Criopreservación de espermatozoides de ratón y de recuperación con el I · Kit de Cryo
12 de diciembre de 2011
Aquí se demuestra que el nuevo desarrollo • Kit de Cryo para la criopreservación de espermatozoides de ratón. Dos células etapa de desarrollo del embrión con esperma congelado-descongelado se ha mejorado consistentemente en cinco cepas de ratón con el uso de este kit. Durante un período de 1,5 años, 49 líneas de ratones genéticamente modificados fueron archivados por la crioconservación de esperma con el I • Kit de Cryo y más tarde recuperado con éxito por fecundación in vitro.
El objetivo general de este procedimiento es criopreservar espermatozoides de ratón. Esto se logra primero recolectando espermatozoides de los EPI de ratón utilizando pajuelas para criopreservación. Luego, las pajuelas se congelan en nitrógeno líquido, donde se almacenan hasta que se recuperan descongelándolas en agua tibia.
Los espermatozoides recuperados de ratón se utilizan finalmente para la fertilización in vitro. La principal ventaja de este kit frente a los métodos existentes es que contiene todos los materiales necesarios para criopreservar y recuperar espermatozoides de ratón. Por lo general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades con el manejo y la carga de las pajuelas. Comience por armar 15 pajuelas de criopreservación de espermatozoides por línea de ratones que se vayan a criopreservar.
Primero, conecte cada pajilla de 0,25 mililitros a una jeringa de un mililitro con el tapón de algodón más cercano a la jeringa. Segundo, cargue ocho centímetros de medio de FIV en cada pajilla, seguidos de un centímetro de aire. Tercero, etiquete cada una de las 15 pajillas con el nombre de la línea que se va a preservar para cada línea que se va a criopreservar.
Llene un pocillo de una placa de cuatro pocillos con 240 microlitros de agente crioprotector. Sujete una pipeta de un mililitro al mango del recipiente de congelación para alargar el mango. Por último, llene la caja aislada de espuma proporcionada con el kit con 15 centímetros de nitrógeno líquido y cierre la tapa para eutanizar.
Dos ratones machos adultos fértiles. Para cada línea que se vaya a criopreservar, extraiga quirúrgicamente sus espermatozoides caudales. Coloque el ratón en posición dorsal y abra la pared corporal ventral.
Tire suavemente del conducto deferente y retire cualquier exceso de grasa. A continuación, localice el epidídimo y retírelo intacto junto con un pequeño fragmento del conducto deferente. Coloque los EPIs en un pocillo de la placa de cuatro pocillos preparada, cargada con CPA, bajo un microscopio estereoscópico.
Realice cinco a siete cortes longitudinales en cada epídimo. Luego, utilizando fórceps, presione suavemente cada diferencia rápida. Para expulsar los espermatozoides, incube la mezcla de CPA y epídimo a temperatura ambiente durante tres a cinco minutos.
Agite suavemente el recipiente a mano dos o tres veces durante la incubación. Esto permitirá que los espermatozoides salgan por aspiración. Cargue cada pajilla preparada con cinco milímetros de la suspensión de espermatozoides, seguido de un centímetro de aire.
Es importante para el proceso de congelación que todos los pajuelas se carguen de manera uniforme. Después de cargar las 15 pajuelas, selle cuidadosamente ambos extremos de cada pajuela mediante calor. Para garantizar la supervivencia de los espermatozoides, complete el procedimiento para las 15 pajuelas dentro de los 10 minutos.
Una vez que todos los pajuelos estén preparados, colóquelos en la columna de esperma del recipiente para congelación. Primero, coloque el recipiente en la caja de espuma y permita que flote verticalmente en el nitrógeno líquido. Durante 10 minutos, el recipiente debe flotar verticalmente, ya que de lo contrario se verá afectada la velocidad de congelación del esperma.
Luego sumerja el recipiente en nitrógeno líquido. De este modo, el esperma se criopreserva y queda listo para almacenamiento prolongado en nitrógeno líquido. Aproximadamente 60 horas antes de una recuperación planificada de esperma.
Siga el protocolo escrito para superovular hembras antes de la fecundación in vitro. Para cada pajilla que se vaya a descongelar, prepare y equilibre todos los medios durante al menos una hora a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Estos materiales incluyen una placa de Petri de 35 milímetros con una gota de 90 microlitros de medio de tratamiento de espermatozoides cubierta con aceite.
Un plato de Petri de 35 milímetros con tres mililitros de medio de FIV que servirá como plato de corte y, por cada cinco hembras superovuladas, prepare un plato de FIV, que consiste en un pozo de una placa de cuatro pozos cargada con 500 microlitros de medio de FIV. Para cada plato de FIV, prepare un plato de lavado, que es un plato de Petri de 35 milímetros con tres mililitros de KSOM, y un plato de cultivo de embriones, que es un plato de Petri de 35 milímetros con gotas de 50 microlitros de medio KSOM cubiertas con aceite. Una vez preparados todos los materiales necesarios, retire rápidamente una pajilla del almacenamiento y colóquela en un baño de agua a 37 grados Celsius durante dos a tres minutos.
Seque la pajilla. A continuación, realice un corte en ángulo en la columna de aire debajo del tapón de algodón. En el otro extremo de la pajilla, haga otro corte en ángulo sobre otra columna de aire.
Evite cortar la columna de espermatozoides. Ahora aspire la suspensión de espermatozoides desde el extremo de la pajilla utilizando una pipeta de 200 microlitros y deposítela en el centro del medio de tratamiento para espermatozoides. A continuación, incube la placa durante 45 a 60 minutos.
Durante la incubación del esperma, aísle los CU de las hembras superovuladas y transfiéralos al recipiente de disección. Utilice una aguja de calibre 30 o pinzas para romper cada oviducto y liberar los complejos cumulus-células ovocitarias. Transfiera los CC de cinco hembras a cada fecundación in vitro (IVF).
Bien, con una cantidad mínima de medio. Evite transferir grasa y sangre, ya que los medios contaminados inhiben la eficiencia de la fertilización. Después de la incubación, recoja de 10 a 15 microlitros de la suspensión de espermatozoides desde el perímetro de la gota de STM y deposite la suspensión en un procedimiento de FIV.
Ahora incube conjuntamente las células durante cuatro a seis horas para la fertilización. Después de la fertilización, pase los embriones a través de al menos 2 lavados con SOM en el recipiente de lavado. Luego, realice el cultivo.
Los embriones en KSOM hasta que se alcance la etapa de desarrollo deseada. Se congeló esperma de cinco cepas endogámicas de ratón Charles River. Las tasas de protección de la motilidad espermática y de la motilidad progresiva rápida oscilaron entre el 81 % y el 47 % en las cinco cepas procedentes de ese esperma.
Las tasas de FIV con espermatozoides descongelados variaron entre cepas, desde un 26 hasta un 88 % durante un período y medio año. Un total de 49 líneas de ratones GM fueron archivadas mediante criopreservación de espermatozoides y posteriormente recuperadas por FIV en cuatro cepas femeninas diferentes. C 57 negro seis BC DBA uno y 1 29 SV Una vez dominada la técnica de criopreservación de espermatozoides, esta puede realizarse en 30 minutos si se lleva a cabo adecuadamente.
Para este procedimiento, es importante verter hacia el recipiente verticalmente y con nitrógeno líquido.
Descripción general
Este estudio presenta el kit I•Cryo para la criopreservación eficaz de espermatozoides de ratón, demostrando un mejor desarrollo embrionario en múltiples cepas de ratón. El kit facilita el archivo de líneas de ratón modificadas genéticamente mediante la criopreservación del esperma y su posterior recuperación mediante fertilización in vitro (IVF).
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología Reproductiva
- Técnicas de Criopreservación
- Fecundación In Vitro (FIV)
Antecedentes
- La criopreservación de espermatozoides de ratón es fundamental para la investigación genética.
- Los métodos existentes pueden carecer de eficiencia y facilidad de uso.
- El kit I•Cryo tiene como objetivo simplificar el proceso de criopreservación.
- La recuperación exitosa de espermatozoides es esencial para los resultados de fertilización in vitro.
Objetivo del estudio
- Evaluar la eficacia del kit I•Cryo en la criopreservación de espermatozoides de ratón.
- Evaluar el impacto del esperma criopreservado en el desarrollo embrionario.
- Archivar líneas de ratón modificadas genéticamente para investigaciones futuras.
Métodos Utilizados
- Recolección de espermatozoides del epidídimo de ratón utilizando pajuelas para criopreservación.
- Congelación de espermatozoides en nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo.
- Descongelación de espermatozoides para su uso en procedimientos de FIV.
- Evaluación de la motilidad espermática y las tasas de éxito de FIV en diferentes cepas.
Resultados principales
- Mejor desarrollo embrionario observado en 5 cepas de ratón utilizando el kit I•Cryo.
- 49 líneas de ratón modificadas genéticamente archivadas y recuperadas con éxito.
- Las tasas de movilidad espermática variaron entre 81% y 47% según las cepas.
- Las tasas de FIV variaron entre 26% y 88% con espermatozoides congelados y descongelados.
Conclusiones
- El kit I•Cryo mejora significativamente la eficiencia de la criopreservación del esperma.
- La recuperación exitosa de líneas modificadas genéticamente respalda su utilidad en la investigación.
- Una mayor optimización del método puede reducir el tiempo de procesamiento.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La criopreservación de espermatozoides de ratón ofrece una solución rentable y escalable para archivar cepas modificadas genéticamente, reduciendo la dependencia de colonias vivas de animales y mitigando los riesgos de pérdida de líneas. El kit I•Cryo mejora la confianza predictiva en la preservación de cepas al aumentar la motilidad espermática post-descongelación y el desarrollo embrionario derivado de fertilización in vitro en múltiples fondos consanguíneos. Esto apoya la gestión estratégica de carteras en investigación preclínica al permitir el almacenamiento a largo plazo confiable y la recuperación bajo demanda de modelos valiosos de enfermedades.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la validación funcional de modelos genéticos al garantizar la recuperación de espermatozoides para cribado fenotípico basado en FIV.
- Valor operativo: Reduce la carga de manejo animal y los costos asociados con el mantenimiento de colonias vivas de modelos de bajo rendimiento o inducibles.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Proporciona una fuente estandarizada de espermatozoides para ensayos de FIV consistentes, apoyando la evaluación reproducible de los efectos de compuestos en la fertilización y el desarrollo embrionario temprano.
- Valor operativo: Facilita la disponibilidad del ensayo mediante espermatozoides criobancarizados, eliminando la variabilidad debida a diferencias entre machos o entre lotes en la recolección de muestras frescas.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Mantiene la integridad genética de los modelos de enfermedad a lo largo del tiempo, lo que permite estudios longitudinales y continuidad experimental entre generaciones.
- Valor operativo: Facilita la colaboración entre múltiples centros al permitir la distribución de espermatozoides criopreservados en lugar de animales vivos, reduciendo la complejidad del transporte y las preocupaciones de bioseguridad.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en el flujo de trabajo de descubrimiento desde la generación temprana del modelo hasta la validación preclínica, sirviendo como un puente entre la ingeniería genética y la fenotipificación funcional mediante FIV.
- Biología de Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis al permitir la recuperación de espermatozoides criopreservados para fertilización in vitro (FIV), lo que posibilita evaluar los efectos de las modificaciones genéticas sobre la fertilidad y la embriogénesis temprana.
- Selección: Permite ensayos estandarizados basados en FIV utilizando espermatozoides descongelados, mejorando la reproducibilidad al evaluar la función espermática, la capacitación y la capacidad de fertilización.
- Análisis: Genera mediciones cuantitativas como el porcentaje de motilidad progresiva, la motilidad progresiva rápida y las tasas de desarrollo embrionario, que ayudan a tomar decisiones de continuidad o descarte respecto a la estabilidad del modelo.
- Investigación Traslacional: Conecta la modificación genética con los resultados del desarrollo al permitir la FIV con espermatozoides criopreservados, facilitando la selección fenotípica vinculada a biomarcadores en embriones en etapa preimplantacional.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma de criobanco reutilizable para el archivo y recuperación continuos de líneas modificadas genéticamente, reduciendo los esfuerzos redundantes de rederivación en distintos proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la conservación del modelo al demostrar una mayor motilidad y desarrollo embrionario en comparación con los métodos básicos de CPA.
- Valor operativo: Estandariza el procedimiento de criopreservación mediante componentes basados en kits, reduciendo la variabilidad del usuario y el tiempo de entrenamiento.
- Valor estratégico: Disminuye los costos a largo plazo del mantenimiento de cepas y reduce el riesgo de pérdida irreversible de líneas debido a fallos reproductivos, deriva genética o brotes de patógenos.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de líneas GM para su archivado según su valor estratégico, con confianza en su recuperación futura.
Consideraciones de Implementación
- Requiere competencia técnica en la recolección de espermatozoides, manipulación de pajillas y sellado térmico para garantizar la integridad de la muestra.
- Depende del acceso a almacenamiento en nitrógeno líquido y equipo de descongelación controlada (baño de agua a 37 °C) para un rendimiento post-descongelación consistente.
- Necesita medios de fertilización in vitro (FIV) estandarizados y protocolos de superovulación para obtener resultados fiables en la fertilización y el cultivo de embriones.
- El rendimiento puede variar según los fondos genéticos, lo que requiere una optimización específica de las cepas en los pasos de incubación y lavado.
- Está limitado por la necesidad de hembras fértiles y experiencia en FIV para la recuperación de espermatozoides, lo que restringe su aplicación directa a ensayos basados en apareamiento natural.
