La generación de células T reguladoras inducidas de células humanas primarias T vírgenes y de memoria

El objetivo general de este procedimiento es generar linfocitos T reguladores humanos a partir de linfocitos T primarios. Primero, se aíslan las células mononucleares de la sangre periférica a partir de muestras de sangre humana. Luego, los linfocitos T positivos para CD4 se purifican a partir de la mezcla de PBMC y se cultivan.

Después de seis días, las células se clasifican en subpoblaciones de células T efectoras, de memoria naïve y reguladoras inducidas mediante un citómetro de flujo; se realizan ensayos de supresión. Mediante el uso de estas células, se demuestra que este método genera células T reguladoras humanas con actividad supresora. Las principales ventajas de esta técnica frente a las que utilizan células mononucleadas es que nuestro método humano tiene una mayor relevancia fisiológica y clínica y permite la comparación de las células Treg con otras poblaciones celulares dentro de un mismo donante.

Eliminación de la variabilidad intra-sujeto. Este método puede responder preguntas clave en el campo de las células reguladoras, como cuáles son los eventos reguladores que modulan la transición entre linfocitos T convencionales y células reguladoras, o cuáles son los eventos de señalización y transcripcionales específicos de las células reguladoras. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia las terapias de enfermedades autoinmunes, afecciones inflamatorias y cáncer debido al papel fundamental que desempeñan las células reguladoras en la homeostasis inmunitaria.

Generalmente, las personas nuevas en esta técnica enfrentan dificultades debido a la variedad de métodos utilizados y a la estrecha ventana de condiciones óptimas de cultivo celular en algunos pasos. Aunque este método puede proporcionar información sobre el desarrollo de reg, también puede emplearse para monitorear la plasticidad de la diferenciación de linaje de linfocitos T o para analizar la capacidad del entorno de los linfocitos T para inducir o prevenir dicho desarrollo. Demostrando el procedimiento estarán Andrea McCool y los estudiantes de posgrado Marie Catherine Ranier Gavin Ellis, y Catalina Vale Ortega.

Comience este procedimiento aislando células mononucleares de sangre periférica humana de 40 a 60 litros de capa leucocitaria B; para diluir la capa leucocitaria, transfiérala a una botella de vidrio autoclavable de 500 mililitros que contenga 150 mililitros de PBS estéril. A continuación, agregue más PBS estéril para llevar el volumen final a 250 mililitros. Luego, llene 10 tubos cónicos de 50 mililitros, cada uno con 20 mililitros de solución lympho prep.

Luego, coloque suavemente encima de la solución Lympho prep 25 mililitros del capa leucocitaria diluida. Tenga cuidado de no perturbar la solución Lympho prep. Centrifugue los tubos durante 30 minutos a temperatura ambiente a 500 veces G. Asegúrese de desactivar el freno de la centrifugadora para no perturbar la fracción de linfocitos.

Tras la centrifugación, el CS de PBM se encontrará en la interfase entre las capas del medio de linfoprep y el plasma para recolectarlos. Aspire el medio plasmático hasta que quede aproximadamente un mililitro cubriendo la capa de buffy coat que contiene los pbmc. Utilice una pipeta de 10 mililitros para transferir los pbmc a un nuevo tubo de 50 mililitros.

Después de lavar las células dos veces con PBS, resuspéndalas en 50 mililitros de RPMI frío y cuéntelas utilizando un hemocitómetro. La recuperación típica es de ocho por 10 a la octava hasta uno por 10 a la novena PBMC después de haberse determinado la concentración. Resuspenda los PBMC a una concentración final de cinco por 10 a la séptima por mililitro en PBS que contenga 2 % FBS y un milimolar de EDTA, y transfiera las células a un tubo nuevo de polipropileno de fondo redondo de 14 mililitros.

A continuación, se utilizará el kit de AE para seleccionar negativamente las células de interés. Los cócteles de enriquecimiento de linfocitos T proporcionados con el kit contienen un complejo tetramérico de anticuerpos, que posee un anticuerpo anti-dextrina en un extremo y un anticuerpo contra antígenos de superficie celular no deseados en el otro extremo. Cuando se añade el cóctel a las células, el complejo tetramérico de anticuerpos une las células no deseadas.

Se añaden entonces partículas magnéticas recubiertas con dextrano, que se unen al complejo tetramérico de anticuerpos, conectando la célula no deseada a la partícula magnética. A continuación, se aplica un imán para separar las células no deseadas de las células de interés, las cuales se recolectan para aislar los linfocitos T CD4 positivos. Pipetee de una vez 10 a la octava hasta 4,25 veces 10 a la octava pbmc en un tubo cónico de 15 mililitros. Luego, agregue 50 microlitros del cóctel de enriquecimiento de linfocitos T CD4 positivos humanos, compuesto por anticuerpos, por cada mililitro de pbmc.

Mezcle e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente. Mezcle las partículas magnéticas para distribuirlas uniformemente a través de la solución. Añada 100 microlitros de partículas magnéticas por cada mililitro de pbmc.

Mezcle pipetando suavemente dos o tres veces y luego incube a temperatura ambiente durante 10 minutos. Añada PBS que contenga FBS y EDTA para llevar el volumen hasta 10 mililitros por tubo, mezclando mediante pipeteo suave dos o tres veces. A continuación, coloque el tubo sin tapar en el imán cept durante cinco minutos, manteniendo el tubo dentro del imán.

Vierta el líquido en un nuevo tubo de 50 mililitros para aislar las células de interés y obtener una mejor recuperación. Repita este proceso agregando P-B-S-F-B-S-E-D-T-A adicional al tubo, mezclando y colocando nuevamente la muestra en el imán. Una vez que las células hayan sido aisladas, cuéntelas y luego centrifúguelas a 500 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente.

ReSuspender el pellet celular en medio de polarización para alcanzar una concentración de dos veces 10 a la seis células por mililitro. A continuación, proceda al cultivo como se describe en la siguiente sección del video para inducir células T reguladoras. Precalentar placas de cultivo tisular de seis pocillos recubiertas con anti-CD3 a 37 grados Celsius.

Una vez que las placas estén tibias, aspire el PBS de los pocillos. A continuación, agregue cuatro mililitros de la suspensión celular enriquecida en CD4 positivo a cada uno. Llene con PBS cualquier pocillo vacío para reducir la evaporación del medio e incube durante tres días tras la incubación.

Centrifugar la placa durante cinco minutos a 500 ×g. Luego, sin perturbar las células en el fondo de la placa, retirar la mitad del medio y reemplazarlo con medio fresco; incubar durante dos o tres días más. Ahora las células pueden separarse mediante citometría de flujo activada por fluorescencia, como se describe en la siguiente sección, o utilizarse como células diana para un ensayo de supresión, como se describe más adelante. Después de transcurridos dos o tres días, se preparan las células y los controles de compensación apropiados para la citometría de flujo activada por fluorescencia. Para separar mediante citometría las células T reguladoras inducidas, naïve y de memoria, marcar las células a separar con anti-CD25 PE, anti-CD45RA PE-Cy5 y anti-CD127 APC, como se describe en el documento adjunto.

Asegúrese también de agregar anticuerpos a los controles de compensación apropiados para el análisis de fax. Después de la tinción, re suspenda las células a una concentración de uno por diez a la siete células por mililitro de tampón de lavado, luego agregue 1.5 microlitros de DNAs dos por mililitro de células y filtre las células a través de un filtro celular de nailon de 40 micrones. Transfiera las células a tubos de polipropileno redondos de cinco mililitros con no más de 3.5 mililitros por tubo.

Re-suspenda las células de control de compensación en 300 microlitros de tampón de lavado. Ajuste la compensación en el citómetro de flujo para minimizar la detección cruzada por los filtros PE, A PC y PE sci-fi. Establezca las compuertas para clasificar las células T reguladoras, las células T naïve y las células T de memoria en tubos redondos de poliestireno de cinco mililitros que contengan un mililitro de suero de ternero recién nacido, con el fin de evaluar si las células T reguladoras generadas durante la clasificación son capaces de suprimir la proliferación de las células T.

Se realiza aquí un ensayo de supresión. Las células enriquecidas CD4 positivas no ordenadas funcionarán como células diana. Estas no deben contener linfocitos T reguladores inducidos CD25 positivos.

Comience etiquetando las células diana con CFSE utilizando un kit de trazado celular según las instrucciones del fabricante, usando un microlitro de solución stock de cinco moles por mililitro de células en lugar de dos microlitros. A continuación, haga un pellet de un número de perlas inspectoras de supresión de treg igual al número total de células mediante centrifugación rápida en un tubo de microcentrífuga. Lave las perlas una vez con RPMI y vuelva a hacer el pellet tras la centrifugación.

Aspire el RPMI y resuspenda en la concentración adecuada en ocho microlitros de medio de ensayo de supresión por pocillo, en una placa de cultivo celular de fondo redondo de 96 pocillos. Añada ocho microlitros de células diana marcadas con CFSE. Inspeccione las perlas y las células ordenadas polarizadas hasta un volumen final de ensayo de supresión fresco.

Medio de 200 microlitros. Todas las condiciones se siembran por triplicado. Para preparar los controles, agregue 100 microlitros de células marcadas con CFSE, ocho microlitros de microesferas indicadoras y una vez 10 a la quinta de células frescas no marcadas en 92 microlitros de ensayo de supresión.

Medio por pocillo a los dos primeros pocillos de control. Luego añada 100 microlitros de células marcadas con CFSE y una vez 10 a la quinta de células frescas no marcadas en 92 microlitros de ensayo de supresión. Medio por pocillo a los dos siguientes pocillos de control.

Cubra la placa con papel de aluminio y colóquela en el incubador durante cinco días en la oscuridad. Recolecte las células de cada pocillo mediante pipeteo y colóquelas en un tubo de poliestireno redondo de cinco mililitros. Centrifugue las células a 500 veces G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius.

Aspire el medio y reuspenda las células en 300 microlitros de tampón de lavado frío. Para monitorear el progreso de la diferenciación de linfocitos T reguladores inducidos, se cultivaron linfocitos T primarios humanos purificados CD4 positivos CD25 negativos en medio iTreg; se tomaron alícuotas en los días 0, 1, 3 y 5, y se analizaron mediante citometría de flujo para evaluar la expresión de los marcadores CD45RA, FoxP3, CTLA-4 y CD25. Como se puede observar en estos gráficos de puntos en pseudocolor durante un curso temporal de cinco días, las células proliferan y se diferencian in vitro en respuesta al entrecruzamiento de CD3 en presencia de TGF-beta e IL-2, conduciendo finalmente a un perfil CD45RA negativo, FoxP3 alto, CTLA-4 alto y CD25 alto. Esto indica el desarrollo de linfocitos T reguladores inducidos a partir de precursores de linfocitos T convencionales. Para evaluar la capacidad relativa de los linfocitos T reguladores generados para suprimir la proliferación de linfocitos T.

Las células marcadas con CFSE se cultivaron con perlas inspectoras de supresión de treg en presencia de células T reguladoras de memoria y naïve ordenadas, como se puede observar en este histograma. Células CD 25 alta, CD 45 RA negativa CD 1 27 negativa. Las células T reguladoras inducidas bajas son el único subconjunto proveniente de un cultivo de cinco días que ha adquirido capacidad supresora reguladora.

Esto indica que las células generadas en este sistema son linfocitos T reguladores supresores tanto fenotípica como funcionalmente, y no linfocitos T convencionales activados, que pueden expresar transitoriamente FOX P tres y CD 25, pero que no son inmunosupresores. La presencia de linfocitos T reguladores inducidos abole completamente la proliferación de linfocitos T positivos para CD cuatro. Los números indican el porcentaje de células marcadas con CFSC que han realizado división, para determinar que lo mismo es válido para los subconjuntos purificados de linfocitos T.

Los linfocitos T primarios humanos naïve y de memoria fueron marcados con CFSE y cultivados en este medio. Después de cinco días en medio para Treg, las células fueron fenotipificadas y las tasas de división celular fueron estimadas según se observó. Aquí, los Treg fueron inducidos a partir de un grupo de linfocitos T naïve y de un grupo de linfocitos T de memoria tras un cultivo de cinco días.

En medio estándar de cultivo IT, tinción con CFSE. La tinción de las células iniciales muestra que tanto las células T naïve como las de memoria se diferencian en células T reguladoras solo tras varias rondas de división celular; los perfiles comparativos de tinción con CFSE identifican a las células T reguladoras inducidas como las células más proliferativas durante el cultivo de cinco días. Tras ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo obtener células T reguladoras inducidas a partir de una población de células T naïve, de memoria o totales obtenidas de un único donante mientras se realiza este procedimiento.

Es importante mantener una técnica estéril durante todo el procedimiento y evitar la exposición de la CFSE a la luz tras seguir este protocolo. Se pueden realizar otros métodos, como ensayos funcionales, para responder otras preguntas, como cuáles son las diferencias en las tasas de división celular, la síntesis específica de citocinas y el uso de canales iónicos entre linfocitos T reguladores y convencionales tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la inmunología exploraran enfermedades autoinmunes y otras patologías relacionadas con las células T reguladoras en pacientes humanos.

No olvide que trabajar con sangre humana es extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones, como realizar pruebas adecuadas en bancos de sangre y desechar los materiales de manera apropiada durante este procedimiento.