La cromatina Análisis de Interacción con la etiqueta de secuenciación pareadas final (Chia-PET) para el mapeo de la cromatina y la comprensión de las interacciones Reglamento Transcripción

El análisis de interacción COMIN mediante secuenciación de polvo y etiquetado es un método para el análisis a nivel genómico de interacciones COMIN a largo alcance. En resumen, llamamos a esto almohadilla mágica compartida. Este método implica muchos pasos de biología molecular y puede resultar complicado.

Por lo tanto, en este siguiente video, le mostraremos algunos de los pasos clave involucrados en la inmunoprecipitación, y en la construcción de la biblioteca para el análisis PET de cromatina. La inmunoprecipitación de cromatina, conocida como ChIP, es el primer paso crítico en la construcción de una biblioteca ChIP-PET. Aquí, muestras de cromatina procedentes de cultivos celulares se entrecruzan, se sonican y se inmunoprecipitan.

Posteriormente, alícuotas separadas de ADN de la muestra se ligarán a semienlazadores con códigos de barras y se realiza la ligación por proximidad. Las PET se liberan mediante digestión con enzimas de restricción, se purifican en perlas magnéticas recubiertas y se ligarán a adaptadores para secuenciación de nueva generación. Las PET quiméricas se identifican mediante la composición del enlazador AB y el marcado flanqueante.

La secuencia del conector central se lee y se mapea al genoma. En este video, mostraremos el protocolo estándar de chip utilizado rutinariamente en nuestro laboratorio en una línea celular de cáncer de mama MCF7. Según nuestros datos, un mayor enriquecimiento en chip con anticuerpos específicos produce mejores datos de chair pet. Por lo tanto, recomendamos encarecidamente la optimización del protocolo de chip y la validación del enriquecimiento mediante QPCR.

Antes de proceder a la construcción de la biblioteca de cromatina, se cultivan siete líneas celulares hasta alcanzar aproximadamente un 75 % de confluencia en un recipiente de cultivo de tejidos de 500 centímetros cuadrados, lo que contiene aproximadamente 20 millones de células antes del entrecruzamiento. Descarte el medio de crecimiento y lave las células dos veces. Con PBS tibio, fije las células con EGS recién preparado 1,5 milimolar durante 45 minutos en un rotador a temperatura ambiente y agregue formaldehído al 37 % para obtener una concentración final del 1 % e incube durante 20 minutos.

La eficiencia de entrecruzamiento es crítica y varía según las líneas celulares y la proteína de interés. Debe optimizarse la concentración, el tiempo de incubación y la temperatura del entrecruzamiento. Inhiba los entrecruzadores con una concentración final de 200 milimolar de glicina durante 10 minutos.

Descarte los agentes de reticulación apagados y lave dos veces con PBS frío. Recupere las células raspando el botón celular con una centrífuga de banco refrigerada. El botón está ahora listo para la lisis celular. Alternativamente, congele el botón a menos 80 grados Celsius. Si el botón celular está congelado, descongele sobre hielo antes de proceder con la lisis celular y reconstituya el botón con tampón de lisis al 0,1 % SDS.

Gire el tubo a cuatro grados Celsius con una centrífuga refrigerada, deseche el sobrenadante y repita la lisis celular. Una vez realizada la lisis nuclear para liberar la cromatina entrecruzada antes de la fragmentación de la cromatina. La ausencia de la membrana nuclear permite que la cromatina entrecruzada sea sonicada bajo condiciones más suaves.

Reúna la paleta nuclear en tampón de lisis con SDS al 1%. Transfiera la suspensión a un tubo para centrífuga de alta velocidad. Gire el tubo a cuatro grados Celsius.

Elimine los restos nucleares mediante centrifugación. La paleta cromática debe tener este aspecto. Utilice una punta de pipeta P1000 para desagregar la paleta en fragmentos y lávela dos veces con tampón de lisis SDS al 0,1 %.

Centrifugue el tubo a cuatro grados Celsius con una centrífuga refrigerada. El sobrenadante nuclear ya está listo para la sonicación. Alternativamente, congele el sobrenadante a menos 80 grados Celsius.

Transfiera el paladar a un tubo transparente. Añada tampón de lisis con SDS al 0,1 % al paladar y elimine todas las burbujas. Mantenga las muestras frías durante toda la sonicación para evitar el sobrecalentamiento. Diferentes condiciones, como el volumen del tampón, la profundidad de la sonda, la intensidad de la sonicación, el número de ciclos y el grado de reticulación, pueden influir en la eficiencia de la sonicación.

Realice la reversión del entrecruzamiento y una alícuota de cromatina utilizando proteína K y ejecute un gel aros. Para verificar la eficiencia de la fragmentación, se recomienda la optimización para obtener el rango deseado de tamaño de ADN entre 200 y 600 pares de bases. Elimine los restos celulares mediante centrifugación.

El cromatina ya está listo para ser preclearado con perlas magnéticas. Alternativamente, se puede detener a menos 80 grados Celsius hasta que se recoja suficiente cromatina. Para iniciar un chip, lave las perlas tres veces con tampón de lavado de perlas; este y los futuros lavados que involucren perlas magnéticas de proteínas consisten en los siguientes pasos.

Añada cromatina sonicada a las perlas precocidas y incube durante la noche a cuatro grados Celsius en un tubo separado. Recubra las perlas precocidas con anticuerpo e incube durante la noche a cuatro grados Celsius. Lave las perlas recubiertas con anticuerpo dos veces con tampón de lavado de perlas.

La alta complejidad del sustrato para la ligación por proximidad inevitablemente conduce a un ruido no específico considerable, aumentando así el costo del secuenciamiento. Además de reducir el nivel de complejidad y el ruido de fondo, utilizamos un anticuerpo monoclonal contra la ARN polimerasa dos de ratón para identificar interacciones de cromatina implicadas en la regulación de la transcripción.

Esto permite la investigación de promotores activos y sus regiones reguladoras correspondientes, lo que posibilita comprender la transcripción eficiente y posiblemente cooperativa. Deseche el tampón de lavado de las perlas recubiertas con anticuerpo, combine la cromatina preclearada con las perlas recubiertas con anticuerpo e incube durante la noche a cuatro grados Celsius. Tras la incubación nocturna, las perlas se someten a una serie de lavados para eliminar la cromatina no unida y vuelva a suspender las perlas en alícuotas de tampón TE. Tome una pequeña cantidad para el análisis cuantitativo y la verificación de enriquecimiento. El análisis de interacciones de cromatina mediante secuenciación pad y tag es una técnica desarrollada para el análisis de novo a gran escala de estructuras de cromatina de orden superior que interactúan.

Los fragmentos de ADN que han sido enriquecidos mediante inmunoprecipitación de cromatina se capturan mediante ligación por proximidad. Se aplica la estrategia de pad y etiqueta a la construcción de bibliotecas CHI PET, las cuales se secuencian mediante tecnologías de secuenciación de nueva generación de alto rendimiento. En este video, mostraremos los aspectos experimentales críticos en la construcción de bibliotecas CHI PET.

La primera mitad de la construcción de la biblioteca implica manipular las perlas de proteína A o G, a las cuales se unen los fragmentos de ADN, para eliminar las enzimas y la sal del tampón. Después de cada reacción enzimática, utilice una centrifugación suave y un movimiento de agitación ligera en cada paso de lavado. Aspire el sobrenadante varias veces para maximizar la captura de perlas cuando se coloquen sobre una partícula magnética.

Concentrador para todos los pasos de incubación que contengan perlas en la mezcla de reacción. Prepare la mezcla maestra previamente y agregue la enzima al final, después de que las perlas se hayan resuspendido homogéneamente. Asegúrese de que las perlas estén bien mezcladas durante toda la incubación. Los oligonucleótidos semilinkers están diseñados con un código de barras interno compuesto por cuatro nucleótidos y un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción tipo II MME1.

Después de ligar los fragmentos de enlace parciales a los fragmentos de ADN anclados en los complejos cromatínicos C, los fragmentos de ADN que interactúan quedarán unidos mediante una secuencia completa de enlace. Estos enlaces parciales generan secuencias con enlaces ab heterodiméricos derivados de productos de ligación no específicos o secuencias con enlaces homodiméricos, AA o BB, derivadas de productos de ligación específicos. Por lo tanto, el uso de dos enlaces parciales con códigos de barras nucleotídicos diferentes permite especificar diferentes experimentos o réplicas, así como monitorear las tasas de ligación quimérica no específica entre diferentes complejos de chip.

Es importante preparar la reacción sobre hielo y descongelar suavemente los semienlazadores sobre hielo. Combine bien los semienlazadores con agua y luego con un tampón de ligasa que contenga PEG. Asegúrese de que la mezcla maestra esté bien homogeneizada antes de la resuspensión.

Suspenda el ADN del chip y agregue ADN ligasa T4 solo después de que los semilinkers y los fragmentos de ADN del chip se hayan mezclado bien para prevenir la concatenación de los semilinkers. Selle el tubo con parafina y incube durante la noche a 16 grados Celsius con agitación. Los complejos de cromatina intactos se eluyen entonces de las perlas mediante la adición de SDS en tampón EB para eluir el ADN y reducir la concentración de SDS con Tritón X-100 para neutralizar todo el SDS. La circularización de los complejos de cromatina se facilita mediante la ligación de dos semilinkers, creando una secuencia de linker completa en la unión de interacción. Ligue los complejos de cromatina eluidos en condiciones extremadamente diluidas para minimizar las ligaciones entre diferentes complejos de ADN y proteína, utilizando ADN ligasa T4 solo después de que los complejos de cromatina eluidos se hayan diluido adecuadamente en la mezcla de reacción. Tras la reversión del entrecruzamiento, elimine las proteínas asociadas al ADN y purifique los fragmentos de ADN circularizados mediante extracción con fenol-cloroformo. Utilice el sistema de gel de bloqueo de fase KaiGen para una separación sencilla.

Después de la extracción con fenol, use glicoblue, un portador de ADN, para aumentar la masa y la visibilidad del paladar. Los oligonucleótidos de medio conector contienen sitios de reconocimiento MM E uno en las regiones flanqueantes. La enzima de restricción MM E uno A, de tipo dos S, corta a 18 y 20 pares de bases aguas abajo de sus sitios de unión diana para generar fragmentos cortos del fragmento de cromatina, produciendo constructos etiqueta-PET-conector-etiqueta, abreviados como pets.

Además, cada enlazador medio se modifica con biotina para permitir la purificación de los constructos de pet mediante perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina. Realice una digestión MME para liberar los constructos de enlazador con etiqueta. Purifique los pets mediante unión selectiva a perlas de aden atrapadas, y ligue los constructos de pet con adaptadores para secuenciación de alto rendimiento.

Utilice una ADN polimerasa de fusión para amplificar la Biblioteca de Fusión CHI PET. La ADN polimerasa se utiliza para generar plantillas con alta precisión y eficiencia. Preparar la reacción de PCR en frío y añadir la ADN polimerasa de fusión al final.

Dado que la enzima presenta actividad exonucleasa de tres primas a cinco primas que puede degradar los cebadores en ausencia de DN Tps. Si la biblioteca de la silla mascota se construye con éxito, debería observarse una banda intensa y bien definida de aproximadamente 223 pares de bases. Evite las bandas inespecíficas al excavar la banda de 223 pares de bases del gel y purifique la banda extraída utilizando el Protocolo de Trituración de Gel.

Realice un control de calidad utilizando el bioanalizador Agilent 2100 con un kit DNA 1000 antes de la secuenciación de alto rendimiento. Acabamos de demostrar el procedimiento CHI PET para la detección imparcial de interacciones de cromatina en todo el genoma. La calidad de los datos CHI PET depende de la eficacia del anticuerpo de inmunoprecipitación cromatínica utilizado y de la profundidad de secuenciación.

Aquí utilizamos de 18 a 20 millones de lecturas para la cartografía de interacciones. Este protocolo específico se ha utilizado con éxito para caracterizar redes de interacción de cromatina unidas al receptor de estrógeno y a la ARN polimerasa en el genoma humano. Preveemos que este ensayo sea una herramienta poderosa para estudios futuros sobre la arquitectura tridimensional de la biología de la transcripción en el contexto del genoma completo.

Esperamos que este video sea útil para usted. Gracias por verlo.I.