En la transcripción in vitro y la nivelación de mRNA de luciferasa Gaussia Seguido por transfección de células HeLa

El objetivo general de este procedimiento es transfectar células hela con ARNm tapado y no tapado, transcripciones de gal luciferasa y analizar el cultivo celular para determinar la actividad de la luciferasa. Esto se logra utilizando primero el kit de síntesis de ARN de alto rendimiento T seven para sintetizar transcripciones de ARNm sin tapa y con tapa de Gaia luciferasa mediante transcripción in vitro. Se demuestran dos métodos para tapar el ARNm.

Uno utiliza un análogo de tapón durante la transcripción y el otro utiliza la enzima de tapado vaccinia para el taponamiento postranscripcional. El siguiente paso es transfectar las transcripciones de ARNm tapadas y no tapadas en células heli. En última instancia, la actividad de la luciferasa resultante del ARNm sin tapa o con tapa se compara en el cultivo de células heli con el nombre supernombrado.

La principal ventaja de este método sobre la configuración de su propia reacción de transcripción es que el kit de síntesis de ARN de alto rendimiento T seven ha sido probado y optimizado para producir transcripciones de ARN de alto rendimiento y, lo que es más importante, de alta calidad. Esto es extremadamente importante para el éxito de la traducción y expresión del ARN de la proteína funcionalmente activa. Por lo tanto, este método proporciona información sobre la transfección de ARN Los ARN transcritos in vitro también se pueden utilizar para otras aplicaciones, como el análisis de micromatrices por microinyección, las manchas basadas en hibridación y los estudios de estructura y función del ARN.

La plantilla de ADN para esta reacción de ejemplo es un plásmido linealizado que contiene la luciferasa gaussiana o el gen gluc. Con un promotor T seven, se sintetizarán tanto los productos con tapón como sin tapa. Comience por descongelar los componentes del kit de síntesis de ARN de alto rendimiento T seven y manténgalos en hielo.

Para evitar la contaminación por ARN, use guantes y limpie a fondo las pipetas de la superficie del banco y otros materiales. Configure la reacción a temperatura ambiente, comenzando con el tampón 10 x y el agua, seguido de los nucleótidos, la plantilla de ADN. Y por último, la mezcla de polimerasa.

El orden de adición de reactivos es importante para sintetizar el ARN tapado. Usando un análogo de tapa, haga una mezcla de reacción similar, pero agregue los nucleótidos del análogo de tapa. Después de agregar los nucleótidos estándar, ahora mezcle los componentes de la reacción mediante un vórtice suave, luego pulse, gire e incube las reacciones a 37 grados Celsius durante dos horas en una incubadora de aire seco mientras un control interno configura una segunda reacción para sintetizar transcripciones de cap de c Luke a partir de un plásmido linealizado C La expresión de Luke se utiliza para normalizar la expresión de gluc.

Después de la incubación, retire la plantilla de ADN de cada mezcla de reacción. Agregue 70 microlitros de agua libre de nucleasas, seguidos de 10 de ADN, un tampón de reacción y luego dos microlitros de ADN. Uno, permitir que los ADN reaccionen durante 15 minutos a 37 grados centígrados en una incubadora de aire seco.

Ahora purifique las reacciones utilizando cualquier kit de purificación de ARN basado en columna de espín y cuantifique el ARN utilizando un espectrofotómetro NanoDrop TM. Por último, evalúe la calidad de los ARN utilizando el bioanalizador Agilent RNA 6, 000 nano Kitt y Agilent 2100. Para una reacción de taponamiento estándar, agregue 10 microgramos del ARNm de gluc purificado sin tapar en 15 microlitros de agua libre de nucleasas.

Esto se puede ampliar en consecuencia. Caliente el ARN a 65 grados centígrados durante 10 minutos para interrumpir las estructuras secundarias y luego colóquelo en hielo durante cinco minutos. Para configurar la reacción de taponamiento, agregue tampón de taponamiento, GTP, metionina de caracol recién diluida y enzima de recubrimiento vaccinia al ARN desnaturalizado Suavemente en vórtice, los componentes de la reacción pulsan, giran e incuban la reacción a 37 grados centígrados durante 30 minutos en una incubadora de aire seco.

Después de la incubación, limpie y analice el ARN como se hizo al final de la sección anterior. Comience por colocar las células hela. En 28 pocillos de una placa de 48 pocillos, cada pocillo debe contener de 70 a 230.000 células y 150 microlitros de DMEM de alta glucosa suplementado con suero al 10%.

Incubar la placa a 37 grados centígrados hasta que las células estén entre un 60 y un 90% confluentes, lo que debería tardar entre 16 y 24 horas. Cuando las celdas estén listas, prepare las mezclas de transfección. Diluir el ARN a una concentración de 100 nanogramos por microlitro.

A continuación, configure 24 tubos de microcentrífuga para tres reacciones diferentes. Duplicado ocho veces a ocho tubos. Agregue un microlitro sin tapar en gluc RNA, un microlitro de ARN c luke tapado para la normalización y 25 microlitros de suero libre.

DMEM siempre mezcle bien usando una pipeta en los siguientes ocho tubos. Configure la misma reacción, pero en lugar del gluc sin tapa, ARN, agregue ARN gluc tapado preparado con análogo de tapa en los últimos ocho tubos. En lugar del ARN gluco preparado con un análogo de tapa, agregue el ARN gluc tapado de la reacción de vaccinia ahora en el primer conjunto de ocho tubos con una mezcla de ARN gluc sin tapa en un reactivo de refuerzo de ARNm de 0,2 microlitros, seguido de una mezcla de 0,2 microlitros.

El reactivo de ARNm de tránsito permite que las reacciones continúen a temperatura ambiente durante no más de cinco minutos. Dos minutos después de la reacción, comience a transferir cada mezcla gota a gota a un pocillo con células cultivadas. Repita este paso con los siguientes dos juegos de tubos que contienen tapa, gluc de tapa analógica, ARN y ARN gluc tapado de la reacción de vaccinia.

Deje cuatro pocillos como controles negativos, incube las células durante la noche a 37 grados centígrados en un ensayo de dióxido de carbono al 5%. El supra nombró utilizando el kit de ensayo Biox GIA Luciferasa para el ensayo Gluc. Prepare una solución de ensayo fresca añadiendo 15 microlitros de sustrato biox gluc a 1,5 mililitros de tampón de ensayo biox gluc.

No haga vórtices de la mezcla final. Mézclalo mediante inversiones de tubo para el ensayo CLU. Prepara 100 x sustrato recién reconstituido.

A continuación, prepare la solución de ensayo añadiendo 15 microlitros del sustrato reconstituido a 1,5 mililitros de tampón de ensayo de luciferasa Blu Ciena. Mezcle la solución de ensayo C Luke sin vórtice e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos lejos de la luz. Con las soluciones de ensayo preparadas.

Mida la luminiscencia de la célula utilizando un luminómetro de microplaca. Configure el luminómetro para inyectar 50 microlitros de solución de ensayo durante dos a 10 segundos. A continuación, transfiera 10 microlitros de cada supernombre de cultivo celular a un pocillo de una placa negra de 96

Prepare el inyector con la solución de ensayo y proceda a medir la luminiscencia. El kit de síntesis de ARN de alto rendimiento T seven puede producir hasta 180 microgramos de ARN sin tapar y de 40 a 50 microgramos de ARN tapado por reacción de 20 microlitros cuando se analiza en el bioanalizador Agilent 2100. Buena calidad intacta.

El ARN debe mostrar un solo pico agudo que representa la transcripción del ARN. Un pico amplio o varios picos indican degradación del ARN. También es importante verificar el tamaño del R-N-A-R-N-A.

Las transcripciones de una longitud más larga de lo esperado pueden deberse a una digestión incompleta del plásmido moltal, la degradación de D-N-A-R-N-A y un menor rendimiento suelen ser el resultado de contaminantes introducidos en la reacción desde el molde. La transfección del ADN fue seguida por la incubación y el ensayo de la actividad luciferasa. La estructura de cinco tapones primos es importante para proteger el ARN contra la degradación de la exonucleasa y para promover el inicio de la traducción.

Por lo tanto, el recubrimiento del ARN es un paso esencial para los experimentos de transfección. La diferencia en la luminiscencia medida entre los cultivos celulares transfectados con transcripciones tapadas y no tapadas apoya claramente esto, y también muestra que tanto las técnicas de taponamiento que utilizan el análogo de la tapa como las que utilizan la enzima de taponamiento vaccinia producen con éxito transcripciones funcionales de ARN con tapa. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión sobre cómo sintetizar transcripciones de ARN tapado de alta calidad para su uso en la transfección y otras aplicaciones diversas.