Aislamiento de células basales y de células submucosas conducto de la glándula de ratón tráquea

El objetivo de este método es aislar células madre de los conductos de las glándulas submucosas de la tráquea de ratón para estudiar la reparación y la regeneración. Primero, se disecciona la tráquea de un ratón sacrificado. Luego, la tráquea se limpia, corta y digiere.

Luego, el epitelio se separa mecánicamente y se digiere adicionalmente para generar una suspensión de células individuales. A continuación, las células se tiñen según características, se clasifican y finalmente se procesan para su uso en ensayos in vivo e in vitro. En última instancia, este método puede ayudar a identificar las vías clave que regulan las células madre epiteliales de las vías respiratorias, así como su autorrenovación y diferenciación.

Estas técnicas son importantes porque nos proporcionan modelos de reparación y regeneración de la vía aérea epitelial in vitro y ex vivo. Esto nos permite estudiar la reparación normal de las vías respiratorias, así como enfermedades de la vía aérea, como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, la fibrosis quística y el asma. Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando no pudimos encontrar marcadores superficiales específicos para aislar las células basales de las células madre ductales, por lo que decidimos eliminar el epitelio superficial junto con las células basales y dejar atrás las células ductales. Demostrando los procedimientos de disección traqueal.

El aislamiento de epitelio de vías respiratorias, la creación de una suspensión simple de células y la clasificación por citometría de flujo se realizarán mediante hega. Una investigadora posdoctoral en mi laboratorio demostrará los procedimientos para procesar las células clasificadas en modelos in vitro y ex vivo; sí, orga es nuestra gestora del laboratorio. Comience este procedimiento cortando la pared abdominal de un ratón sacrificado.

Mueva los intestinos hacia un lado para exponer la aorta abdominal y luego diséquela. Abra el tórax cortando el diafragma y la pared torácica interna en ambos lados para exponer el corazón y los pulmones. Continúe cortando hacia arriba en el cuello, retirando la grasa y las glándulas salivales para exponer la tráquea utilizando tijeras finas.

Retire el timo y seccione el pulmón del tejido conectivo situado debajo y detrás de él. A continuación, inserte la pinza entre la tráquea y el esófago para separarlos. Corte la tráquea en su parte más superior, por encima de su conexión con la laringe.

A continuación, sostenga la tráquea con la pinza y diséquela desde su punto de fijación. Continúe hacia abajo para retirarla junto con el corazón y el bloque pulmonar; corte el corazón y los pulmones cerca del hilio para incluir la mayor parte de los bronquios principales derecho e izquierdo. Coloque la tráquea en una pequeña placa de Petri que contenga medio de recolección, sobre hielo y bajo el microscopio de disección.

Utilice una pinza de punta muy fina número cinco, un tubo venoso y tijeras para eliminar cualquier tejido adherido a la tráquea. Esto incluye ganglios linfáticos, grasa del nervio laríngeo recurrente, la glándula tiroides y los vasos pulmonares restantes. Es necesario prestar especial atención a la parte superior de la tráquea para eliminar los grandes fragmentos de cartílago laríngeo sin comprometer el mayor grupo de glándulas submucosas que se encuentra entre el cartílago CRICO y el primer anillo cartilaginoso traqueal C uno.

A continuación, corte la tráquea en la parte superior e inferior entre la vértebra C cuatro y C cinco, y luego corte. Abra ambas partes a través del lumen de la tráquea. Transfiera la parte inferior de la tráquea a tubos microcentrífugos de un mililitro y la parte superior de la tráquea a un tubo cónico de 15 mililitros para la digestión enzimática y el procesamiento en suspensiones de células individuales.

En la siguiente parte del procedimiento, las porciones inferior y superior de la tráquea se procesan para generar suspensiones de células individuales. Aunque deberían procesarse simultáneamente aquí, los dos métodos se demostrarán secuencialmente. Para procesar la parte inferior de la tráquea, añádala a un mililitro de 16 unidades de dis espacio en un tubo de microcentrífuga, incube a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Luego, transfiera la tráquea a un nuevo tubo que contenga 0,5 miligramos por mililitro de ADN I en DMM durante 20 minutos adicionales a temperatura ambiente tras la digestión. Use pinzas finas para transferir el tejido a una placa de Petri estéril que contenga medio de recolección fresco. A continuación, bajo el microscopio estereoscópico, desprenda el epitelio superficial tirando suavemente de las láminas epiteliales para separarlas de la membrana basal subyacente. A continuación, use una pipeta para transferir el medio que contiene el epitelio desprendido a un tubo cónico de 50 mililitros y centrifugue a 1000 ×g a cuatro grados Celsius.

Tras la centrifugación, retire el SNAT y agregue tripsina-EDTA al 0,1 %; incube el tubo en un incubador agitador a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Después de la incubación, utilice una pipeta de punta de 1000 microlitros para aspirar y dispensar repetidamente hacia arriba y hacia abajo con el fin de desagregar los cúmulos de células y asegurar que las células formen una suspensión de células individuales. Coloque la tráquea superior en un tubo cónico que contenga un mililitro de Pronasa al 0,15 %, luego incube a cuatro grados Celsius durante cuatro horas. Transfiera la parte inferior de la tráquea a un tubo microcentrífugo de un mililitro que contenga un mililitro de medio con 16 unidades de discodiasi.

Después de la incubación, agite suavemente el tubo mediante vórtex y luego coloque la tráquea en medio de recolección fresco. Bajo el microscopio de disección, confirme que haya una separación completa del epitelio superficial. Utilice tijeras finas para trocear la tráquea y abrir los compartimientos de las glándulas submucosas.

Incubar durante una hora adicional en pronasa al 0,15 % a temperatura ambiente con agitación lenta. Centrifugar el tejido traqueal tras eliminar la pronasa. AÑADIR tripsina al 0,1 % con EDTA e incubar a 37 grados Celsius durante 30 minutos con agitación.

A continuación, filtre los trozos grandes con un tamiz de 70 micrones. Luego lave el tamiz con medio. Pase los agregados de células digeridas y cualquier trozo restante de glándulas a través de agujas de calibre 20, calibre 23 y calibre 26 utilizando una jeringa de 10 mililitros.

Repita el proceso de envasado varias veces con cada tamaño de aguja antes de reducirlo. Ahora, la mayoría de las células deberían estar en una suspensión de células individuales. Filtre la suspensión a través de un filtro de 40 micrones, luego lave el filtro con medio y centrifugue las células.

Luego, reconstituya las células en el volumen adecuado de medio, cuente las células y proceda inmediatamente a la tinción de superficie y clasificación. Tome suficientes células para preparar los tubos de compensación no teñidos y teñidos individualmente. A continuación, tiña el resto de las células con anticuerpos primarios contra trop tubo y I TGA seis durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, lave con medio de recogida PBS, retire cuidadosamente el sobrenadante.

Rompa el pellet celular y tiña con el anticuerpo secundario adecuado. Incube en la oscuridad a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego lave y elimine el sobrenadante, y a continuación rompa el pellet.

Las células ahora pueden clasificarse mediante citometría de flujo activada por fluorescencia. Una vez que las células han sido clasificadas, pueden utilizarse para investigar los mecanismos de reparación y regeneración para generar cultivos in vitro formadores de esferas. Mezcle 100 microlitros de matri gel con factores de crecimiento reducidos con 100 microlitros de medio completo que contenga hasta 50 000 células clasificadas.

Pipetee esta mezcla en la cámara superior de una placa trans bien de 24 pocillos; en la cámara inferior, pipetee 400 microlitros de medio completo e incube a 37 grados Celsius. Cambie el medio en la cámara inferior cada dos días y agregue 100 microlitros adicionales de matri gel cada semana o antes, si se vuelve delgado.

Las esferas suelen formarse tras siete días y se pueden cultivar durante varias semanas o pasarse de forma seriada. Para el modelo in vivo, reconstituya el pellet de células ordenadas en medio completo mezclado uno a uno con matri gel a una concentración de 5.000 a 10.000 células por 50 microlitros. Después de anestesiar al ratón C 57 negro seis receptor, esterilice y afeite su espalda, luego la parte superior de la espalda.

Realice una incisión cutánea longitudinal central. Utilice el lado romo de la hoja de las tijeras para ensanchar los espacios entre la piel y la pared torácica posterior en ambos lados. Empuje la extremidad del ratón hacia arriba y hacia atrás para moverla e identificar el borde medial de la escápula.

Luego, utilizando una jeringa de insulina de 300 microlitros, inyecte 50 microlitros de la suspensión celular en el páncreas graso justo medial a la escápula y lateral a las vértebras. Debe formarse una ampolla; repita la inyección en el otro lado, luego cierre con grapa o punto la incisión cutánea después de tres semanas. Abra la piel del ratón sacrificado como antes y diseque todo el páncreas graso de ambos lados con un margen de seguridad.

Para evitar omitir cualquier estructura tisular que pueda haberse formado y extendido alrededor, fije la almohadilla adiposa diseccionada en PFA e incruste en parafina para evitar eludir u omitir estructuras durante el corte del bloque. Recorte 40 micrones una vez, luego corte una rebanada de cuatro micrones.

Colóquelo sobre un portaobjetos de vidrio y luego examínelo al microscopio para determinar si están presentes estructuras epiteliales. Si no se observa nada, corte nuevamente y repita este paso. La eliminación del epitelio de la tráquea de ratón, tal como se describe en este video, dará como resultado una tráquea desprovista de epitelio que es visible mediante microscopía óptica, como se muestra aquí con tráqueas desprovistas.

Después de 30 minutos de digestión con pronasa, se muestran a la izquierda la digestión y las tráqueas desprovistas de epitelio. Después de cuatro horas de digestión con pronasa, se muestran a la derecha. Después de la eliminación del epitelio, las glándulas submucosas se liberan de los tejidos y se asemejan a racimos de uvas.

La eliminación de las células epiteliales superficiales se muestra con flechas negras. La eliminación de células en la glándula submucosa y los conductos se muestra con flechas verdes. La citometría de flujo de las suspensiones de células individuales debe mostrar gráficos de dispersión directa y dispersión lateral como se muestra aquí.

Buena separación de las células ductales del resto. Si se desea observar las células traqueales con el anticuerpo Trop dos mediante citometría de flujo para ordenación de células activadas por fluorescencia, tras aproximadamente una semana en cultivo, deberían ser visibles esferas en el gel de matriz y nuestro luminal cuando se derivan de células basales y con apariencia diferente cuando se derivan de células ductales. La eficiencia de este proceso es del orden del 1 al 2 %, y aún estarán presentes células individuales en el gel de matriz, que probablemente representen células de los conductos de las glándulas submucosas que no poseen capacidad de autorrenovación.

Las esferas basales son más grandes y tienen apariencia luminal. La inyección de células madre ductales en el tejido adiposo del ratón da lugar a la formación de glándulas submucosas, estructuras similares a esferas que poseen una luz central. Estas se observan en los bloques incluso sin tinción con h y e.

Se necesitan realizar muchas secciones transversales a través del tejido adiposo para obtener una sección que contenga estas estructuras epiteliales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar una población de células madre a partir de células ductales de la glándula subiaca, y una vez dominada, esta técnica puede completarse en 10 horas. Tras este procedimiento, las condiciones de cultivo pueden modificarse con el fin de responder varias preguntas diferentes relacionadas con la formación de esferoides y la regeneración mediante potenciadores del crecimiento.