione Herramientas&gt; Reducir. </li><li> Seleccione X por 2, Y por 2, y Z por 2. </li><li> Compruebe reemplazar. </li><li> Seleccione Ejecutar. </li></ol> El mensaje: &quot;cuadro delimitador va a cambiar&quot; aparece una vez que la reducción es completa. 3.2 Las imágenes se pueden enmascarar para eliminar elementos de la cama y la nariz de cono para su posterior volumen de interés (VOI) el análisis. <ol><li> Para enmascarar, vaya a planos, diseños, rotaciones, espejos, marcadores 3D&gt; Planes y Distribución. </li><li> Seleccione Mostrar plano Z. </li><li> Desplácese hasta el cono de la nariz en el plano Z. </li><li> Seleccione la pestaña principal de VOI&gt; Dibuja los vértices. </li><li> Dibuja una región de interés (ROI) en torno a la nariz del animal, con exclusión de la cama y el cono de la nariz. </li><li> SeleccionarCopia retorno de la inversión real. </li><li> Vaya a la corte el próximo, y pegar el ROI de búfer a través de los planos correspondientes de la nariz. </li><li> Utilice la opción Editar Grupo de los vértices para ajustar el rendimiento de la inversión según sea necesario. </li><li> Seleccione Eliminar retorno de la inversión en los primeros planos más allá de los conos de ojiva. </li><li> Generar una nueva VOI para abarcar la circunferencia de animales (con exclusión de la cama de animales) en los primeros planos más allá de los conos de ojiva. </li><li> Vaya a VOI herramientas de máscaras&gt; y Álgebra. </li><li> Introduzca -1000 en el cuadro de diálogo proporcionado. </li><li> Seleccione los voxels máscara fuera el botón de VOIs seleccionado. </li></ol> El mensaje: &quot;. Operación de datos irreversible ¿Desea continuar?&quot; pantallas. <ol start="14"><li> Seleccione Sí. </li><li> Navegue hasta planos, diseños, rotaciones, espejos, marcadores 3D&gt; Planes y Laysalidas. </li><li> Seleccione Mostrar todos los planos. </li><li> Examine el VOI para la integridad. </li><li> Seleccione Guardar. </li><li> Analizar Guardar como. </li><li> Cambiar el prefijo de nombre de archivo. </li></ol> 3.3 Primer segmento, la imagen del volumen total del animal: <ol><li> Seleccione Herramientas&gt; Externa. </li><li> Seleccione la casilla de verificación de segmentación. </li><li> Introduzca un rango de -300 a 3.500 (rango de referencia de densidad derivada de la densidad de la grasa abdominal amplia-región). </li><li> Seleccione Ejecutar segmentación. </li><li> Examine la integridad de la segmentación. </li><li> Seleccione Aceptar. </li><li> Seleccione Eliminar retorno de la inversión. </li><li> Seleccione las estadísticas VOI. </li></ol> Estadísticas reportadas representan el volumen total. <ol start="9"><li> Registre el volumen reportado. </li&gt; </ol> 3.4 Segmento siguiente, la imagen de volumen de grasa: <ol><li> Volver a la imagen enmascarada no segmentado de la grasa-el volumen de segmentación. </li><li> Para cargar el archivo guardado los datos enmascarados, marque la casilla Analizar en la ventana de carga). </li><li> Seleccione Herramientas&gt; Externa. </li><li> Seleccione la casilla de verificación de segmentación. </li><li> Introduzca un rango de -200 a -50. </li><li> Seleccione Ejecutar segmentación. </li><li> Examine la integridad de la segmentación. </li><li> Seleccione Aceptar. </li><li> Seleccione las estadísticas VOI. </li></ol> Las estadísticas reportadas representan el volumen de grasa. <ol start="10"><li> Registre el volumen reportado. </li><li> Seleccione Guardar. </li><li> Analizar Guardar como. </li><li> Cambiar el prefijo de nombre de archivo. </li></ol><strong&gt; Opcional: Si la piel / densidad periférica sigue siendo, la &quot;erosión y la dilatación&quot; del protocolo a continuación se puede realizar para eliminar estas regiones para el análisis de VOI. <ol><li> Seleccione Herramientas&gt; Externa. </li><li> Seleccione la casilla de verificación morfológica. Las pantallas de vista morfológico. </li><li> Seleccione la erosión. </li><li> Seleccione Aceptar. </li><li> Seleccione Herramientas&gt; Externa. </li><li> Seleccione la casilla de verificación morfológica. Las pantallas de vista morfológico. </li><li> Seleccione la dilatación. </li><li> Seleccione Aceptar. </li></ol> 4. La visualización de las imágenes de TC 4,1 VolView v3.2 (Kitware, Clifton Park, NY, EE.UU.) se utilizó para crear pantallas 3D prestados visual de las imágenes segmentadas. <ol><li&gt; Abre los datos CT establecidos en el formato Analyze. </li><li> Utilice la configuración predeterminada en la ventana emergente. </li><li> Abra el menú de plug-ins. </li><li> En Utilidad, seleccione Combinar volúmenes. </li><li> Desactive la opción Cambiar la escala de los componentes. </li><li> Haga clic en Asignar segunda entrada. </li><li> Elija los datos segmentados de grasa para la segunda entrada. </li><li> Utilice la configuración predeterminada en la ventana emergente. </li><li> Haga clic en Aplicar plug-in. </li><li> Haga doble clic en Volumen ventana de visualización para una vista más grande del ratón tema. </li></ol> 4.2 Volver a la ficha Color / Opacidad. El componente de cuadro desplegable se refiere al conjunto de datos que se está editando actualmente. Dos deslizadores se encuentran en la parte inferior de la ficha y determinar el brillo relativo de cada conjunto de datos de componentes establecidos dentro de la superposición, el uso de valores de 0 a 1. Para el componente 1, the CT, se prefiere usar una combinación de colores en escala de grises. Para cambiar el color: <ol><li> En la sección Escalar Asignación de color, haga doble clic en uno de los reguladores de color. </li><li> Para quitar un control deslizante, arrástrelo fuera de la caja. </li><li> Para agregar un nuevo deslizador, haga clic en cualquier lugar dentro del área del conmutador. </li><li> Retire uno de los deslizadores. </li><li> Hacer de la izquierda regulador de color negro (valor escalar (S) = -19.000). </li><li> Gire a la derecha regulador de color blanco ((S) = 15000). </li><li> En el cuadro de escalar mapas de opacidad, crear un nuevo punto haciendo clic dentro de la caja. Esto le dará un total de tres puntos en la ventana. </li><li> Por el punto medio, cambiar el (S) para ~ -3000, y la opacidad (O) valor de 0. </li><li> Seleccione el tercer punto a la derecha de la ventana. </li><li> Cambiar (S) a cerca de 32.000, y <strong&gt; O a 0.25. </li><li> El primer punto puede estar en cualquier parte de la izquierda, al igual que siempre y cuando el valor de opacidad se establece en 0. </li><li> Cambie a dos componentes, que debe modificar el aspecto de la grasa. </li><li> Cambie cada uno de los deslizadores de color a rojo, haciendo doble clic y arrastrando el tono (H) control deslizante hacia la izquierda para el mapa en falso color de la grasa de color rojo. Muy poco más se necesita para ajustar el aspecto de la grasa. </li></ol> 4.3 Para crear una película de rotación de tres paneles muestra el TC, la grasa y de superposición: <ol><li> Haga clic y arrastre el ratón del sujeto en una posición vertical con la parte trasera mirando hacia usted. </li><li> En virtud de pesos de los componentes, establezca el valor del componente de dos a 0 para mostrar sólo la TC. </li><li> Haga clic en Revisar&gt; Cámara. </li><li> Seleccione un número de fotogramas for la rotación de la película (en el presente caso, se optó por &quot;36&quot;). </li><li> Cambiar el valor de rotación X a 360 grados. </li><li> Seleccione Crear. </li><li> En el cuadro de diálogo emergente, crear una nueva carpeta llamada TC, y guarde el archivo en formato TIFF, que se emitirá una serie de imágenes de rotación. </li><li> Repetir este paso para la imagen de grasa, así como para la superpuesto grasa / TC imagen, ahorrando en carpetas individuales cada vez. </li></ol> ImageJ 4,4 v 1.43u se utilizó para generar un archivo de película con la rotación de las imágenes de salida VolView. <ol><li> En ImageJ, seleccione Archivo&gt; Importar secuencia de imágenes&gt;. </li><li> Seleccione la primera imagen en la carpeta CT. El software detectará automáticamente los archivos de otros y abrir como una pila. </li><li> Repita el proceso para abrir las secuencias de grasa y de superposición. </li><li> Abra el Administrador de retorno de la inversión en Análisis&gt; Herramientas&gt; ROIManager. </li><li> Dibuja un retorno de la inversión alrededor del ratón tema, con exclusión de los píxeles de fondo innecesarias. </li><li> En el gestor de retorno de la inversión, haga clic en Agregar para agregar el retorno de la inversión. </li><li> Seleccione una secuencia de imágenes diferentes. </li><li> En el gestor de retorno de la inversión, haga clic en el retorno de la inversión para aplicarlo a la imagen. De esta manera, cada una de las pilas recortadas se corresponden perfectamente. </li><li> Cuando el retorno de la inversión está en todas las pilas, haga clic derecho en el retorno de la inversión. </li><li> Seleccione Duplicar. </li><li> Seleccione Ver la caja de la pila Duplicar para separar el retorno de la inversión del resto de la imagen. </li><li> Cerca de las pilas de imágenes más grandes. </li><li> Repita este procedimiento para las tres secuencias de imágenes. </li><li> Ir a Imagen&gt; Pilas&gt; Herramientas&gt; Combinar para combinar las pilas juntos. </li><li> Seleccione la TC para la pila 1. </li><li> Seleccione la grasa de la pila 2. </li><li<html> &gt; Repetir y seleccione Pilas combinados para la pila 1 y de superposición de la pila 2. </li><li> Ahora hay una de tres paneles, la imagen de rotación de la pila que se puede visualizar seleccionando Reproducir en la esquina inferior izquierda de la ventana de la imagen. </li><li> Para guardar la película como un archivo AVI, seleccione Archivo&gt; Guardar como ...&gt; AVI ... </li><li> Haga clic en Guardar. </li></ol> 5. Los resultados representativos Los resultados de tres WT (C57BL/6J) los ratones obesos y cuatro (B6.V-Lep ob / J) los ratones se presentan aquí como un ejemplo representativo de las mediciones de relación de grasa / total de volumen que emplean el sistema Albira CT. Figura 1 se presenta un representante de visualización creado con VolView v3.2 para la segmentación (es decir, volumen total y el volumen de grasa) de ratones obesos imágenes de TC. 0/3680fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Representante CT segmentados para la grasa de las imágenes. (A) Obeso ratón (B6.V-Lep ob / J) del volumen total de TC en escala de grises, (B) el volumen de grasa en rojo, y (C) fusión de imágenes. (D) PESO ratón (C57BL/6J) el volumen total de TC en escala de grises, (E) el volumen de grasa en rojo, y (F) la fusión de imágenes. El volumen total, los volúmenes de grasa, y calculó el volumen de grasa / total se presentan a continuación en la Tabla 1 para cada ratón WT y cada ratón obeso. El promedio de grasa / total de la relación de volumen para el grupo PT y el grupo de obesos fue de 0,09 y 0,42, respectivamente (Figura 2). Las relaciones de volumen de grasa / total de los ratones WT frente a los ratones obesos se encontró diferencias significativas (p = 0,001). <table border="1"><tbody><tr><td> WT (C57BL/6J) </td><td> Total (cm 3) </td><td> Grasa (cm 3) </td><td> Grasa / Total Ratio </td><td> Obeso (B6.V-Lep ob </sup&gt; /) </td><td> Total (cm 3) </td><td> Grasa (cm 3) </td><td> Grasa / Total Ratio </td></tr><tr><td> Animal 1 </td><td> 28,79 </td><td> 3,00 </td><td> 0,10 </td><td> Animal 1 </td><td> 66,25 </td><td> 26,75 </td><td> 0,40 </td></tr><tr><td> Animal 2 </td><td> 33,25 </td><td> 3,05 </td><td> 0,09 </td><td> Animal 2 </td><td> 61,15 </td><td> 26,31 </td><td> 0,43 </td></tr><tr><td> Animal 3 </td><td> 30,30 </td><td> 2,63 </td><td> 0,09 </td><td> Animal 3 </td><td> 64,19 </td><td> 25,7 </td><td> 0,40 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Animal 4 </td><td> 54,25 </td><td> 23,78 </td><td> 0,44 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. El volumen total, el volumen de grasa,y la proporción de volumen de grasa / total de ratones WT y la obesidad. volúmenes totales y la grasa se ​​obtuvieron a partir de imágenes segmentadas utilizando el análisis de PMOD VOI. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3680/3680fig2.jpg" /> Figura 2. Promedio de los cocientes del volumen de grasa / total de ratones WT frente a los ratones obesos. Un promedio de grasa / total de relaciones de volumen para el peso (C57BL/6J) y obesidad (B6.V-Lep ob / J) que se encuentran a ser 0,09 y 0,42, respectivamente, se muestran. (Las barras de error = desviación estándar de una sola). WT frente obesos grasa / total de relaciones de volumen se encontraron diferencias significativas (p-valor = 0,001).

<ol><li>Clarke, P. J., O'Malley, P. M., Schulenberg, J. E., Johnston, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midlife+and+Socioeconomic+Consequences+of+Persistent+Overweight+Across+Early+Adulthood%3A+Findings+From+a+National+Survey+of+American+Adults+%281986-2008%29%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">Midlife and Socioeconomic Consequences of Persistent Overweight Across Early Adulthood: Findings From a National Survey of American Adults (1986-2008).</a> Am. J. Epidemiol. , (2008).</li>
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<li>Judex, S., Luu, Y. K., Ozcivici, E., Adler, B., Lublinsky, S., Rubin, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Adiposity+in+Small+Animal+Rodents+using+Micro-CT%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Quantification of Adiposity in Small Animal Rodents using Micro-CT.</a> Methods. 50, 14(2010).</li>
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<li>Patchen, M. L., MacVittie, T. J., Souza, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postirradiation+treatment+with+granulocyte+colony-stimulating+factor+and+preirradiation+WR-2721+administration+synergize+to+enhance+hemopoietic+reconstitution+and+increase+survival%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Oncology%22%5BJournal%5D)">Postirradiation treatment with granulocyte colony-stimulating factor and preirradiation WR-2721 administration synergize to enhance hemopoietic reconstitution and increase survival.</a> International Journal of Radiation Oncology. 22, 773-779 (1992).</li>
</ol>

Todd A. Sasser, Li Shengting, Sean P. Orton, y Seth T. Gammon son empleados de Carestream Molecular Imaging. Carlos Correcher es un empleado de ONCOVISION, Gem-Imaging SAW Mateo Leevy es un consultor de Carestream Molecular Imaging.

En este caso, la utilización de B6.V-LEP ob / J ratones que han demostrado la factibilidad de realizar las mediciones de contenido de grasa en un modelo animal pequeño utilizando el sistema de Albira TC. Estas mediciones son consistentes con las expectativas para las comparaciones de intra-grupo y las mediciones entre los grupos. En primer lugar, los resultados representativos que aquí resaltar limitada dentro del grupo la variabilidad en las mediciones de relaciones de volumen de grasa / total en ambos grupos de ratones WT y la obesidad con estos procedimientos. En segundo lugar, la grasa / total de relaciones de volumen para los ratones WT contra obesidad difieren significativamente. Por último, sobre la base de las comparaciones (no se muestra) con los valores previamente reportados para relación masa grasa total y porcentaje de grasa corporal para WT contra B6.V-LEP ratones ob / J, las mediciones relativas a los ratios de volumen de grasa / total para el peso frente al B6.V- Lep ob / J ratones caen dentro de un rango esperado, 7, 8. Los métodos detallados aquí podría ser aplicado o adaptado para m otraodelos y / o los objetivos del estudio. Las modificaciones en los parámetros de reconstrucción puede ser necesaria para lograr objetivos específicos. Por ejemplo, Judex et al. (2010) informó que 50 imágenes de resolución de micras se requiere para un análisis específico de la región. Uno volúmenes cm isotrópicas de una imagen puede ser seleccionado por 35 reconstrucciones micras en el Reconstructor Albira 5,0 suite utilizando el &quot;HR&quot; opción de reconstrucción. Una vez que el sistema de Albira CT se ha utilizado para la región y de órganos específicos mediciones del contenido de grasa de todos los beneficios (es decir, la región y simultánea de órganos específicos de la medición del volumen de grasa y las mediciones longitudinales) de TC basada en el análisis de contenido de grasa puede ser ejercido por el sistema de Albira TC. Conclusiones: Aquí le ofrecemos un detallado paso por paso el método para la medición del contenido de grasa en ratones vivos que utilizan rayos X de tomografía computerizada. Adquirimos nuestros datos de la TC establece utilizando una estación de la imagen Albira, y se realizó la segmentación posterior y analisis utilizando la suite de software PMOD. Por último, se proporcionan instrucciones para que la representación fácil y visualización de la distribución del tejido graso en el animal entero.

la segmentación y la medición de los volúmenes de grasa en modelos murinos de obesidad usando rayos x de tomografía computarizada

Segmentation and Measurement of Fat Volumes in Murine Obesity Models Using X-ray Computed Tomography

La obesidad se asocia con una mayor morbilidad y mortalidad, así como métricas de reducción en la calidad de vida. 1 Ambos factores ambientales y genéticos están asociados con la obesidad, aunque los mecanismos precisos subyacentes que contribuyen a la enfermedad están siendo delineadas. 2,3 Varios pequeños animales modelos de obesidad se han desarrollado y se emplean en una variedad de estudios. 4 Un componente crítico de estos experimentos consiste en la recogida de datos en animales regionales y / o total del contenido de grasa en condiciones variadas. Los métodos tradicionales experimentales disponibles para medir el contenido de grasa en pequeños modelos animales de obesidad incluyen invasiva (por ejemplo, la medición ex vivo de los depósitos de grasa), y no invasivos (por ejemplo, de energía dual de rayos X (DEXA) o resonancia magnética (RM)) protocolos cada uno de ellos presenta ventajas y desventajas en relación. Los actuales métodos invasivos para medir el contenido de grasa puede proporcionar detallespara el órgano y la región específica de distribución de la grasa, pero sacrificando los sujetos se oponen a las evaluaciones longitudinales. Por el contrario, las actuales estrategias no invasivas ofrecen detalles limitados para órgano y la región de distribución de la grasa específica, sino que permiten la evaluación longitudinal de valor. Con la llegada de pequeños animales dedicados de rayos X de tomografía computarizada (TC) y los sistemas personalizados de procedimientos analíticos, tanto de órganos y el análisis de la región específica de distribución de la grasa y el perfil longitudinal puede ser posible. Informes recientes han validado el uso de la TC para la visualización in vivo longitudinal de la adiposidad en los ratones que viven 5,6. A continuación presentamos un método modificado que permite la medición del volumen de grasa / total, el análisis y la visualización de la utilización de la Carestream Molecular Imaging Albira sistema CT en conjunto con paquetes de software y PMOD Volview.

Análisis de contenido de grasa se realiza rutinariamente en los estudios que utilizan modelos murinos de obesidad. Métodos emergentes en pequeños animales y el análisis de imágenes de TC están proporcionando los detalles longitudinal rica análisis de contenido de grasa. A continuación le detallamos paso a paso los procedimientos para la realización de pequeños animales TAC, análisis y visualización.

La segmentación y la medición de los volúmenes de grasa en modelos murinos de obesidad Usando rayos X de tomografía computarizada

La obesidad se asocia con un aumento de la morbilidad y la mortalidad, así como con una reducción de los indicadores de calidad de vida.1 Tanto los factores ambientales como los genéticos son ...

El objetivo general de este procedimiento es obtener imágenes no invasivas, cuantificar y visualizar el contenido de grasa en ratones vivos. Esto se logra primero realizando una tomografía computarizada (TC) de rayos X del ratón. El segundo paso del procedimiento consiste en segmentar y cuantificar los volúmenes de grasa dentro del ratón basándose en la densidad radiológica.El tercer paso consiste en visualizar los datos de TC en tres dimensiones, con los volúmenes de grasa resaltados en rojo. En última instancia, los resultados pueden permitir la cuantificación y visualización del contenido de grasa durante estudios longitudinales in vivo utilizando una TC de rayos X albia, junto con los paquetes de software PMOD y vol view. Uno de los beneficios clave de esta técnica en comparación con métodos existentes como el análisis ex vivo, es que permite la evaluación no invasiva y longitudinal de la grasa en modelos animales pequeños de enfermedad.Generalmente, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque el protocolo de segmentación y visualización incluye varios pasos que deben completarse en sucesión. Además, deben utilizarse los parámetros óptimos de rayos X durante la adquisición. Para obtener el mejor contraste del tejido adiposo, comience por anestesiar los ratones obesos de interés utilizando una cámara de inducción y luego transfiéralos a una mascarilla nasal.Mantenga la anestesia durante la adquisición de imágenes y coloque a los ratones en una camilla estándar para ratas con las extremidades laterales respecto al tronco. Esto proporciona una adquisición uniforme de TC. Configure el sistema de TC para escanear una camilla de 115 milímetros de longitud utilizando 600 proyecciones.Configure la fuente de rayos X a 200 microamperios y 45 kilovoltios pico, y utilice un filtro de aluminio de 0,5 milímetros para endurecer el haz. La dosis equivalente de radiación profunda que recibirá el ratón con esta configuración es aproximadamente 220 milisieverts, mientras que la dosis equivalente superficial es de 357,4 milisieverts en el ordenador. Seleccione el algoritmo FBP utilizando parámetros estándar para la reconstrucción de imágenes.En última instancia, la imagen final está compuesta por píxeles isotrópicos de 125 micrones, foxholes, y puede utilizarse para el análisis de imágenes de animales completos. El análisis de imágenes se realiza utilizando el software de análisis PMOD; primero, PMOD segmenta las imágenes según la densidad del tejido y luego determina el volumen de grasa. Después de cargar la imagen, reduzca su tamaño para minimizar las demandas computacionales.Diríjase a la pestaña de vista principal, seleccione herramientas seguido de reducir. Establezca los valores de reducción en dos para X, dos para Y y dos para Z, marque reemplazar y ejecute el proceso. Aparece un cuadro de mensaje cuando el proceso ha finalizado.Para eliminar los elementos de la cama y del cono nasal de las imágenes, máscarelos antes del análisis de VOI. Navegue hasta diseños de planos, rotaciones, marcadores 3D espejo y seleccione planos y diseños. Seleccione mostrar el plano Z. Luego desplácese hasta el cono nasal en el plano Z.A continuación, seleccione la pestaña principal VOI y elija dibujar vértices. Dibuje una ROI alrededor de la nariz, excluyendo la cama y el cono nasal, y seleccione copiar ROI real a cada uno. Corte con el elemento del cono nasal.Pegue la ROI desde el buffer sobre la nariz según sea necesario. Utilice el comando del grupo de edición de vértices para ajustar las ROI. Cuando los conos nasales ya no sean visibles, elimine la ROI y genere una VOI para abarcar la circunferencia del animal.Diríjase a las herramientas de VOI, seguidas por máscara y álgebra. Ingrese menos 1000 en el cuadro de diálogo proporcionado. Luego, seleccione el botón que dice Enmascarar vóxeles fuera de los VOI seleccionados.Cuando aparezca el mensaje «¿Desea continuar con la operación de datos irreversible?», seleccione sí. Ahora diríjase a planos, diseños, rotaciones, marcadores 3D espejo y, finalmente, planos y diseños. Seleccione mostrar todos los planos.Examine la integridad del VOI. Cuando el VOI tenga buen aspecto, guárdelo como un archivo analyze y cambie el prefijo del nombre del archivo. Continúe con la segmentación de la imagen para obtener el volumen total del animal.Comience seleccionando herramientas y externas. Luego seleccione la casilla de verificación de segmentación. Ingrese un rango de menos 300 a más 3.500 y ejecute la segmentación.Luego seleccione estadísticas de VOI, que informan estadísticas que representan el volumen total. Tome nota de este volumen. Ahora segmente la imagen para el volumen de grasa volviendo primero a la imagen de masas no segmentada.En segundo lugar, cargue el archivo de datos de masa guardado y marque la casilla de análisis en la ventana de carga. A continuación, seleccione herramientas y externo. Luego, seleccione la casilla de segmentación.Introduzca un rango de menos 200 a menos 50 y ejecute la segmentación. Tras aprobar los resultados, seleccione VOI.Statistics. Tenga en cuenta que las estadísticas informadas representan el volumen de grasa.Guarde los resultados en el formato analizado y proporcione un prefijo único para el nombre del archivo. Sin embargo, si persisten la piel o la densidad periférica, utilice el protocolo de erosión y dilatación para eliminar estas regiones para el análisis de VOI. Antes de guardar, diríjase a herramientas externas y seleccione la casilla morfológica en el cuadro nuevo.Seleccione erosión seguida de. A continuación, regrese al cuadro de verificación morfológico, seleccione dilatación y acepte; verifique que se haya resuelto el problema de densidad periférica o de la piel y guarde los resultados. Utilice el paquete de software Volvo View versión 3.2 para crear visualizaciones renderizadas en 3D de las imágenes segmentadas.Comience por abrir el conjunto de datos de TC guardado en el formato analyze. Utilice la configuración predeterminada en la ventana emergente, luego abra el menú de complementos y en utilidades seleccione fusionar volúmenes. Desmarque la opción de reescalar componentes.Haga clic en asignar Segunda entrada. Elija los datos de grasa segmentada para la segunda entrada y utilice la configuración predeterminada en la ventana emergente. Luego, aplique el complemento para obtener una vista más amplia del ratón sujeto.Haga doble clic en la ventana de vista de volumen. Regrese a la pestaña de color/opacidad. El cuadro desplegable de componente indica qué conjunto de datos se está editando actualmente.En la parte inferior de la pestaña hay dos controles deslizantes. Estos determinan el brillo relativo de cada conjunto de datos dentro de la superposición, utilizando valores entre cero y uno. Para cambiar el color a escala de grises, por ejemplo, vaya a la sección de asignación de color escalar.Haga doble clic en uno de los controles deslizantes y arrástrelo fuera del cuadro. Agregue un segundo control deslizante haciendo clic en cualquier lugar dentro del área de los controles deslizantes. Haga que el control deslizante de color izquierdo sea negro y el control deslizante de color derecho sea blanco.A continuación, vaya al cuadro de mapeo de opacidad del escalar y cree un nuevo punto haciendo clic dentro del cuadro. Esto dará un total de tres puntos en la ventana para el punto central. Cambie el valor escalar a aproximadamente menos 3000 y cambie el valor de opacidad a cero.A la derecha de la ventana se encuentra el tercer punto; cambie su valor escalar a aproximadamente 32.000 y su opacidad a 0,25. El primer punto puede estar en cualquier lugar a la izquierda, siempre que el valor de opacidad esté establecido en cero. Con el ajuste escalar activado, cambie al componente dos, que debería modificar la apariencia de la grasa, y cambie cada control deslizante de color a rojo haciendo doble clic y moviendo el control deslizante de matiz H hasta el extremo.Esto colorea falsamente la grasa en rojo. Para crear una película de rotación de tres paneles que muestre la grasa en TC y la superposición, primero haga clic y arrastre el ratón sujeto a una posición vertical con la espalda orientada hacia arriba. En segundo lugar, en pesos de componente, establezca el valor del componente dos en cero para que solo se muestre la exploración de TC. Tercero, haga clic en revisar, seguido de cámara, y seleccione un número de cuadros para la película de rotación. Cuarto, cambie el valor de rotación en X a 360 grados.En quinto lugar, seleccione crear en el cuadro de diálogo emergente. Cree una nueva carpeta denominada CT y guarde el archivo en formato TIF, lo que generará una serie de imágenes de rotación. Repita estos pasos para la imagen de grasa, así como para la imagen de CT de grasa superpuesta, guardando sus imágenes de rotación en carpetas separadas. Para generar una película de rotación a partir de las imágenes resultantes, abra ImageJ e importe las secuencias de imágenes.Seleccione la primera imagen en la carpeta de TC y las demás se seleccionarán automáticamente. Repita este proceso para las secuencias de grasa y superposición con una de las pilas. Todavía abierta.Abra el administrador de ROI. Se encuentra en las herramientas de análisis y luego en el administrador de ROI; dibuje una ROI alrededor del ratón sujeto excluyendo píxeles de fondo innecesarios. Al completar, haga clic en agregar en el administrador de ROI.Luego, aplique la misma ROI a cada secuencia de imágenes. Cuando la ROI esté en todas las pilas, haga clic con el botón derecho. Dentro de la ROI, seleccione duplicar y elija. Verifique la pila duplicada.Esto separa la región de interés (ROI) del resto de la imagen. Ahora cierre las pilas de imágenes más grandes y repita este procedimiento para las tres secuencias de imágenes. Para combinar las pilas, utilice el comando combinar, que se encuentra bajo pilas y luego herramientas.Seleccione la pila de TC para la pila uno y la pila de grasa para la pila dos. Luego repita el proceso. Seleccione las pilas recién combinadas para la pila uno y la pila superpuesta para la pila dos.Esto completa la creación de una pila de rotación de imagen con tres paneles. Previsualice la pila seleccionando reproducir en la esquina inferior izquierda de la ventana de la imagen. Luego, guárdela como una película AVI.Se utilizaron ratones obesos B seis V LE OB J para ilustrar la viabilidad del sistema Alber CT. Para mediciones del contenido de grasa basadas en CT, se compararon con los tipos silvestres C 57 negro seis. A la izquierda se muestra el volumen total de CT de un ratón obeso.En el centro se muestra el volumen de grasa en rojo, y a la derecha aparece la superposición. Un análisis similar en animales de tipo salvaje muestra la diferencia sustancial en el contenido de grasa en comparación con el ratón obeso. Se calculó el volumen total, el volumen de grasa y las proporciones de volumen para cada animal.La proporción promedio de grasa respecto al volumen total para el grupo de tipo silvestre y el grupo obeso fue de 0,09 y 0,42, respectivamente. Estos valores difirieron significativamente con un valor de P de 0,001. Después de ver este video, se deberá tener una comprensión sólida de cómo segmentar los volúmenes de grasa dentro de un conjunto de datos de TC de un ratón vivo una vez dominado el procedimiento.Esta técnica debería llevar menos de 30 minutos realizarla. Gracias por vernos, y nos veremos la próxima vez.

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Investigación

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La segmentación y la medición de los volúmenes de grasa en modelos murinos de obesidad Usando rayos X de tomografía computarizada (Video) | JoVE Journal

La segmentación y la medición de los volúmenes de grasa en modelos murinos de obesidad Usando rayos X de tomografía computarizada

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