Name: Criopreservación de espermatozoides de ratón y de recuperación con el I · Kit de Cryo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Aprende a criopreservar espermatozoides de ratón con el kit I•Cryo para biología reproductiva. Este método permite archivar líneas genéticamente modificadas mediante congelación en nitrógeno líquido y recuperación por FIV.

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La investigación presentada aquí fue apoyado por Charles River. Los autores están muy agradecidos a los modelos obtenidos mediante ingeniería genética y el grupo de servicios y el personal de Embriología de cuidado de los animales y la inyección de la hormona.

1. Criopreservación de espermatozoides de ratón <ol><li> Para cada línea para ser criopreservados, prepare lo siguiente antes de comenzar. <ol><li> Un pozo de una placa de cuatro pocillos con 240 l de kit de CPA </li><li> 15 pajuelas de criopreservación de espermatozoides de la siguiente manera <ol><li> Conecte el pajuelas de 0,25 ml a las jeringas de 1 ml con tapón de algodón cercano a la jeringa. En cada uno de paja, carga de 8 cm (aproximadamente 160 l) de medio de fertilización in vitro, y luego de 1 cm de aire. Etiqueta de la paja con el nombre de la línea para ser preservado. </li></ol></li></ol></li><li> LN 2 debe ser de 15 cm de profundidad en el cuadro de espuma. Cierre la tapa. </li><li> La eutanasia a dos ratones machos de cada línea para ser criopreservados. Los ratones deben ser entre 10 y 60 semanas. Retire los dos epidídimos caudal, junto con el conducto deferente de cada ratón. </li><li> Coloque el epidídimo en el CPA previamente preparado que contiene los pocillos de una placa de 4 pocillos (paso 1.1). </li><li> Hacer 5-7 cortes longitudinales en cada epidídimo y suavementeApriete cada conducto deferente para empujar el esperma hacia fuera. </li><li> Agite la mezcla de CPA y el epidídimo con la mano suavemente a temperatura ambiente durante 3-5 minutos. Esto permitirá a los espermatozoides a nadar. </li><li> Utilizando la paja previamente preparado, aspirar 5 mm (aproximadamente 10 l) de suspensión de esperma y luego de 1 cm de aire. </li><li> Repita este proceso con hasta un total de 15 pajillas. De carga y el sello paja a los 10 minutos para la supervivencia mejores espermatozoides. </li><li> Termosellado ambos lados de la paja con cuidado. Coloque la paja en el recipiente de congelación con la columna de los espermatozoides en primer lugar. </li><li> Coloque la pipeta de 1 ml proporciona como parte del kit de la lata para extender el mango. Coloque el recipiente en LN 2 en el cuadro de espuma a través del agujero en la tapa. Deje que el frasco para flotar verticalmente en la LN 2 durante 10 minutos. </li><li> Sumergir el recipiente en el LN2. Los espermatozoides criopreservados y ahora se puede mover a largo plazo de almacenamiento de LN 2. </li><li> El envase no debe ser utilizado parala siguiente línea hasta que se calienta hasta la temperatura ambiente. </li></ol> 2. Ratón superovulación <ol><li> En general, el uso de ratones hembra jóvenes el mismo fondo que los donantes de esperma. </li><li> Los ratones deben ser ~ 12 g (3-4 semanas de edad). </li><li> Realizar una inyección intraperitoneal con IU 5.10 de embarazadas gonadotropina de suero de yegua (PMSG). </li><li> Espere 46 a 48 horas. </li><li> Realizar una inyección intraperitoneal con IU 5.10 de la gonadotropina coriónica humana (hCG). </li><li> Los ovocitos de la cosecha 14-16 h después de la inyección de hCG como se describe a continuación. </li></ol> 3. Ratón de recuperación de espermatozoides y fecundación in vitro <ol><li> Antes de la FIV, para cada uno de paja para ser descongelado, preparar la siguiente y equilibrar durante al menos una hora en un 37 ° C incubadora de CO 2. <ol><li> Espermatozoides plato de incubación: una placa de Petri de 35 mm, con una caída de 90 l de medio de tratamiento de esperma (STM) cubierto con aceite. </li><li> Corte de plato: Para la recogida de ovocitos de un máximo de 10 superovulated mujeres, una de 35 mm placa de Petri con 3 ml de medio de fertilización in vitro. </li><li> Fecundación in vitro, así: Para cada grupo de 5 mujeres superovuladas para la FIV, un pocillo de una placa de 4 y con 500 l de medio de FIV (si está utilizando 10 hembras superovuladas, por ejemplo, se necesitan 2 pozos...) </li><li> Lavar los platos: una placa de Petri de 35 mm con 3 ml de potasio simple medio optimizado (KSOM) para el lavado de cada pocillo de la placa de FIV 4-bien utilizado </li><li> Placa de cultivo: una placa de Petri de 35 mm con 50 gotas l de medio KSOM cubiertos con aceite para el cultivo de embriones de cada pocillo de la placa de la FIV. </li></ol></li><li> Eliminar una paja de LN 2 y colóquelo en un baño de agua 37 º C durante 2-3 minutos. </li><li> Quitar la paja del baño de agua y limpiar para eliminar el exceso de agua. Haga el primer corte cerca de la primera columna de aire más cercano al tapón de algodón. Cortar la paja en el medio de FIV seguirá habiendo una columna de aire visible antes de la columna de los espermatozoides. </li><li> A continuación, corte el extremo de la paja en el segunda columna de aire, teniendo cuidado de evitar el corte de la columna de los espermatozoides. Corte en un ángulo de 45 - esto hará que sea mucho más fácil para aspirar a los espermatozoides. </li><li> Aspirar la suspensión de esperma desde el extremo distal de la paja con una pipeta 200 microlitros. </li><li> Lugar la suspensión de esperma en el centro de la caída de STM y se incuba la placa durante 45-60 minutos en un 37 ° C al 5% de CO 2 incubadora. </li><li> Durante la incubación de espermatozoides, diseccionar los oviductos de las hembras superovuladas en el plato de corte. Use una aguja de 30 g o fórceps para rasgar cada oviducto, la liberación de los complejos cumulus-ovocito (COC). Evite la grasa y la sangre en el medio de la FIV como sucio para los medios de comunicación hace que el lavado de medidas adicionales. </li><li> Una vez que todos los oviductos se han roto, la transferencia de los anticonceptivos orales combinados de cinco mujeres de cada pozos de fecundación in vitro. El número de AOC producidos por superovulación es muy dependiente de la cepa. </li><li> Recoger 10-15 l de esperma de la periferia de la caída de STM y abonar una fecundación in vitro y aproximadamente 14-16 horas después de la hCG injexión. Repita la fertilización para cada bien utilizado. La concentración de esperma final será de aproximadamente 1 millón / ml. </li><li> Cocultivo de espermatozoides y ovocitos durante 4-6 horas en un 37 ° C 5% de CO 2 incubadora. </li><li> Lavado de los embriones con KSOM un mínimo de 2 veces y la cultura en forma de gotas KSOM para el desarrollo en un 37 ° C 5% de CO 2 incubadora. </li><li> Tasa de fecundación in vitro se ha calculado como dos embriones de células etapa de total de ovocitos utilizados después de la cultura durante la noche. </li></ol> 4. Resultados representante El esperma de 5 cepas puras ratón Charles River se congeló. Las relaciones de protección se calcula dividiendo los valores de evaluación de los espermatozoides congelados en fresco valores de esperma de evaluación. Relaciones de protección de la motilidad de los espermatozoides fueron 60,2%, 81,3%, 78,6%, 66,5%, 61,0% para C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl y BALB / cAnNCrl, respectivamente. Relaciones de protección para la motilidad progresiva rápida fueron 47,3%, 69,4%, 57,0%, 52,8%, 54,1% en C57BL/6NCrl, 129S2/SvPas<html> Crl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl y BALB / cAnNCrl, respectivamente (Fig. 1). Las tasas de fecundación in vitro con esperma congelado-descongelado fueron el 55,7%, 26,4%, 87,3%, 87,8% y 26,2% en C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl y BALB / cAnNCrl, respectivamente (Fig. 2) . Durante un período de 1,5 años, 49 líneas de ratones transgénicos fueron archivados por la crioconservación de esperma. Estas líneas fueron más tarde recuperados con éxito (según la definición de los cachorros nacidos vivos) por fecundación in vitro en 4 cepas de mujeres (C57BL / 6, BALB / c, DBA / 1 y 129Sv) (Fig. 3). <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3713/3713fig1.jpg" /> Figura 1. Las relaciones de protección de la motilidad espermática y la motilidad progresiva rápida en los ratones <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3713/3713fig2.jpg" /> Figura 2. Fertilización in vitro con semen congelado-descongelado en ratones 3713fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. Fecundación in vitro con espermatozoides congelados-descongelados en ratones modificados genéticamente

<ol><li>Tada, N., Sato, M., Yamanoi, J., Mizorogi, T., Kasai, K., Ogawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+mouse+spermatozoa+in+the+presence+of+raffinose+and+glycerol%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Fertil%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of mouse spermatozoa in the presence of raffinose and glycerol.</a> J. Reprod. Fertil. 89, 511-516 (1990).</li>
<li>Yokoyama, M., Akiba, H., Katsuki, M., Nomura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+normal+young+following+transfer+of+mouse+embryos+obtained+by+in+vitro+fertilization+using+cryopreserved+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Jikken+Dobutsu%22%5BJournal%5D)">Production of normal young following transfer of mouse embryos obtained by in vitro fertilization using cryopreserved spermatozoa.</a> Jikken Dobutsu. 39, 125-128 (1990).</li>
<li>Sztein, J. M., Farley, J. S., Young, A. F., Mobraaten, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motility+of+cryopreserved+mouse+spermatozoa+affected+by+temperature+of+collection+and+rate+of+thawing%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Motility of cryopreserved mouse spermatozoa affected by temperature of collection and rate of thawing.</a> Cryobiology. 35, 46-52 (1997).</li>
<li>Thornton, C. E., Brown, S. D., Glenister, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+numbers+of+mice+established+by+in+vitro+fertilization+with+cryopreserved+spermatozoa%3A+implications+and+applications+for+genetic+resource+banks%2C+mutagenesis+screens%2C+and+mouse+backcrosses%5BTitle%5D)+AND+%22Mamm.+Genome%22%5BJournal%5D)">Large numbers of mice established by in vitro fertilization with cryopreserved spermatozoa: implications and applications for genetic resource banks, mutagenesis screens, and mouse backcrosses.</a> Mamm. Genome. 10, 987-992 (1999).</li>
<li>Sztein, J. M., Farley, J. S., Mobraaten, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+fertilization+with+cryopreserved+inbred+mouse+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">In vitro fertilization with cryopreserved inbred mouse sperm.</a> Biol. Reprod. 63, 1774-1780 (2000).</li>
<li>Liu, L., Nutter, L. M., Law, N., McKerlie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+freezing+and+in+vitro+fertilization+in+three+substrains+of+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Assoc.+Lab.+Anim.+Sci%22%5BJournal%5D)">Sperm freezing and in vitro fertilization in three substrains of C57BL/6 mice.</a> J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48, 39-43 (2009).</li>
<li>Nakagata, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+mouse+spermatozoa+and+in+vitro+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization.</a> Methods. Mol. Biol. 693, 57-73 (2011).</li>
<li>Mazur, P., Koshimoto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+intracellular+ice+formation+the+cause+of+death+of+mouse+sperm+frozen+at+high+cooling+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Is intracellular ice formation the cause of death of mouse sperm frozen at high cooling rates.</a> Biol. Reprod. 66, 1485-1490 (2002).</li>
<li>Jin, B., Yamasaki, C., Yamada, N., Seki, S., Valdez, D. M., Kasai, M., Edashige, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+by+which+mouse+spermatozoa+are+injured+during+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">The mechanism by which mouse spermatozoa are injured during freezing.</a> J. Reprod. Dev. 54, 265-269 (2008).</li>
<li>Visconti, P. E., Westbrook, V. A., Chertihin, O., Demarco, I., Sleight, S., Diekman, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+signaling+pathways+involved+in+sperm+acquisition+of+fertilizing+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Novel signaling pathways involved in sperm acquisition of fertilizing capacity.</a> J. Reprod. Immunol. 53, 133-150 (2002).</li>
<li>Ostermeier, G. C., Wiles, M. V., Farley, J. S., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserving%2C+distributing+and+managing+genetically+modified+mouse+lines+by+sperm+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Conserving, distributing and managing genetically modified mouse lines by sperm cryopreservation.</a> PLoS ONE. 3, e2792-e2792 (2008).</li>
</ol>

Los autores son empleados de Charles River, el fabricante de este equipo.

Desde 1990, el Protocolo de congelar el semen básico con 18% de rafinosa y 3% de leche desnatada se ha demostrado su fiabilidad en muchas cepas de ratones y un gran número de líneas de ratón han sido criopreservados 1,2,3,4,5,6,7. Las principales causas de daño a las células de esperma durante el proceso de congelación y descongelación se han asociado con la formación de hielo 8,9 y especies reactivas de oxígeno 10. La suplementación con atrapadores de radicales libres, tales como los aminoácidos, y agentes reductores, como monotioglicerol, en el medio de congelación fue investigado y probado para incrementar sustancialmente la tasa de FIV con espermatozoides congelados-descongelados en las cepas puras como los C57BL / 6 11,6. En el presente Protocolo, se desarrolló un nuevo I • Cryo kit para la criopreservación de espermatozoides de ratón mediante la optimización de la CPA básicos disponibles en el mercado con los antioxidantes y los bloqueadores de hielo y modificando la congelación de espermatozoides y la fecundación in vitro. Relaciones de protección de la motilidad de los espermatozoides(&gt; 60%) y la motilidad progresiva rápida (&gt; 45%) se observó que los espermatozoides de cinco cepas de ratones endogámicos congelados con el I • Kit de Cryo. El 2 de células embrión en su fase de desarrollo con tasa de espermatozoides congelados-descongelados en cinco cepas de ratones endogámicos se mejoró notablemente en comparación con el que, con base CPA 11,6. En el uso del kit, el usuario crea una suspensión de esperma concentrado por congelar el semen de dos machos por cada línea. Sólo por congelación 15 pajillas el proceso es rápido, sencillo y ocupa menos espacio de almacenamiento para el almacenamiento de corto o largo plazo. Mayoría de las veces, las líneas de ratón pueden ser recuperados por la descongelación sólo 1 o 2 popotes.

<table><tbody><tr><td>CPA</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Incluido en el kit</td></tr><tr><td>STM</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Incluido en el kit</td></tr><tr><td>Medio IVF</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Incluido en el kit</td></tr><tr><td>Pajilla plástica de 0,25 ml</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Incluido en el kit</td></tr><tr><td>Recipiente para congelación de espermatozoides</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Incluido en el kit</td></tr><tr><td>Caña y copa</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Incluido en el kit</td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5310</td><td>Debe estar probado para embriones</td></tr><tr><td>Medio KSOM</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-106-D</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de 35 mm</td><td>Falcon BD</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Sellador térmico</td><td>ABTEC</td><td>TISH-200</td><td></td></tr><tr><td>Placa multidosis de 4 pocillos</td><td>Nalge Nunc international</td><td>73521-424</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Gilson, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora a 37&amp;#x00B0;C + 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de almacenamiento en LN&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua a 37&amp;#x00B0;C</td><td>VWR international</td><td>89032-196</td><td></td></tr><tr><td>Steromicroscopio</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>hCG</td><td>Intervet Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td>EMD Millipore</td><td>367222</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 1 cc con aguja de 26G 3/8</td><td>BD Biosciences</td><td>BD309625</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras microquirúrgicas</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5602</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de 30 gauge &amp;frac12;</td><td>BD Biosciences</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-6802</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5135, RS-5110, RS-5005</td><td></td></tr></tbody></table>

criopreservación de espermatozoides de ratón y de recuperación con el i · kit de cryo

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Miles de nuevos genéticamente modificados (GM) de las cepas de ratones han sido creados desde el advenimiento de las tecnologías de la transgénesis y el golpe de gracia. Muchos de estos valiosos animales sólo existen como animales vivos, sin un plan de copia de seguridad en caso de emergencia. La criopreservación de embriones puede ofrecer esta copia de seguridad, pero es costoso, puede ser un procedimiento prolongado y generalmente requiere de un gran número de animales para el éxito. Desde el descubrimiento de que los espermatozoides de ratón pueden ser criopreservados con éxito con un agente crioprotector básicos (CPA) que consiste de 18% de rafinosa y 3% de leche desnatada, la criopreservación de espermatozoides se ha convertido en un procedimiento aceptable y rentable para el almacenamiento, distribución y recuperación de estas cepas valiosas . Aquí se demuestra un nuevo desarrollo de I • Kit de Cryo para la criopreservación de espermatozoides de ratón. El esperma de cinco cepas de uso común de los ratones consanguíneos fueron congelados con este kit y luego se recuperó. Mayores relaciones de protección de la motilidad espermática (&gt;60%) y la motilidad progresiva rápida (&gt; 45%) en comparación con el control (básica CPA) se observó que los espermatozoides congelados con este kit de cinco cepas de ratones endogámicos. Dos etapas de desarrollo de las células de embriones después de la fecundación in vitro con el esperma recuperado se ha mejorado consistentemente en todas las cinco cepas de ratones examinados. Durante un período de 1,5 años, 49 líneas de ratones transgénicos fueron archivados por la crioconservación de esperma con el I • Kit de Cryo y más tarde recuperado por fecundación in vitro.

Aquí se demuestra que el nuevo desarrollo • Kit de Cryo para la criopreservación de espermatozoides de ratón. Dos células etapa de desarrollo del embrión con esperma congelado-descongelado se ha mejorado consistentemente en cinco cepas de ratón con el uso de este kit. Durante un período de 1,5 años, 49 líneas de ratones genéticamente modificados fueron archivados por la crioconservación de esperma con el I • Kit de Cryo y más tarde recuperado con éxito por fecundación in vitro.

Criopreservación de espermatozoides de ratón y de recuperación con el I · Kit de Cryo

Se han creado miles de nuevas cepas de ratones genéticamente modificados (GM) desde la aparición de las tecnologías de transgénesis y de knockout. Muchas de estas...

El objetivo general de este procedimiento es criopreservar espermatozoides de ratón. Esto se logra primero recolectando espermatozoides de los EPI de ratón utilizando pajuelas para criopreservación. Luego, las pajuelas se congelan en nitrógeno líquido, donde se almacenan hasta que se recuperan descongelándolas en agua tibia.Los espermatozoides recuperados de ratón se utilizan finalmente para la fertilización in vitro. La principal ventaja de este kit frente a los métodos existentes es que contiene todos los materiales necesarios para criopreservar y recuperar espermatozoides de ratón. Por lo general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades con el manejo y la carga de las pajuelas. Comience por armar 15 pajuelas de criopreservación de espermatozoides por línea de ratones que se vayan a criopreservar.Primero, conecte cada pajilla de 0,25 mililitros a una jeringa de un mililitro con el tapón de algodón más cercano a la jeringa. Segundo, cargue ocho centímetros de medio de FIV en cada pajilla, seguidos de un centímetro de aire. Tercero, etiquete cada una de las 15 pajillas con el nombre de la línea que se va a preservar para cada línea que se va a criopreservar.Llene un pocillo de una placa de cuatro pocillos con 240 microlitros de agente crioprotector. Sujete una pipeta de un mililitro al mango del recipiente de congelación para alargar el mango. Por último, llene la caja aislada de espuma proporcionada con el kit con 15 centímetros de nitrógeno líquido y cierre la tapa para eutanizar.Dos ratones machos adultos fértiles. Para cada línea que se vaya a criopreservar, extraiga quirúrgicamente sus espermatozoides caudales. Coloque el ratón en posición dorsal y abra la pared corporal ventral.Tire suavemente del conducto deferente y retire cualquier exceso de grasa. A continuación, localice el epidídimo y retírelo intacto junto con un pequeño fragmento del conducto deferente. Coloque los EPIs en un pocillo de la placa de cuatro pocillos preparada, cargada con CPA, bajo un microscopio estereoscópico.Realice cinco a siete cortes longitudinales en cada epídimo. Luego, utilizando fórceps, presione suavemente cada diferencia rápida. Para expulsar los espermatozoides, incube la mezcla de CPA y epídimo a temperatura ambiente durante tres a cinco minutos.Agite suavemente el recipiente a mano dos o tres veces durante la incubación. Esto permitirá que los espermatozoides salgan por aspiración. Cargue cada pajilla preparada con cinco milímetros de la suspensión de espermatozoides, seguido de un centímetro de aire.Es importante para el proceso de congelación que todos los pajuelas se carguen de manera uniforme. Después de cargar las 15 pajuelas, selle cuidadosamente ambos extremos de cada pajuela mediante calor. Para garantizar la supervivencia de los espermatozoides, complete el procedimiento para las 15 pajuelas dentro de los 10 minutos.Una vez que todos los pajuelos estén preparados, colóquelos en la columna de esperma del recipiente para congelación. Primero, coloque el recipiente en la caja de espuma y permita que flote verticalmente en el nitrógeno líquido. Durante 10 minutos, el recipiente debe flotar verticalmente, ya que de lo contrario se verá afectada la velocidad de congelación del esperma.Luego sumerja el recipiente en nitrógeno líquido. De este modo, el esperma se criopreserva y queda listo para almacenamiento prolongado en nitrógeno líquido. Aproximadamente 60 horas antes de una recuperación planificada de esperma.Siga el protocolo escrito para superovular hembras antes de la fecundación in vitro. Para cada pajilla que se vaya a descongelar, prepare y equilibre todos los medios durante al menos una hora a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Estos materiales incluyen una placa de Petri de 35 milímetros con una gota de 90 microlitros de medio de tratamiento de espermatozoides cubierta con aceite.Un plato de Petri de 35 milímetros con tres mililitros de medio de FIV que servirá como plato de corte y, por cada cinco hembras superovuladas, prepare un plato de FIV, que consiste en un pozo de una placa de cuatro pozos cargada con 500 microlitros de medio de FIV. Para cada plato de FIV, prepare un plato de lavado, que es un plato de Petri de 35 milímetros con tres mililitros de KSOM, y un plato de cultivo de embriones, que es un plato de Petri de 35 milímetros con gotas de 50 microlitros de medio KSOM cubiertas con aceite. Una vez preparados todos los materiales necesarios, retire rápidamente una pajilla del almacenamiento y colóquela en un baño de agua a 37 grados Celsius durante dos a tres minutos.Seque la pajilla. A continuación, realice un corte en ángulo en la columna de aire debajo del tapón de algodón. En el otro extremo de la pajilla, haga otro corte en ángulo sobre otra columna de aire.Evite cortar la columna de espermatozoides. Ahora aspire la suspensión de espermatozoides desde el extremo de la pajilla utilizando una pipeta de 200 microlitros y deposítela en el centro del medio de tratamiento para espermatozoides. A continuación, incube la placa durante 45 a 60 minutos.Durante la incubación del esperma, aísle los CU de las hembras superovuladas y transfiéralos al recipiente de disección. Utilice una aguja de calibre 30 o pinzas para romper cada oviducto y liberar los complejos cumulus-células ovocitarias. Transfiera los CC de cinco hembras a cada fecundación in vitro (IVF).Bien, con una cantidad mínima de medio. Evite transferir grasa y sangre, ya que los medios contaminados inhiben la eficiencia de la fertilización. Después de la incubación, recoja de 10 a 15 microlitros de la suspensión de espermatozoides desde el perímetro de la gota de STM y deposite la suspensión en un procedimiento de FIV.Ahora incube conjuntamente las células durante cuatro a seis horas para la fertilización. Después de la fertilización, pase los embriones a través de al menos 2 lavados con SOM en el recipiente de lavado. Luego, realice el cultivo.Los embriones en KSOM hasta que se alcance la etapa de desarrollo deseada. Se congeló esperma de cinco cepas endogámicas de ratón Charles River. Las tasas de protección de la motilidad espermática y de la motilidad progresiva rápida oscilaron entre el 81 % y el 47 % en las cinco cepas procedentes de ese esperma.Las tasas de FIV con espermatozoides descongelados variaron entre cepas, desde un 26 hasta un 88 % durante un período y medio año. Un total de 49 líneas de ratones GM fueron archivadas mediante criopreservación de espermatozoides y posteriormente recuperadas por FIV en cuatro cepas femeninas diferentes. C 57 negro seis BC DBA uno y 1 29 SV Una vez dominada la técnica de criopreservación de espermatozoides, esta puede realizarse en 30 minutos si se lleva a cabo adecuadamente.Para este procedimiento, es importante verter hacia el recipiente verticalmente y con nitrógeno líquido.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

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Recolección y criopreservación de ovocitos de hámster y de embriones de ratón

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Un etilenglicol basado en el método de vitrificación de embriones de ratón se describe. Es conveniente que otros métodos en su simplicidad y la toxicidad embrionaria bajo, y por lo tanto se puede aplicar ampliamente a muchas cepas de ratones, incluyendo ratones endogámicos y el gen modificado.

La criopreservación de embriones de ratón por el etileno a base de glicol vitrificación

El enfoque comparativo permite neurocientíficos especie de comportamiento para explorar diversos factores neurobiológicos asociados con comportamientos específicos vistos como característica de un modelo animal específico. Aprovechando naturales diferencias de comportamiento entre especies estrechamente relacionadas, esta técnica no requiere técnicas invasivas para manipular la expresión de la conducta.

Con un enfoque comparativo de especies para la Investigación de Neurobiología de las respuestas Paternal

En este video, demostramos un método de criovitrificación ultrarrápido para preservar muestras biológicas. El método implica el uso de una combinación de crioprotectores para proteger el tejido biológico del daño por congelación al prevenir la formación de cristales de hielo intracelular.

Criopreservación basada en vitrificación: una técnica de enfriamiento ultrarrápido para preservar muestras biológicas a temperaturas muy bajas para su almacenamiento a largo plazo

MicroSecure Vitrification se desarrolló como un sistema de dispositivo de vitrificación cerrado aséptico y no comercial que cumple con las buenas prácticas de fabricación y manipulación de tejidos de la FDA. Debido a la retirada de las pajuelas de embriones hidrofóbicas de la industria, el procedimiento de vitrificación se modificó para incluir un sello interior antes del tapón interno de algodón estándar.

La vitrificación modificada MicroSecure: Un procedimiento altamente seguro, simple y eficaces de crioconservación de blastocistos humanos

El objetivo principal de este estudio fue adaptar la aguja inmerso en procedimiento de vitrificación (NIV) para criopreservar los testículos todo pez cebra. Además, se evaluó la repetibilidad del método en cinco cepas diferentes de pez cebra.

Criopreservación de espermatogonios de pez cebra por todo los testículos aguja inmerso enfriamiento ultra rápido

Protocolos de criopreservación de maduración y esperma de anguila europea han sido mejorados en los últimos años. Este artículo describe el protocolo mejor disponible con gonadotropina coriónica humana (hCG) para inducir la maduración y metanol como crioprotector.

Manejo y tratamiento del hombre europeo anguilas (Anguilla anguilla) de maduración Hormonal y criopreservación de esperma

Aquí, presentamos un método modificado para la criopreservación de embriones unicelulares, así como un protocolo que combina el uso de embriones de congelación descongelado y electroporación para la generación eficiente de ratones modificados genéticamente.

Uso de embriones congelados descongelados para la producción de alta eficiencia de ratones modificados genéticamente

Este protocolo describe una vía semiautomatizada para mejorar la eficiencia y la capacidad de procesamiento y criopreservación de esperma de especies de coral amenazadas, con el objetivo de asegurar la diversidad genética y apoyar los esfuerzos de restauración de los arrecifes.

Un flujo de trabajo semiautomatizado para la criopreservación de esperma de coral para apoyar los biobancos y la acuicultura

Aprende a criopreservar espermatozoides de ratón con el kit I•Cryo para biología reproductiva. Este método permite archivar líneas genéticamente modificadas mediante congelación en nitrógeno líquido y recuperación por FIV.

Criopreservación de espermatozoides de ratón y de recuperación con el I · Kit de Cryo

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