Criopreservación de espermatozoides de ratón y de recuperación con el I · Kit de Cryo

El objetivo general de este procedimiento es criopreservar el esperma de ratón. Esto se logra recolectando primero esperma de EPI de ratones utilizando pajuelas de crioconservación. Luego, las pajitas se congelan en nitrógeno líquido, donde se almacenan hasta que se recuperan descongelándolas en agua tibia.

Los espermatozoides de ratón recuperados se utilizan en última instancia para la fertilización in vitro. La principal ventaja de este kit sobre los métodos existentes es que el kit contiene todos los materiales necesarios para criopreservar y recuperar esperma de ratón. Generalmente, en los individuos nuevos en este método se puede estrangular con la manipulación y carga de pajitas. Comience ensamblando 15 pajuelas de criopreservación de esperma por línea de ratones que se van a crioconservar.

Primero, conecte cada pajita de 0,25 mililitros a una jeringa de un mililitro con el tapón de algodón más cercano a la jeringa. En segundo lugar, cargue ocho centímetros de medio de FIV en cada pajita, seguido de un centímetro de aire. En tercer lugar, etiquete cada una de las 15 pajuelas con el nombre de la línea que se va a conservar para cada línea que se va a crioconservar.

Llene un plato de cuatro pocillos con 240 microlitros de agente crioprotector. Coloque una pipeta de un mililitro en el mango del recipiente de congelación para extender el mango. Por último, llene la caja aislada de espuma provista con el kit con 15 centímetros de nitrógeno líquido y cierre la tapa para practicar la eutanasia.

Dos ratones machos adultos fértiles. Para que cada línea se vaya a criopreservar y realizar cirugía, se deben extraer sus EPIs codales. Coloque el ratón en la espalda dorsal y abra la pared ventral del cuerpo.

Tire suavemente de la vasta deferencia y elimine el exceso de grasa. A continuación, localiza el epidídimo y retíralo intacto con un pequeño trozo de deferencia rápida. Coloque los EPIs en un pocillo del plato de cuatro pocillos preparado cargado con CPA bajo un telescopio de disección.

Haz de cinco a siete cortes longitudinales en cada epidídimo. Luego, con fórceps, exprima suavemente cada diferencia rápida. Para expulsar los espermatozoides, incube la mezcla de CPA y epidídimo a temperatura ambiente durante tres a cinco minutos.

Agite suavemente el plato con la mano dos o tres veces durante la incubación. Esto permitirá que los espermatozoides naden por aspiración. Cargue cada pajita preparada con cinco milímetros de la suspensión de espermatozoides, seguidos de un centímetro de aire.

Es importante para el proceso de congelación que todas las pajuelas se carguen por igual. Después de cargar las 15 pajitas, selle cuidadosamente con calor ambos extremos de cada pajita. Para garantizar la supervivencia de los espermatozoides, complete el proceso para las 15 pajuelas en 10 minutos.

Una vez que todas las pajuelas estén preparadas, cárguelas en la columna de esperma del recipiente de congelación. Primero, coloque el bote en la caja de espuma y deje que flote verticalmente en el nitrógeno líquido. Durante 10 minutos, el recipiente debe flotar verticalmente o la tasa de congelación de esperma se verá afectada.

A continuación, sumerja el recipiente en el nitrógeno líquido. De este modo, los espermatozoides se criopreservan y están listos para el almacenamiento de nitrógeno líquido a largo plazo. Aproximadamente 60 horas antes de una recuperación planificada de los espermatozoides.

Siga el protocolo escrito para superovular a las mujeres antes de la FIV. Para cada pajita que se va a descongelar, prepare y equilibre todos los medios durante al menos una hora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Estos materiales incluyen una placa de Petri de 35 milímetros con una gota de 90 microlitros de medio de tratamiento de esperma cubierta con aceite.

Una placa de Petri de 35 milímetros con tres mililitros de medio de FIV para servir como plato de corte y por cada cinco hembras superovuladas preparan un plato de FIV, que es un pocillo de un plato de cuatro pocillos cargado con 500 microlitros de medio de FIV. Para cada plato de FIV, prepare un plato de lavado, que es una placa de Petri de 35 milímetros con tres mililitros de KSOM y un plato de cultivo de embriones, que es una placa de Petri de 35 milímetros con 50 gotas de microlitros de medio KSOM cubierto con aceite. Con todos los materiales necesarios preparados, retire rápidamente una pajita del almacenamiento y colóquela en un baño de agua a 37 grados centígrados durante dos o tres minutos.

Seca la pajita. A continuación, haz un corte en ángulo en la columna de aire por debajo del tapón de algodón. En el otro extremo de la pajita, haz otro corte en ángulo sobre otra columna de aire.

Evite cortar la columna de espermatozoides. Ahora aspire la suspensión de esperma desde el extremo de la pajita, utilizando una pipeta de 200 microlitros y deposítela en el centro del medio de tratamiento de espermatozoides. Soltar. Luego incube el plato durante 45 a 60 minutos.

Durante la incubación de los espermatozoides, aísle los ucs de las hembras superovuladas y transfiéralos a la placa de corte. Use una aguja o pinzas de calibre 30 para rasgar cada oviducto y liberar los complejos de citos cúmulos. Transfiera los C C de cinco hembras a cada FIV.

Bueno, con una cantidad mínima de medios. Evite transferir grasa y sangre, ya que los medios sucios inhiben la eficiencia de la fertilización. Después de la incubación, recoja de 10 a 15 microlitros de la suspensión de esperma de la periferia de la gota STM y deposite la suspensión en una FIV.

Bueno, ahora co-cultive las células durante cuatro a seis horas para la fertilización. Después de la fertilización, pase los embriones a través de al menos 2K lavados SOM en el plato de lavado. Luego la cultura.

Los embriones en KSOM hasta que se alcanza la etapa de desarrollo deseada. Se congelaron los espermatozoides de cinco cepas de ratones endogámicos de Charles River. Las proporciones de protección de la motilidad de los espermatozoides y la motilidad progresiva rápida oscilaron entre el 81% y el 47% en cinco cepas de esos espermatozoides.

Las tasas de FIV con esperma congelado y descongelado variaron en diferentes cepas del 26 al 88% durante un año y medio. Un total de 49 líneas de ratones modificados genéticamente fueron archivadas por criopreservación de espermatozoides y posteriormente recuperadas por FIV en cuatro cepas femeninas diferentes. C 57 negro, seis BC, DBA uno y 1, 29 SV Una vez dominada, la técnica de criopreservación de espermatozoides se puede realizar en 30 minutos si se realiza correctamente.

Para este procedimiento, es importante fluir al recipiente verticalmente y nitrógeno líquido.