Una técnica simplificada para

Hoy estamos demostrando una técnica simplificada para extraer tejido corneal y retiniano de un globo ocular humano procedente de donantes cadavéricos. La técnica descrita en este trabajo ayudará a obtener tejido de buena calidad para su uso en trasplantes, cirugía y fines de investigación, sin dañar otros tejidos del globo ocular. Con 18 años de experiencia y miles de córneas trasplantadas cada año, hemos mantenido un alto estándar en nuestro trabajo mediante el desarrollo de nuevas técnicas y la mejora continua de nuestras habilidades.

Para lograr esto, primero ejercitamos la córnea, seguido de los eviscerados retinianos. La córnea es un tejido avascular que permite la transmisión de la luz hacia la retina, y para este fin, debe mantener siempre un buen grado de transparencia. La córnea consta de cinco capas: el epitelio, la capa de Bowman, el estroma, la membrana de Descemet y el endotelio.

Si la córnea está dañada, puede ser reemplazada con la ayuda de una córnea donante adecuada. La coroides es la túnica intermedia entre la esclerótica y la retina, limitada internamente por la membrana de Bruch, y es responsable del flujo sanguíneo en el ojo. La evisceración adecuada de la coroides es tan importante como la eliminación de la retina.

La retina ayuda a recibir la luz proveniente de la córnea y del cristalino y la convierte en energía química que finalmente se transmite al cerebro. Con la ayuda del nervio óptico, que es transparente y delicado, debe extraerse sistemáticamente para obtener un tejido de buena calidad. Encienda el gabinete de flujo laminar.

Limpie la cabina de flujo laminar utilizando alcohol isopropílico al 70%. Póngase ropa protectora personal, como gorro quirúrgico, guantes estériles y mangas protectoras. Utilizando técnica aséptica, prepare el campo estéril colocando un paño estéril y una bandeja de instrumentos previamente esterilizada.

Abrir asépticamente la bandeja de instrumentos estériles y colocarla sobre el campo estéril, evitando cualquier contaminación. Colocar todos los materiales e instrumentos estériles dentro del campo estéril y disponer los frascos con los globos oculares de forma que queden alejados del borde del campo estéril. Para facilitar su uso, rotular las botellas con el medio de almacenamiento previamente preparado y colocar la tapa de yodo poliol piro sobre el tiosulfato de sodio, así como una solución estéril de tampón salino fosfato.

Fuera del alimento estéril, deje que los tejidos oculares y las soluciones alcancen la temperatura ambiente normal, ya que se conservan en refrigeradores a cuatro grados Celsius. Evite ciclos repetidos de calentamiento o enfriamiento. Retire las gasas y esponjas del frasco del ojo utilizando pinzas estériles.

Coloque el globo ocular sobre el párpado y retire los vendajes adicionales. Tome cuidadosamente el globo ocular con el nervio óptico e introdúzcalo en IPVP estéril. Descontamine los globos oculares en IPVP estéril durante dos minutos.

Transfiera el globo a sulfato de sodio estéril durante un minuto. Transfiera los globos a solución estéril de línea celular en tampón fosfato y déjelos hasta que se manipulen. Trabajando bajo la cabina de flujo laminar, lave y retire el globo ocular del PBS y colóquelo bajo el campo estéril.

Envuelva el globo ocular con esteroide, dejando la córnea y aproximadamente cinco milímetros de esclera desde la córnea sin cubrir; el bulbo ocular puede mantenerse simplemente con la mano. Mantenga la presión adecuada utilizando tijeras estériles. Retire todos los restos eventuales de la conjuntiva sin dañar la córnea.

Utilice una hoja de bisturí desechable para realizar una incisión escleral de tres a cuatro milímetros desde la región del limbo. Luego, extienda la incisión 360 grados, evitando perforar el tejido uveal subyacente o causar cualquier deformación de la curvatura normal de la córnea. Realice cuatro incisiones grandes dejando cuatro pequeños espacios, evitando la secreción del cuerpo vítreo.

Se cortan las cuatro brechas, asegurando que no se elimine ningún otro tejido. La presencia de pequeñas placas esclerales puede dificultar el corte, por lo que debe asegurarse la finalización de la escisión escleral con tijeras de microcirugía. Esta operación debe realizarse sin dañar la retina coroidea ni el cuerpo vítreo.

Inspeccione la incisión para asegurarse de que esté completa. Si la incisión se ha realizado correctamente, el borde esclerocorneal permanece adherido al cuerpo ciliar únicamente en el punto correspondiente a la córnea; coloque el ojo con el borde hacia abajo cerca del centro del campo estéril. Finalice la extracción de la córnea utilizando pinzas estériles.

Mantenga el borde escleral estacionario y excise el borde corneoescleral desde el brillo ocular. Separe suavemente cualquier tejido adyacente restante del botón corneoescleral. Nunca tire del borde corneoescleral de forma que pueda causar tensión cruzada en la córnea, ni permita que vuelva a caer sobre la cámara anterior.

La densidad de células endoteliales de la córnea se verifica utilizando una solución hipotónica y la mortalidad celular mediante tinción con trip y azul durante aproximadamente un minuto. Retire la tinción con trip y azul sobre una rejilla de alambre estéril y lave la córnea en PBS estéril. Transfiera la córnea a una placa de Petri estéril que contenga solución de sacarosa.

Esta solución ayuda a crear un ambiente hipotónico y permite identificar visualmente las células. Las células se cuentan luego bajo un microscopio óptico con una magnificación de cien veces y se miden en células por milímetro cuadrado. Por lo general, se examinan en busca de densidad celular y características morfológicas como bordes intercelulares, polimorfismo, degeneración, distrofia y mortalidad celular.

El grosor corneal también es una característica importante para el trasplante, junto con una buena tasa de transparencia de la córnea extirpada. Se utiliza un CLO corneal estéril para fijar la córnea en el borde escleral, doblando el CLO corneal para asegurar una abertura del orificio suficiente para bloquear el borde escleral, y se transfiere el borde esclerocorneal utilizando una pinza corneal al medio de almacenamiento corneal previamente preparado, mantenido a temperatura ambiente. A continuación, la córnea debe conservarse a 31 grados SIUs durante cuatro semanas de preservación.

El medio de almacenamiento se somete a varias pruebas microbiológicas utilizando un instrumento B 9 2 4 0. Durante el almacenamiento, la córnea aumenta su grosor respecto al tamaño habitual necesario para el trasplante. Los bancos de ojos utilizan agentes deshinchantes D para reducir el grosor; se emplea 6% Dextron T 500 para devolver la córnea a su tamaño normal y como medio de transporte.

Limpie los instrumentos estériles con la aplicación para ARN para crear un entorno libre de AR antes de la escisión retiniana. Prepare el campo estéril y asegúrese de que el globo ocular esté intacto y de que solo se haya removido la córnea y el borde escleral. Si el cuerpo vítreo está secretando, se dificulta la eliminación del tejido retiniano.

Si el donante tiene menos de 65 años de edad, la esclerótica se conserva en alcohol al 70 % con fines quirúrgicos tras realizar las pruebas serológicas. En tales casos, no se corta la esclerótica, solo se elimina el cuerpo vítreo y toda la esclerótica se conserva para la escisión retiniana. Comience con un corte pequeño o incisión cerca del lado corneal de la esclerótica, avanzando hacia el nervio óptico utilizando fórceps y tijeras estériles.

Sostenga la parte de la esclerótica con pinzas estériles y corte con las tijeras en línea recta hacia la parte del nervio óptico, evitando dañar el cuerpo vítreo. Los tapones coroideos deben separarse de la esclerótica ya que están adheridos. Corte toda la esclerótica para exponer el tejido coroideo. ¿Qué?

Una vez que la esclerótica esté completamente cortada, separe la esclerótica con los tejidos restantes cortándola cerca del nervio óptico; ahora será visible una capa completa de coroides que recubre el cuerpo vítreo. Llene estos tubos estériles libres de RNAsas con dos ml de RL más adelante utilizando dos pinzas estériles. Retire suavemente la capa de coroides sujetando el nervio óptico con un par de pinzas y eliminando el coroides con la otra.

Separar parcialmente la coroides y cortarla para facilitar su eliminación. La capa coroidea puede cortarse con tijeras, evitando dañar la retina. Colocar la capa coroidea extraída en solución de RNA later y conservarla a cuatro grados Celsius durante 24 horas.

Elimine todo el coroides adicional para exponer el tejido retiniano. Una vez que se haya eliminado toda la capa de coroides, se observará una capa transparente de retina. Es evidente que la capa de coroides tiene una membrana de Bruch interna, que también podría eliminarse, pero es difícil identificarla a simple vista.

De manera similar, use dos pinzas para retirar la capa retiniana. Es fácil aislar una gran cantidad de retina si se secciona cerca del nervio óptico. Ahora se pueden observar todas las capas del ojo.

Coloque la retina extirpada dentro de la solución de RNA later y conserve a cuatro grados Celsius durante 24 horas. Limpie el área de trabajo utilizando alcohol de propilenglicol al 70 %. Las células endoteliales teñidas con trip y azul pueden observarse bajo un aumento de cien veces en un microscopio invertido.

Una córnea adecuada con más de 200 células por milímetro cuadrado generalmente se conserva para usos posteriores. Calificarlas desde una calidad regular hasta excelente será útil para estudios comparativos. Habitualmente, una vez que la córnea está lista para trasplante, se anotan el espesor y la transparencia, y se utiliza una córnea adecuada para queratoplastia penetrante, en la que se transplanta toda la córnea.

La mortalidad celular se verifica observando las células teñidas de azul y se califica como porcentaje de células muertas. Una mortalidad celular general superior al 2 % se considera inadecuada durante la preservación. Si la densidad celular es inferior a 2200 células por milímetro cuadrado o si hay daño debido a la mortalidad, la córnea podría utilizarse para queratoplastia laminar anterior.

Si el trauma anterior está dañado y la córnea tiene una buena densidad de células endoteliales, la córnea podría utilizarse para queratoplastia laminar posterior. El grosor de la córnea generalmente aumenta durante el cultivo de órganos. El medio de transporte ayuda a recuperar su forma y estructura normales.

Además, el cultivo de órganos favorece la reepitelización de la córnea y, debido a su largo período de almacenamiento, permite una adecuada selección del donante. Pruebas microbiológicas y serológicas. Proporciona tiempo suficiente para programar una cirugía y ayuda a evaluar la densidad y morfología de las células endoteliales cuando no es posible hacerlo debido a un elevado tiempo post mortem.

Por lo tanto, si se sigue el procedimiento tal como se describe, se pueden excisar las córneas sin ningún daño a otros tejidos. Si la córnea no es adecuada para trasplante, podría utilizarse con fines de investigación para desarrollar un nuevo medio y condiciones de preservación, para estudiar enfermedades de la superficie ocular, para aislar células madre limbales y para investigar el efecto de fármacos sobre la córnea. En el caso de la retina, podemos evitar la contaminación cruzada de muestras de ARN con tejidos centrales y preservar la integridad del ARN, lo cual es de importancia fundamental.

Estos tejidos indispensables para fines de investigación tienen como objetivo caracterizar el transcriptoma de los tejidos oculares, aislar células madre para proyectos de medicina regenerativa y evaluar las diferencias histológicas entre tejidos de sujetos normales o afectados. Una vez que se ha extraído el tejido retiniano, este puede utilizarse para diferentes fines y, por lo tanto, los pasos y condiciones subsiguientes para su conservación pueden variar en consecuencia. Por ejemplo, el tejido retiniano puede colocarse en tubos que contienen reactivos de estabilización del ARN, como r nator o buffer thisis, para la extracción de ARN o ADN, o bien en tripsina o solución desplazante para el aislamiento de células.

Soluciones de fijación previas a la inclusión de tejidos en parafina u OCT para inmunohistoquímica. Gracias por ver este video y buena suerte con su investigación.