Disección y Cultura de ratón dopaminérgico estriatal en explantes y tridimensionales ensayos matriz de colágeno

El objetivo general de este procedimiento es cultivar dopaminérgicos y explantes de cuerpo estriado para estudiar el desarrollo de las vías mesoestriatales y estriatonigrales. Esto se logra primero mediante la microdiseción del cuerpo estriado y del mesencéfalo dopaminérgico de embriones de ratón E14.5. El segundo paso consiste en cortar explantes de tamaño adecuado a partir del tejido diseccionado.

A continuación, los explantes se posicionan dentro de un gel de colágeno en estrecha proximidad entre sí. El paso final consiste en cultivar estos explantes durante un período de dos a tres días para permitir el crecimiento de axones. En última instancia, se utiliza inmunohistoquímica para marcadores neuronales específicos con el fin de mostrar y cuantificar respuestas axónicas atractivas o repulsivas.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como los cultivos de explantes disociados o de dos DX, es que la matriz de colágeno proporciona un sustrato tridimensional para los exones que imita el entorno extracelular. Además, la matriz de colágeno permite la formación de gradientes relativamente estables de proteínas liberadas por explantes X o células colocadas en las proximidades. El procedimiento será demostrado por Ava Smith y Francesca, dos estudiantes de posgrado más de mi laboratorio.

Para comenzar este procedimiento, diseccionar los embriones de ratón E 14.5 del útero de la madre. Mantenerlos en medio L 15 sobre hielo hasta que sean necesarios. A continuación, transferir un embrión al microscopio e aislar el cerebro del embrión.

Luego, retire el cefalón cortando a lo largo de la parte medial de cada vesícula cefálica. Después, retire la vaina meníngea. Realice un corte dorsoventral justo craneal a la flexión cefálica media.

Posteriormente, realice otro corte dorsoventral justo caudal al flexor cefálico medio. A continuación, haga un corte caudal dorsal a lo largo de la línea media dorsal utilizando un cuchillo de microdisección para exponer el tejido subyacente del mesencéfalo ventral. Tenga cuidado de no dañar el tejido del mesencéfalo ventral, ya que contiene las neuronas dopaminérgicas.

A continuación, realice dos cortes de rost coddle laterales y paralelos a la línea media ventral para eliminar el tejido del mesencéfalo dorsal. Luego, divida el tejido restante del mesencéfalo ventral en X explantes utilizando un cuchillo de microdisección en el extremo del almacén. Mantenga los X explantes en medio L 15 que contenga 5 %FBS sobre hielo hasta su uso.

Ahora transfiera las vesículas tálamo-céfalas obtenidas previamente durante la disección del mesencéfalo al microscopio. Retire el tálamo cortando entre el tálamo y el satum utilizando un par de pinzas. A continuación, realice un corte medial lateral rostral al estriado para eliminar las estructuras rostrales, como el bulbo olfatorio.

A continuación, repita este paso para el tejido ubicado adyacente al estriado. Después de eso, coloque la sección restante para obtener una vista coronal del estriado. El estriado puede reconocerse como una parte del tejido ligeramente más transparente.

Luego aísle el estriado y córtelo en implantes utilizando un cuchillo de microdisección. Evite el tejido ligeramente más oscuro cercano a la línea media, que contiene neuronas migratorias de la eminencia ganglionar lateral y medial. Añada una gota de colágeno preparado sobre un cubreobjetos en la cavidad de una placa de cuatro pocillos.

Manténgalo en la incubadora a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante 30 minutos. Durante esta incubación, el colágeno se gelatinizará. Una vez que el colágeno se haya gelatinizado, utilice una pipeta con punta de 200 microlitros para transferir los explantes dopaminérgicos o sal a la matriz de colágeno.

Luego mueva los explantes uno junto al otro en proximidad cercana utilizando una aguja. Manténgalos separados a una distancia aproximada del diámetro de un x explante. A continuación, retire el medio en exceso.

Añada 20 microlitros del colágeno preparado encima del explante. Esto suele hacer que los explantes se muevan. Vuelva a colocar los explantes utilizando una aguja.

Deje solidificar el colágeno a temperatura ambiente durante 15 minutos. Luego, transfiéralo al incubador a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante 30 minutos. Una vez que el colágeno haya cuajado, agregue 400 microlitros de medio explante y deje crecer durante dos o tres días en el incubador a 37 grados Celsius.

Para fijar suavemente el explante, agregue paraformaldehído al 4 % y manténgalo a temperatura ambiente durante una hora. Después de una hora, lávelos con PBS a temperatura ambiente tres veces, cada vez durante 15 minutos.

Luego, tras eliminar el PBS, incubarlos en tampón bloqueante durante dos horas. A continuación, incubarlos durante la noche con el anticuerpo primario y el tampón bloqueante a cuatro grados Celsius al día siguiente. Lavarlos cinco veces en PBS a temperatura ambiente, cada vez durante una hora. Luego, incubarlos con el anticuerpo secundario conjugado con la flora adecuada.

Cuatro en tampón de bloqueo durante la noche a cuatro grados Celsius. A partir de este paso, cubra los explantes con papel de aluminio para minimizar su exposición a la luz. Lávelos durante la noche en PBS a cuatro grados Celsius, seguido de varios lavados al día siguiente.

A continuación, monte los explantes sobre el portaobjetos del microscopio utilizando un medio de montaje prolongado con reactivo antidesvanecimiento, con la cara del explante orientada hacia abajo. Coloque una laminilla sobre el medio de montaje muy suavemente para evitar atrapar aire debajo. Luego, obtenga imágenes digitales de los x explantes utilizando un microscopio de fluorescencia episcópica.

Utilizando estas imágenes, divida cada explante X en cuadrantes para generar un cuadrante proximal y un cuadrante distal. Después, mida la longitud de las 20 neuritas más largas que emergen del explante X, tanto en los cuadrantes proximales como distales. Utilice la longitud promedio de las 20 neuros más largas para calcular la razón proximal-distal para cada explante individual.

Una proporción proximal-distal mayor que uno indica atracción axonal, mientras que una proporción menor que uno indica repulsión axonal. Se muestra aquí un explante de mesencéfalo teñido con anticuerpo antihidroxilasa de tirosina que revela el crecimiento de axones.

La línea punteada indica los explantes adyacentes. Las flechas indican aquí neuritas individuales y conos de crecimiento. A continuación se muestra un ejemplo de cuantificación de la relación proximal-distal.

Se dividen en cuadrantes iguales. El cuadrante proximal está orientado hacia los explantes X adyacentes, mientras que el cuadrante distal está orientado en dirección opuesta a ellos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un co-cultivo de explantes dopaminérgicos y estratiales para investigar el desarrollo de la vía nigroestriatal y para estudiar los mecanismos moleculares implicados en la formación de estas vías.