Name: La disección de utrículo ratón adulto y mediada por adenovirus infección de reparto de las células (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Aprende a disecar el utrículo de ratón adulto e infectar células de soporte con adenovirus para estudiar la biología de células ciliadas y regeneración auditiva. Este método permite investigar la supervivencia celular in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado por la División de Investigación Intramural del Instituto Nacional de la Sordera y Otros Trastornos de Comunicación. El apoyo adicional fue proporcionada por NIDCD 5R01 DC007613.

1. Utrículo Disección y Cultura <ol><li> La eutanasia de un adulto (de 4 semanas de edad o más) del ratón mediante un protocolo aprobado y decapitar. </li><li> Corta el conducto auditivo externo en ambos lados de la cabeza y tire de la piel hacia adelante hacia la nariz. Dividir en dos la cabeza de atrás hacia delante y quitar el cerebro de ambos lados para revelar el laberinto óseo. </li><li> Recortar el cráneo lejos de la cóclea ósea y transferir el laberinto óseo (incluyendo la ampolla) a una campana de cultivo de tejidos equipado con un microscopio de disección (Nota: el trabajo adenovirus se debe realizar en un armario de Clase II de seguridad biológica). </li><li> En la campana, transferir cada cóclea a un plato de cultivo de tejidos de 35 mm que contiene estériles medios de disección (M199, Gibco / Invitrogen # 12350) (Figura 1A). </li><li> Si la bulla auditiva sigue intacta (es posible eliminar la bulla durante la disección bruta mediante la inserción de la uña del pulgar entre la bulla y el ápice dela cóclea), utilice dos pinzas (una # 3 y un n º 5) para romper la ampolla (fig. 1B). </li><li> Identificar los hitos de la cóclea ósea de preparación: huesecillos ápice, la base, y las ventanas redonda y oval, la raíz del nervio VIII, los canales semicirculares (Figura 1 C, D). </li><li> Coloque el oído interno en el plato con el lado medial hacia arriba, de tal manera que el óvalo y ventanas redondas y el ápice son en la parte inferior del plato y la raíz del nervio VIII está orientada hacia arriba. Mantenga la preparación utilizando una pinza de # 3 en la región de los canales semicirculares (Figura 1D). </li><li> Con un bisturí equipada con una cuchilla # 11, cortar el vértice de la cóclea sólo apical de la raíz nerviosa (Figura 1D). </li><li> Girar la preparación de modo que la porción cortada hacia arriba. Utilizar el canal semicircular anterior como asa para estabilizar la preparación (Figura 1E). </li><li> Utilizando # 5 pinzas, retire la cóclea en el modiolo abajoa la base. En el punto donde la región gancho de la cóclea gira hacia abajo, utiliza una sonda fina (media de unos rotos # 55 fórceps) para levantar la plataforma último ósea de la lámina espiral ósea (Figura 1F), revelando el sáculo. Justo debajo de la sáculo es la base del estribo, que es un hito importante. El utrículo es inmediatamente adyacente a la base del estribo (Figura 1G), y está rodeado por hueso. Utilice la sonda para astillar el hueso de distancia suficiente como para revelar aproximadamente 1/3 del utrículo. Retire con cuidado el utrículo con # 55 con fórceps (Figura 1H). Este procedimiento generalmente se traducirá en la eliminación del epitelio pigmentado del techo como el utrículo se extrae de la preparación ósea. Sin embargo, si el utrículo se elimina con el epitelio del techo intacto, el techo se puede quitar utilizando # 55 pinzas. </li><li> Utrículos para la infección por adenovirus (o experimentos en vivo de imágenes) debe tener el otoconia eliminado durante la disección (antes de la infección).En este caso, utilice una jeringa luer que se llena con los medios de disección y equipado con una aguja de pequeño calibre (generalmente 26-28 manométrica). Sostenga el utrículo en el borde usando pinzas de # 55 (Figura 1i). Llevar la punta de la aguja cerca del utrículo con el bisel de la aguja apuntando hacia abajo. Utilice un chorro de la disección de los medios de comunicación para hacer estallar fuera de la otoconia (Figura 1J). Alternativamente, otoconia se puede eliminar por cepillado a retirarse utilizando una herramienta de pestañas (Ted Pella, Inc. # 113). Utrículos que no van a someterse a la infección viral suelen ser cultivadas de libre flotación, en placas de 24 pocillos de cultivo de tejidos con la intacta otoconia (ver más abajo para la eliminación después de la corrección otoconia, que es más fácil). </li><li> Una vez que todos utrículos se disecan, cambiar los medios de comunicación a la cultura de disección estériles los medios de comunicación: DMEM F12 (Gibco # 11320) suplementado con FBS al 5% y 50 U / ml de penicilina G (Sigma). </li><li> Utrículos se cultivan a 37 ° C y 5% de CO 2. Si los cultivos son para ser maintained por más de 48 horas, la mitad de los medios de cultivo se debe cambiar cada dos días. Los cultivos se puede mantener durante una semana o más. </li></ol> 2. Adenovirus infección de las células de apoyo Importante: Trabajo con adenovirus requiere de Bioseguridad Nivel 2 (BSL2) procedimientos y la certificación. Consulte con su Oficial de Seguridad de la Biotecnología Institucional para la orientación y capacitación sobre los procedimientos de BSL2. <ol><li> Dissect utrículos como anteriormente en los medios de disección (sin suero). Quitar otoconia como anteriormente. </li><li> Cuando esté listo para infectar, transmitir un utrículo (células ciliadas hacia arriba) en cada pocillo de una bandeja de mini-Nunc (Fisher # 12-565-68) que contiene 15 l de suero libre de DMEM F12 (esto es importante porque el suero se puede inactivar el virus) . Esta transferencia es más fácil con un microcurette 1,5 mm (# 10082-15 de las herramientas de la ciencia Artes). </li><li> Nuestro Ad-GFP es el serotipo 5 con los genes virales E1 y E3 eliminadas y el promotor CMV humano impulsando la transgeno (GFP). Este virus se obtuvo de Vector BioLabs (Filadelfia, PA <a href="http://www.vectorbiolabs.com/">vectorbiolabs.com</a> ). Virus de archivo se proporcionan en los títulos de 1.0-4.0 x 10 10 PFU / ml. Añadir 0.5-2 l de virus de acciones a cada pocillo que contiene un utrículo (Figura 1 l). La cantidad real utilizado varía dependiendo del título del virus y de existencias. Por lo general, infectar con el utrículo 1.0-4.0 × 10 7 UFP. </li><li> Cultura en los utrículos de virus que contiene los medios de comunicación a 37 ° C / 5% de CO 2 durante 2 horas. Después de 2 horas, transferir los utrículos de nuevo a la placa de tejido de 24 pocillos de cultivo que contiene los medios de cultivo con suero. Cultura de los utrículos noche a la mañana a 37 ° C / 5% de CO 2. </li><li> Utrículos puede ser utilizado al día siguiente para experimentos de imagen en vivo, o pueden ser fijados para inmunoquímica de las células ciliadas (ver más abajo). Viral aumenta la expresión de transgenes en el tiempo, así que si la expresión del transgen es baja a las 24 horas post-infección que puedebeneficioso para células de cultivo de 24 horas adicionales en el suero que contienen medios de comunicación. Si usted ve la toxicidad de las células ciliadas, reducir la cantidad de virus que se utiliza. </li></ol> 3. Fijación utrículo, eliminación otoconia y Inmunoquímica <ol><li> Al final del período de cultivo, fijar utrículos en paraformaldehído al 4%, ya sea para 3 horas a temperatura ambiente (en una plataforma oscilante) o durante la noche a 4 ° C. Lavar utrículos (3 veces, 15 min cada uno) en 0,1 M (1X) de Sorensen tampón fosfato pH 7,4. Estos pasos se llevan a cabo en una placa de tejido 24-pocillos. </li><li> La eliminación otoconia: Nota: otoconia debe ser removido antes de la infección por adenovirus (vea el paso por encima de 1,11). Sin embargo, utrículos que no son para ser infectados pueden ser cultivadas y se fija con el otoconia todavía intacto. En este caso, siga los pasos descritos aquí para sacar el otoconia después de la fijación. Inspeccione utrículos para cualquier epitelio de cubierta pigmentada que queda. Retire con cuidado el epitelio restante con techo de dos # 55 forceps. Para quitar el otoconia, reemplace tampón de Sorensen fosfato con l 750-1000 Cal-Ex descalcificador (Fisher # CS510-1D). Deja Cal-Ex en utrículos durante 1 minuto y 40 segundos (no exceder de 2 minutos). Vuelva a Cal-Ex con 0,1 M tampón fosfato de Sorensen y el lavado (5 veces, 5 minutos cada uno). </li><li> Incubar utrículos en borohidruro de sodio (Sigma # 452882, 1% en agua desionizada) durante 10 minutos. Lave utrículos en tampón fosfato 0,1 M de Sorensen (5 veces, a 5 minutos cada uno). </li><li> Utrículos Colocar en solución de bloqueo (PBS + 2% de albúmina de suero bovino + 0,8% de suero de cabra normal de + 0,4% de Triton X-100) durante 3 horas a temperatura ambiente sobre una plataforma oscilante. </li><li> Añadir anticuerpos primarios y se incuba durante la noche a 4 ° C. Anti-miosina 7a (ya sea Proteus Biosciences # 25-6790 o # 138-1 MYO7A del Banco de Desarrollo de Estudios de hibridoma) a 1:100 en el bloqueo de las etiquetas de todas las soluciones de las células ciliadas. Para etiquetar por separado las células ciliadas y no striolar striolar-, hemos utilizado un PROTOCOLO DE doble etiquetal con anticuerpo monoclonal anti-calmodulina (Sigma C # 3545; 1:150) y policlonal anti-calbindina (Chemicon # AB1778, Temecula, California, EE.UU., 1:200). Los anticuerpos secundarios (por lo general Alexa Fluor anticuerpos secundarios conjugados de Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) se diluyen 1:500 en solución de bloqueo y se incubó durante 4 horas en la oscuridad a temperatura ambiente en una plataforma oscilante. </li><li> Mount utrículos en portaobjetos de cristal utilizando Fluoromount-G (Southern Biotech, Birmingham, AL, EE.UU.). </li></ol> 4. Los resultados representativos Utrículos cultivadas con este método mantener completa era de las células ciliadas y las células de soporte (Figura 2). Las células ciliadas en los cultivos sanos muestran perfiles redondos nucleares rodeados de finas regiones citoplasmáticas que son la miosina 7a-positivo (Figura 2, panel superior). Células de soporte (marcadas con anti-Sox2) son más pequeños y más densamente poblado de células ciliadas (Figura 2, panel inferior). Adeadenovirus infecta a 25-50% de las células de apoyo en el utrículo, y no se infectan las células ciliadas (Figura 2, Ad-GFP paneles). Cabe señalar que el título de trabajo óptima de cada adenovirus se debe determinar empíricamente, desde la muerte de la célula de pelo es posible si el título viral es demasiado alto. Además, las regiones de daños mecánicos (causados ​​durante la disección) se llevará a grandes cantidades de virus. Estas regiones de los daños mecánicos son fácilmente distinguibles por una línea continua de células con niveles muy elevados de expresión de las buenas prácticas agrarias y que faltan las células ciliadas. Esto está en contraste con la expresión de GFP dispersa en el apoyo de las células de un cultivo sin daños (Figura 2). <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Utrículo disección. R: C La ampolla se rompe utilizando dos pinzas fuertes::. Bulla auditiva (AB) B. Bony cóclea (OR = ventana redonda, S =. la arteria estapedial, C = cóclea, ST = estribo) D: Una hoja de bisturí (SB) se utiliza para cortar el vértice de la cóclea apical del nervio craneal VIII (8 º N) = ASC canal semicircular anterior E..: La preparación se mantiene firmemente con una pinza # 3 con un tenedor insertado en el canal semicircular anterior (ASC) y la otra en el hueso más externa (flechas). El laberinto membranoso se elimina el uso de fórceps. F: Con el laberinto membranoso eliminado, la vuelta basal de la lámina espiral ósea es visible cerca de la zona de ganchos. Una sonda fina se inserta debajo de esta plataforma ósea para levantar la plataforma y retírela (flecha) G:. Después de la eliminación del sáculo, utrículo (U) es visible inmediatamente adyacente a la base del estribo (SF) H:. Utrículo (U ) se retira con una pinza # 55 (flecha) SF = base del estribo I:.. utrículo con otoconia (O) elimina parcialmente unad sensoriales epitelio (SE) debajo visibles J:. otoconia (O) se elimina de la utrículo con una corriente de medio entregado por una jeringa provista de una aguja de calibre 26. La sombra de la aguja (S) es visible en la parte inferior de la imagen K:. Utrículo con otoconia eliminado y el epitelio sensorial (SE), visibles L:. Infección viral: cada utrículo (U) se coloca en un individuo bien de una mini bandeja de entrada. Las células de apoyo están infectadas con el adenovirus al vaso del virus en el pozo (P = punta de la pipeta). <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Infección mediada por adenovirus de células de soporte. Utrículos estaban infectados con adenovirus expresión motriz de la proteína verde fluorescente (Ad-GFP). Se muestran imágenes confocal de la capa de células del cabello y la capa de células de apoyo en la misma área de un utrículo. Las células ciliadas se marcan con un anticuerpo contra la miosina 7a(Magenta). Las células de apoyo están etiquetados con un anticuerpo contra Sox2 (rojo). Esquema muestra la estructura del epitelio sensorial utrículo y las ubicaciones de las células ciliadas (HC) y células de soporte (SC). Lugares de confocal (óptico) secciones mostradas en la parte superior (U) y baja (L) paneles se indican mediante líneas de trazos en el esquema. Paneles superiores: En confocal de imágenes tomadas en el nivel de los núcleos de las células ciliadas, Ad-GFP señal aparece en los espacios entre las células ciliadas y no se solapa con la 7a células ciliadas miosina marcador. Reducción de los paneles: En las secciones confocal en el ámbito de los núcleos de células de apoyo, Ad-GFP señal de co-localiza con el marcador de células de apoyo Sox-2. Ad-GFP infección da lugar a la expresión de GFP en las células de sostén solamente, y no las células ciliadas están infectadas. <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. La infección viral no se traduce en la muerte de las células ciliadas o células de apoyo. Utricles fueron infectadas con Ad-GFP a 4 x 10 8 PFU / ml. Utrículos fueron marcadas con anticuerpos contra la miosina 7a (marcador de células de cabello) y Sox2 (compatible con marcador de células). Células del pelo y el apoyo a los recuentos de células eran iguales para utrículos de control y las buenas prácticas agrarias Ad-utrículos infectados.

<ol><li>Cunningham, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adult+mouse+utricle+as+an+in+vitro+preparation+for+studies+of+ototoxic-drug-induced+sensory+hair+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The adult mouse utricle as an in vitro preparation for studies of ototoxic-drug-induced sensory hair cell death.</a> Brain Res. , (2006).</li>
<li>Schmitt, N. C., Rubel, E. W., Nathanson, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisplatin-induced+hair+cell+death+requires+STAT1+and+is+attenuated+by+epigallocatechin+gallate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cisplatin-induced hair cell death requires STAT1 and is attenuated by epigallocatechin gallate.</a> J. Neurosci. 29, 3843-3851 (2009).</li>
<li>Ou, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+FDA-approved+drugs+and+bioactives+that+protect+hair+cells+in+the+zebrafish+%28Danio+rerio%29+lateral+line+and+mouse+%28Mus+musculus%29+utricle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Res.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Identification of FDA-approved drugs and bioactives that protect hair cells in the zebrafish (Danio rerio) lateral line and mouse (Mus musculus) utricle.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 10, 191-203 (2009).</li>
<li>Chiu, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+zebrafish+lateral+line+to+screen+for+ototoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Res.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Using the zebrafish lateral line to screen for ototoxicity.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 9, 178-190 (2008).</li>
<li>Sugahara, K., Rubel, E. W., Cunningham, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JNK+signaling+in+neomycin-induced+vestibular+hair+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">JNK signaling in neomycin-induced vestibular hair cell death.</a> Hear Res. , 221-221 (2006).</li>
<li>Matsui, J. I., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+hair+cell+death+and+regeneration%3A+two+halves+of+the+same+equation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Otolaryngol.+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Sensory hair cell death and regeneration: two halves of the same equation.</a> Curr. Opin. Otolaryngol. Head Neck Surg. 12, 418-4125 (2004).</li>
<li>Ryals, B. M., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+cell+regeneration+after+acoustic+trauma+in+adult+Coturnix+quail%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hair cell regeneration after acoustic trauma in adult Coturnix quail.</a> Science. 240, 1774-176 (1988).</li>
<li>Corwin, J. T., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+sensory+hair+cells+after+acoustic+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regeneration of sensory hair cells after acoustic trauma.</a> Science. 240, 1772-174 (1988).</li>
<li>Shang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supporting+cell+division+is+not+required+for+regeneration+of+auditory+hair+cells+after+ototoxic+injury+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Res.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Supporting cell division is not required for regeneration of auditory hair cells after ototoxic injury in vitro.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 11, 203-222 (2010).</li>
<li>Stone, J. S., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+cell+regeneration+in+the+avian+auditory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Hair cell regeneration in the avian auditory epithelium.</a> Int. J. Dev. Biol. 51, 6-7 (2007).</li>
<li>Lahne, M., Gale, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damage-induced+activation+of+ERK1%2F2+in+cochlear+supporting+cells+is+a+hair+cell+death-promoting+signal+that+depends+on+extracellular+ATP+and+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Damage-induced activation of ERK1/2 in cochlear supporting cells is a hair cell death-promoting signal that depends on extracellular ATP and calcium.</a> J. Neurosci. 28, 4918-4928 (2008).</li>
<li>Cunningham, L. L., Cheng, A. G., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+Activation+in+Hair+Cells+of+the+Mouse+Utricle+Exposed+to+Neomycin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Caspase Activation in Hair Cells of the Mouse Utricle Exposed to Neomycin.</a> Journal of Neuroscience. 22, 8532-8540 (2002).</li>
<li>Matsui, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+inhibitors+promote+vestibular+hair+cell+survival+and+function+after+aminoglycoside+treatment+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Caspase inhibitors promote vestibular hair cell survival and function after aminoglycoside treatment in vivo.</a> J. Neurosci. 23, 6111-6122 (2003).</li>
<li>Matsui, J. I., Ogilvie, J. M., Warchol, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+caspases+prevents+ototoxic+and+ongoing+hair+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inhibition of caspases prevents ototoxic and ongoing hair cell death.</a> J. Neurosci. 22, 1218-1227 (2002).</li>
<li>Nakagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+inducing+local+inner+ear+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">A novel technique for inducing local inner ear damage.</a> Hear Res. 176, 1-2 (2003).</li>
<li>Forge, A., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+death+of+hair+cells+in+mammalian+vestibular+sensory+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Apoptotic death of hair cells in mammalian vestibular sensory epithelia.</a> Hear Res. 139, 1-2 (2000).</li>
<li>Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+inhibitors+prevent+cisplatin-induced+apoptosis+of+auditory+sensory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Caspase inhibitors prevent cisplatin-induced apoptosis of auditory sensory cells.</a> Neuroreport. 9, 2609-2614 (1998).</li>
<li>Taleb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+inhibits+aminoglycoside-induced+hearing+loss+and+cochlear+hair+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stress+Chaperones%22%5BJournal%5D)">Hsp70 inhibits aminoglycoside-induced hearing loss and cochlear hair cell death.</a> Cell Stress Chaperones. 14, 427-437 (2009).</li>
<li>Taleb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+inhibits+aminoglycoside-induced+hair+cell+death+and+is+necessary+for+the+protective+effect+of+heat+shock%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Res.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Hsp70 inhibits aminoglycoside-induced hair cell death and is necessary for the protective effect of heat shock.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 9, 277-289 (2008).</li>
<li>Francis, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celastrol+Inhibits+Aminoglycoside-Induced+Ototoxicity+via+Heat+Shock+Protein+32+%28HSP32%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Celastrol Inhibits Aminoglycoside-Induced Ototoxicity via Heat Shock Protein 32 (HSP32).</a> Cell Death and Disease. , (2011).</li>
<li>Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+inhibitors%2C+but+not+c-Jun+NH2-terminal+kinase+inhibitor+treatment%2C+prevent+cisplatin-induced+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Caspase inhibitors, but not c-Jun NH2-terminal kinase inhibitor treatment, prevent cisplatin-induced hearing loss.</a> Cancer Res. 64, 9217-9224 (2004).</li>
<li>Bird, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supporting+cells+eliminate+dying+sensory+hair+cells+to+maintain+epithelial+integrity+in+the+avian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Supporting cells eliminate dying sensory hair cells to maintain epithelial integrity in the avian inner ear.</a> J. Neurosci. 30, 12545-12556 (2010).</li>
<li>Sato, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+fractalkine+receptor+CX3CR1+on+cochlear+macrophages+influences+survival+of+hair+cells+following+ototoxic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Res.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Expression of fractalkine receptor CX3CR1 on cochlear macrophages influences survival of hair cells following ototoxic injury.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 11, 223-234 (2010).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Las células sensoriales del cabello son susceptibles a la muerte causada por una variedad de tensiones, incluyendo el envejecimiento, el trauma del ruido, y la exposición a fármacos ototóxicos, incluyendo los antibióticos aminoglicósidos y el cisplatino agente antineoplásico. En los resultados de los mamíferos de pelo de muerte celular en la pérdida permanente de la audición y / o alteración de equilibrio. En los sistemas de modelos in vitro son instrumentos esenciales para los estudios destinados a de...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/3734">Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection</a>. There was an error with a figure, the authors middle names were omitted, and the acknowledgements were updated.

Erratum: Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Reactivo</strong</td&gt;<td<strong&gt; Empresa</strong</td&gt;<td<strong&gt; Número de catálogo</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Medio 199</td&gt;<td&gt; Gibco / Invitrogen</td&gt;<td&gt; 12350</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM/F12</td&gt;<td&gt; Gibco / Invitrogen</td&gt;<td&gt; 11320</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Bella pinza (# 55)</td&gt;<td&gt; Herramientas de Ciencias Bellas</td&gt;<td&gt; 11255-20</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Bella pinza (# 5)</td&gt;<td&gt; Herramientas de Ciencias Bellas</td&gt;<td&gt; 11252-30</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pinzas (# 3)</td&gt;<td&gt; Herramientas de Ciencias Bellas</td&gt;<td&gt; 11231-30</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Penicilina G</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; P3032</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Suero bovino fetal</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 10082-139</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Nunc mini bandeja de</td&gt;<td&gt; Fisher</td&gt;<td&gt; 12-565-68</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Adenovirus-GFP</td&gt;<td&gt; Vector Biolabs</td&gt;<td&gt; 1060 *</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cal-Ex descalcificador</td&gt;<td&gt; Fisher</td&gt;<td&gt; CS510-1D</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Borohidruro sódico</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; 452882</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-miosina 7a (policlonal)</td&gt;<td&gt; Proteus Biociencias</td&gt;<td&gt; 25-6790</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-miosina 7a (monoclonal)</td&gt;<td&gt; Estudios del Desarrollo del Banco hibridoma</td&gt;<td&gt; MYO7A 138-1</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-calmodulina</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; C 3545</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-Calbindin</td&gt;<td&gt; Chemicon</td&gt;<td&gt; AB1778</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fluoromount G</td&gt;<td&gt; Southern Biotechnology Asociados</td&gt;<td&gt; 0100-01</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;<p class="jove_content"<strong&gt; Cuadro 1</strong&gt;. Los reactivos y los instrumentos utilizados en la cultura utrículo y la infección por adenovirus.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; * Nota: Ad-GFP es proporcionada normalmente por Vector Biolabs a un título de valores de 1x10<sup&gt; 10</sup&gt; PFU / ml. Se solicitó una amplificación personalizado con el fin de proporcionar el virus de stock a un título de 1,2 x 10<sup&gt; 11</sup&gt; PFU / ml.</p&gt;

la disección de utrículo ratón adulto y mediada por adenovirus infección de reparto de las células

Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

La pérdida de audición y trastornos del equilibrio son a menudo causados ​​por la muerte de las células ciliadas mechanosensory, que son las células receptoras del oído interno. Puesto que no hay una línea celular que representa satisfactoriamente células de mamíferos para el cabello, la investigación sobre las células del cabello se basa en cultivos de órganos primarios. El mejor caracterizado en el sistema modelo in vitro de células maduras de pelo de mamífero utiliza cultivos de órganos de utrículos de ratones adultos (Figura 1) 1-6. El utrículo es un órgano vestibular, y las células ciliadas del utrículo son similares en estructura y función de las células ciliadas del órgano de la audición, el órgano de Corti. El ratón adulto preparación utrículo representa un epitelio sensorial madura para el estudio de las señales moleculares que regulan la supervivencia, la homeostasis y la muerte de estas células. Mamíferos células ciliadas cocleares están terminalmente diferenciados y no se regenera cuando se pierden. En no-Mamvertebrados de Malí, auditiva o vestibular de la muerte de las células ciliadas es seguida por una intensa regeneración que restaura las funciones de la audición y el equilibrio de 7, 8. La regeneración de las células ciliadas está mediada por las células gliales como de apoyo, que hacen contacto con las superficies basolateral de las células ciliadas del epitelio sensorial 9, 10. Las células de apoyo también son importantes mediadores de la supervivencia de las células ciliadas y la muerte 11. Recientemente hemos desarrollado una técnica para la infección de células de soporte en utrículos cultivadas utilizando adenovirus. Utilizando adenovirus tipo 5 (dE1/E3) para entregar un transgén que contiene GFP bajo el control del promotor de CMV, encontramos que el adenovirus específicamente y de manera eficiente infecta células de soporte. Apoyo a la eficiencia de infección de células es de aproximadamente 25-50%, y las células ciliadas no están infectadas (Figura 2). Es importante destacar que nos encontramos con que la infección viral de las células de sostén no da lugar a toxicidad para las células ciliadas o células de apoyo, como el recuento de células en Ad-GFP infutrículos eja son equivalentes a las de las no infectadas utrículos (Figura 3). Así, el adenovirus-mediada por la expresión de genes en células de soporte de utrículos cultivadas proporciona una poderosa herramienta para estudiar las funciones de apoyo a las células como mediadores de la supervivencia de las células ciliadas, la muerte y la regeneración.

Mechanosensory células de pelo son las células receptoras del oído interno. El mejor caracterizado<em&gt; In vitro</em&gt; El sistema modelo de células maduras de pelo de mamífero utiliza cultivos de órganos de utrículos de ratones adultos. Se presenta la disección del utrículo ratón adulto, y demostramos mediada por adenovirus una infección de células de soporte en utrículos cultivadas.

La disección de utrículo ratón adulto y mediada por adenovirus infección de reparto de las células

La pérdida auditiva y los trastornos del equilibrio suelen ser causados por la muerte de las células ciliadas mecanosensoriales, que son las células receptoras del oído interno. Dado que existe...

Esta presentación es una demostración de los procedimientos para cultivos de órganos completos del utrículo de ratones adultos. También se demostrará el uso de adenovirus para infectar las células de sostén del utrículo cultivado. Esto se logra primero mediante la disección cuidadosa del utrículo del oído interno.El segundo paso consiste en eliminar el epitelio del techo. A continuación, se eliminan las otoconias, dejando intacto el epitelio sensorial. El paso final es infectar las células de sostén del sáculo utilizando adenovirus.Estas técnicas pueden utilizarse en una amplia variedad de experimentos diseñados para examinar células pilosas y células de sostén maduras en mamíferos in vitro. Las células receptoras sensoriales en el oído interno se denominan células pilosas, y estas células son responsables de convertir la energía sonora o el movimiento de la cabeza en señales neuronales hacia el cerebro.La pérdida auditiva a menudo es causada por la muerte de estas células ciliadas sensoriales. Con el fin de estudiar los mecanismos que subyacen a la muerte de las células ciliadas sensoriales, es muy útil contar con un sistema de modelo in vitro. El método que demostraremos utiliza cultivos de órganos completos del utrículo de ratones adultos.El utrículo es un órgano vestibular en el oído interno, y las células pilosas del utrículo son similares a las células pilosas del órgano auditivo, que se denomina órgano de Corti. El preparado del utrículo es el sistema modelo mejor caracterizado para estudios de células pilosas y células de sostén de mamíferos adultos. Además, demostraremos un método que nuestro laboratorio ha desarrollado recientemente para utilizar adenovirus y así infectar las células de sostén del utrículo.La técnica del adenovirus permite examinar los roles de las células de sostén como mediadoras en la supervivencia, muerte y regeneración de las células pilosas. Utilizamos estas técnicas en nuestro laboratorio para abordar dos preguntas fundamentales. Primero, ¿cuáles son las señales celulares y moleculares que determinan si una célula pilosa bajo estrés sobrevive o muere?Y en segundo lugar, ¿cómo podemos utilizar esta información para desarrollar terapias, terapias clínicas, que prevengan o reviertan la pérdida auditiva? Lindsey Maye, una bióloga en mi laboratorio, demostrará estas técnicas. La demostración visual de la disección del utrículo es importante porque el tejido es pequeño y frágil, y es muy susceptible al daño mecánico, especialmente durante los pasos de eliminación de las otoconias y del epitelio de cubierta.Después de sacrificar y decapitar un ratón adulto de acuerdo con un protocolo aprobado institucionalmente de cuidado y uso de animales, seccione el cráneo de caudal a rostral y extraiga el cerebro de ambas mitades para revelar el laberinto óseo. A continuación, recorte el cráneo alrededor de la cóclea ósea y transfiera el laberinto óseo a una placa de cultivo tisular de 35 milímetros que contenga medio estéril, 1 99. Si el oído medio (bullae auditiva) aún está intacto, utilice dos pinzas resistentes para romper la bullae.Tómese un momento para identificar los puntos de referencia de la preparación ósea, incluyendo el ápice, la base, los acúleos, las ventanas oval y redonda, la raíz del nervio octavo y los conductos semicirculares, tal como se observa en estas imágenes que se reproducen en el protocolo escrito. Oriente la preparación en el recipiente de manera que los huesecillos estén en la parte inferior del recipiente y la raíz del nervio octavo esté orientada hacia arriba. Utilice pinzas para sostener la preparación en la región de los conductos semicirculares y, con un bisturí con hoja número 11, corte el ápice de la cóclea justo por encima de la raíz nerviosa. Use el conducto semicircular anterior como mango para estabilizar la preparación y gire esta última de modo que la parte cortada quede orientada hacia arriba.Ahora, utilizando pinzas número cinco, retire la cóclea en el modiolo hasta la base. Luego, use una sonda fina hecha con la mitad de un par de pinzas número 55 para levantar el último estante óseo de la lámina espiral ósea. Para revelar la S debajo de la S está la placa basal del estribo.Esta imagen muestra la placa basilar del estribo, etiquetada como sf, que es un punto de referencia importante para identificar la posición del sáculo, etiquetado como U, el cual se encuentra inmediatamente adyacente a la placa basilar del estribo. Utilice la sonda fina para eliminar suficiente hueso y revelar aproximadamente un tercio del sáculo. Luego, usando la pinza número 55, retire cuidadosamente el sáculo sujetándolo muy cerca del borde o en la raíz del nervio.Si el epitelio pigmentado del techo aún está adherido al sáculo, retírelo utilizando pinzas finas. Si se van a utilizar los utrículos para infección con adenovirus, es necesario eliminar las otoconias para hacer esto. Llene una jeringa con medio de disección y colóquele una aguja de calibre 26 o 28.Sujete el utrículo en el borde con pinzas número 55 y las otoconias utilizando un chorro de medio. Alternativamente, las otoconias pueden eliminarse usando una herramienta de pestaña. Una vez que se hayan diseccionado todas las U, cambie el medio de disección por medio de cultivo estéril y coloque la placa en un incubador a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono.Todos los procedimientos con adenovirus se realizan según las precauciones del nivel de bioseguridad dos. Cuando esté listo para infectar, utilice una cureta micro para transferir una célula pilosa utricular a un pocillo de una bandeja sin mini que contenga 15 microlitros de D-M-E-M-F 12 sin suero. Añada de una a cuatro veces 10 a la séptima unidades formadoras de placas de adenovirus al pocillo que contiene el cultivo utricular.Se incuban los u triclos y el medio que contiene virus a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono en una cámara humedecida durante dos horas. Después de dos horas, se transfieren los u triclos a una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos que contiene medio de cultivo con suero. Una vez transferidos, los u triclos se cultivan nuevamente durante la noche a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono.Los utrículos pueden usarse al día siguiente para experimentos de imágenes en vivo, o pueden fijarse para inmunoquímica. Los utrículos se fijan en paraformaldehído al 4% en una plataforma agitadora durante tres horas a temperatura ambiente o durante la noche a cuatro grados Celsius. A continuación, lave el utrículo tres veces durante 15 minutos cada vez en tampón fosfato sorenson 0,1 molar.Si los otocónitos no se eliminaron para la infección con adenovirus, retírelos en este momento sumergiendo el utrículo en calx decalcify durante uno o dos minutos, luego lave con solución tampón fosfato de soren 0,1 molar e inmerja el utrículo en la solución bloqueadora durante tres horas a temperatura ambiente. Después del paso de bloqueo, diluya el anticuerpo primario en la solución bloqueadora. Añada a la placa que contiene los utrículos y incube durante la noche a cuatro grados Celsius.Al día siguiente, lave los utrículos y las sáculos con tampón fosfato. A continuación, añada el anticuerpo secundario diluido en la solución de bloqueo e incube durante cuatro horas protegido de la luz a temperatura ambiente sobre una plataforma oscilante. Por último, monte el utrículo sobre portaobjetos de vidrio utilizando Flora Mount G. Estas imágenes confocales muestran la capa de células pilosas y la capa de células de sostén en la misma zona de un utrículo infectado con adenovirus que induce la expresión de la proteína verde fluorescente.Las células pilosas están marcadas con un anticuerpo contra la miosina siete A, que aparece en magenta. Las células de sostén están marcadas con un anticuerpo contra socks, dos, que aparece en rojo aquí. Puede observarse que el GFP del adenovirus se localiza en las células de sostén y no en las células pilosas.Este gráfico demuestra que la infección adenoviral con adenovirus GFP a cuatro veces 10 a la octava. Unidades formadoras de placas por mililitro no provoca la muerte de las células pilosas ni de las células de sostén una vez dominada la disección. Ambos uráculos de un animal pueden colocarse en cultivo en 10 a 15 minutos.Sin embargo, es importante que, mientras se desarrolla este procedimiento, se tenga paciencia y se tenga cuidado al manipular el tejido tras seguir este protocolo. Se pueden realizar otros métodos como la imagen confocal en vivo, inmunohistoquímica, R-T-P-C-R y Western blot para abordar preguntas relacionadas con la muerte, supervivencia y regeneración de las células de sostén y las células pilosas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseccionar el utrículo e infectar las células de sostén utilizando adenovirus.Recuerde que trabajar con virus puede ser peligroso y representa riesgos para la seguridad biológica. Siempre se deben tomar precauciones de nivel dos cuando se realizan estos procedimientos.

dissection-adult-mouse-utricle-adenovirus-mediated-supporting-cell

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

En este vídeo se utiliza un adenovirus que porta el gen de la recombinasa Cre para infectar fibroblastos primarios de embriones de ratón que lleva un alelo floxed Rac1.

Mediada por adenovirus eliminación de moléculas de señalización genética en cultivos de fibroblastos de embriones de ratón primaria

Un método de rastreo de neuronas conectadas sinápticamente se describe. Usamos especificidad TVA de una célula de aguas arriba para probar si una población celular de interés recibe la entrada sináptica de tipos de células genéticamente definidos.

Trazado de Circuitos Viral genéticamente definidos Neural

El abordaje quirúrgico postauricular descrito permite una administración rápida y directa en el lápido timpático coclear del ratón, al tiempo que minimiza la pérdida de sangre y la mortalidad animal. Este método se puede utilizar para la terapia coclear mediante la administración molecular, farmacológica y viral a ratones posnatales a través de la membrana de la ventana redonda.

Método quirúrgico para la entrega de genes mediada por virus de la oreja del ratón Interior a través de la ventana de membrana Ronda

Se presenta un método para aislar el órgano de Corti adultos como tres vueltas intactas cocleares (ápice, medio y de base). También demostramos un procedimiento de inmunotinción con anticuerpos marcados con fluorescencia. En conjunto, estas técnicas permiten el estudio de las células ciliadas, células de soporte, y otros tipos de células que se encuentra en la cóclea.

Todo el montaje La disección y de inmunofluorescencia del Adulto ratón cóclea

En este informe, se destacan las ventajas de las culturas organotypic y disociadas cultivos primarios de ganglios de raíz dorsal derivadas de ratón para investigar una amplia gama de mecanismos asociados a la interacción neuronal-glial, neuroplasticidad, neuroinflamación y la respuesta a la infección viral.

Ratón adulto DRG explante y disociado modelos celulares para investigar respuestas a insultos ambientales incluyendo infección Viral y la neuroplasticidad

Aquí describimos el procedimiento de canalostomy que permite la entrega del local de la droga en los oídos interiores de ratones adultos y neonatales a través del canal semicircular con mínimo daño a la función auditiva y vestibular. Este método puede utilizarse para inocular vectores virales, productos farmacéuticos y pequeñas moléculas en el oído interno de ratón.

Canalostomy como un abordaje quirúrgico a la entrega del Local de la droga en los oídos interiores de ratones adultos y Neonatal

Culturas organotypic tridimensional del utrículo murino y cóclea en ópticamente claro colágeno geles preservar tejido natural morfología, permiten estimulación mecánica mediante ajuste de la rigidez de la matriz y permitan de genes mediada por virus.

Culturas Organotypic tridimensionales de órganos sensoriales vestibulares y auditivas

Este protocolo describe el proceso de generación y caracterización de organoides uroteliales de ratón que albergan deleciones en genes de interés. Los métodos incluyen la recolección de células uroteliales de ratón, la transducción ex vivo con adenovirus que impulsa la expresión de Cre con un promotor de CMV y la caracterización in vitro e in vivo.

Ex Vivo Modelo organoide de deleciones genéticas mediadas por adenovirus-Cre en células uroteliales de ratón

Se describen métodos para la generación de grandes cantidades de adenovirus recombinantes, que luego se pueden utilizar para transducir el urotelio nativo de roedores permitiendo la expresión de transgenes o la regulación a la baja de productos génicos endógenos.

Expresión de transgenes en urotelio de vejiga nativa mediante transducción mediada por adenovirus

La estría vascular es vital para la generación de potencial endococlear. Aquí, presentamos la disección de la estría vascular del ratón adulto para la secuenciación de un solo núcleo o inmunotinción.

Disección de estrías vasculares de ratón adulto para secuenciación de un solo núcleo o inmunotinción

Aprende a disecar el utrículo de ratón adulto e infectar células de soporte con adenovirus para estudiar la biología de células ciliadas y regeneración auditiva. Este método permite investigar la supervivencia celular in vitro.

La disección de utrículo ratón adulto y mediada por adenovirus infección de reparto de las células

Explorar más videos