Name: Modelo murino de asma inducida por alergenos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Aprende a desarrollar un modelo murino de asma inducida por alérgenos mediante inyección intraperitoneal y desafío intratraqueal. Este método permite evaluar la inflamación de vías aéreas y niveles de IgE en investigación inmunológica.

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Este trabajo fue apoyado por el NIH Grant HL093196 (RCR) y el Centro de Atlanta y la Fundación de Educación (AREF).

I. La sensibilización alérgica y el desafío (ver Figura 1) A. Para Challenge intratraqueal <ol><li> Por sensibilización inicial, inyectar macho o hembra C57BL / 6 o ratones BALB / c (6-8 semanas de edad) por vía intraperitoneal el día 0 y de nuevo el día 7 con 20 mg de ovoalbúmina (OVA; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) emulsionado en 0,2 ml de fosfato de solución salina estéril tamponada (PBS) que contenía 2 mg de hidróxido de aluminio (Sigma-Aldrich) o con 2 mg de hidróxido de aluminio en 0,2 ml de PBS estéril como control. </li><li> Desafío con el antígeno como apropiado (por ejemplo, en los días 14, 16, 18 y 20). Desafío procedimiento siguiente. </li><li> Anestesie ratón con una inyección intraperitoneal (ip) de inyección de una mezcla de ketamina (90 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg). Asegúrese de que el ratón está totalmente anestesiado durante al menos 10 minutos. </li><li> La superficie de operación de ángulo a 45 grados o más. Coloque el cursor sobre esta superficie de mantenimiento de la parte ventral hacia arriba y la cabeza en la parte superior. </li><li> Hook tHRead en los incisivos delanteros para mantener la cabeza hacia atrás. Nivel de las patas entre sí para garantizar la tráquea es recta y use cinta de etiquetas para mantener las piernas. Remoje sitio quirúrgico con EtOH 70% y el hisopo. </li><li> Aplicar bupivicaína (0,1 a 0,2 ml de solución al 0,25%) por vía tópica en el sitio de la incisión. </li><li> Nip piel de la garganta con unas pinzas y tirar suavemente hacia afuera. Hacer una pequeña incisión vertical con unas tijeras quirúrgicas. Reducir al mínimo el tamaño de la incisión. </li><li> Preparar una jeringa de 1 ml con 50 l de PBS o el 0,1% OVA en PBS y se inserta en una pipeta repetitiva (Tridak paso a paso, Torrington, CT). Tomar la pipeta en una mano y usar la otra para mantener el tejido de vuelta con las pinzas y exponer la tráquea. </li><li> Sosteniendo la jeringa como paralela a la tráquea como sea posible, insertar la aguja a través de la tráquea pared e inyectar la solución. </li><li> Mantener el ratón en una inyección de la orientación vertical de las siguientes para dar tiempo a la solución para resolver en los pulmones. </li><li> La herida suavemente y cerca estéril área conpinzas y sello con sutura. </li><li> Coloque el ratón el esternón hacia abajo en un cojín de calefacción y permitir su recuperación hasta que esté completamente ambulatoria. Después de la recuperación, devolver el ratón para la instalación de cuidado de los animales y monitorear diariamente para detectar signos de seroma, inflamación o infección, y la dehiscencia de la herida hasta que la herida haya cicatrizado completamente. </li></ol> B. Para Challenge por nebulización <ol><li> Sensibilizar ratones en el día 0 por inyección intraperitoneal de 20 mg de OVA (Sigma-Aldrich) emulsionado en 0,2 ml de PBS estéril que contiene 2 mg de hidróxido de aluminio (Sigma-Aldrich) o con 2 mg de hidróxido de aluminio en 0,2 ml de PBS estéril como control . </li><li> En el día 14, aumentar la sensibilización por inyección ip como se describió anteriormente. </li><li> El día 21, 22 ª, 23 ª, 24 ª y 25 ª después de la sensibilización inicial, los ratones desafío por la exposición durante 30 minutos a la OVA nebulizada al 1% o PBS solo entrega a través de un nebulizador ultrasónico (Buxco de Investigación de Sistemas, Wilmington, Carolina del Norte). </li><li> Los ratones lugar en la cámara principal de WBP; aclimatarlos dentro de la cámara pletismografía por lo menos durante 10 minutos. </li><li> Colocar 1 ml de 0,1% OVA en PBS estéril o PBS estéril solo, como se describe en los pasos 4-6 abajo, a través de un nebulizador. Nebulizar durante 30 min. </li><li> Retire del nebulizador y descartar cualquier solución restante. </li><li> Nebulización puede realizarse en todos los ratones simultáneamente mediante el uso de una cámara de nebulización. </li></ol> II. Determinación de la hiperreactividad bronquial a la metacolina A. no invasiva de medición de la hiperreactividad de la vía aérea mediante pletismografía corporal (WBP; Buxco de Investigación de Sistemas, de Wilmington, Carolina del Norte) <ol><li> Dejar que la botella metacolina en polvo a calentar a temperatura ambiente antes de la apertura (metacolina es muy higroscópico y formar montones inútiles si se permite que absorben agua). Preparar una 200 mg / ml de solución madre en PBS estéril, a continuación, hacer serie 2-diluciones (por ejemplo, 100, 50, 25, 12,5 y 60,25 mg / ml). Mantenga las soluciones de frío. </li><li> Instale el equipo de la siguiente manera: conectar la entrada principal de WBP de nebulizador, el sesgo de flujo de entrada a la bomba de aire, y la salida a la trampa de gas WBP utilizando ajustada tubo de goma. Coloque el transductor de presión para reducir las salidas de las principales cámaras y referencia de la WBP. Conecte el transductor de presión para el preamplificador con los cables suministrados, y conectar a la PC usando preamplificador específico de adquisición de datos de la tarjeta. </li><li> Calibrar el preamplificador utilizando el software de acuerdo a las recomendaciones del fabricante. </li><li> Los ratones lugar en la cámara principal de WBP; aclimatarlos dentro de la cámara pletismografía por lo menos durante 10 minutos, a continuación, registrar lecturas de referencia (Penhbase) durante 3 min. </li><li> Colocar 1 ml de PBS estéril en el vaso del nebulizador. Nebulizar durante 2 minutos y luego monitorear las variables respiratorias durante 6 minutos durante la fase de secado. Retire del nebulizador y descartar cualquier resto de PBS. </li><li> Colocar 1 ml de 6,25 mg / ml de metacolina en la taza del nebulizador y rEPEAT nebulización durante 2 minutos más un ciclo de seguimiento de 6 min. </li><li> Repita la medición con 12,5, 25, 50 y 100 mg / ml de metacolina, con el mismo período de 2 minutos de la nebulización y la 6-min ciclo de supervisión. </li><li> Retire los ratones de las cámaras y devolverlos a sus jaulas. </li><li> Vuelva a llenar la taza del nebulizador con 1 ml de PBS estéril y ejecutar otra secuencia para limpiar la tubería. </li><li> Apague los flujos de aire, desmontar, y limpie todas las cámaras antes de ejecutar un segundo grupo de animales. </li></ol> B. invasiva de medición de la capacidad de respuesta por la vía aérea controlada por ordenador Ventilador (flexiVent; SCIREQ Inc., Montreal, Canadá) <ol><li> Pesar el ratón y anestesiar por vía intraperitoneal (ip) la inyección de 60 mg por kg de peso corporal de sodio pentobarbital. </li><li> Después de la anestesia adecuada posición, los ratones ventro-dorsal de la traqueostomía. </li><li> Desinfecte la piel del cuello con un 70% de etanol. Aplicar bupivicaína (0,1 a 0,2 ml de solución al 0,25%) por vía tópica en el incision sitio. Una incisión y abrir la piel del cuello. Separe los músculos del cuello y exponer la tráquea. </li><li> Haga un 1 - a 2 mm de incisión en la tráquea con tijeras finas (estar seguro de no cortar la tráquea) e introduzca el tubo traqueal con cautela. Atar una sutura alrededor de la tráquea para evitar una fuga de aire. </li><li> Coloque el ratón en la cámara de pletismógrafo corporal y conectar el tubo que se inserta la tráquea al respirador. </li><li> Iniciar la ventilación mecánica. Establezca la frecuencia respiratoria adecuada y el volumen corriente / carrera (150 golpes por minuto y 200 l, respectivamente, para un ratón de 20 g). Asegúrese de que el tórax se mueve en sincronía con el ventilador. Si el ratón está &quot;luchando&quot; con el respirador (auto-respiración), inyectar más anestesia y esperar a la sincronización. </li><li> Después de las mediciones de referencia, mantener los ratones en la ventilación de referencia para otros 3 minutos, y luego tomar un 2 º conjunto de las mediciones de impedancia. Este 2 º conjunto de mediciones de referencia se utiliza para calcmular los valores basales medias. </li><li> Entregar PBS o metacolina (MM) retos (6,25, 12,5, 25, 50 y 100 mg / ml) por canalizar el flujo inspiratorio del respirador a través de un nebulizador ultrasónico. </li><li> Después de cada reto con MM (6,25, 12,5, 25, 50 y 100 mg / ml), se devolverá el pistón a la entrega de un Vt de 10 ml / kg a 120 respiraciones por minuto y tomar las mediciones de impedancia. </li></ol> III. La medición de la infiltración celular en el espacio aéreo A. Realice el lavado broncoalveolar (LBA) <ol><li> Después de la medición de la AHR, la eutanasia a los ratones con el CO 2, y la posición de cada ratón en su parte posterior en la plataforma quirúrgica. </li><li> Remoje el área con 70% de EtOH. </li><li> Comenzando en la parte inferior del abdomen, corte la cavidad abdominal y remover la piel / superior de los músculos, moviéndose hacia arriba, hacia las costillas. </li><li> Una vez que las costillas son visibles, con unas tijeras cuidadosamente perforar el diafragma. Los pulmones deben colapsar lejos del diafragma. Tenga especial careful de no dañar los pulmones o el corazón. </li><li> Corte la caja torácica para exponer completamente los pulmones o del corazón (evitar cortar cualquier principales vasos sanguíneos para que la sangre se llene el lugar). </li><li> Con una jeringa de 1 ml con una aguja de calibre 27 (BD jeringas, Franklin Lakes, NJ), la punción de los ventrículos del corazón y poco a poco y con cuidado tire hacia atrás de la jeringa para recoger la sangre. Tenga cuidado para evitar el colapso del corazón. </li><li> Recoger el suero de la sangre utilizando este protocolo estándar. Almacenar a -70 ° C hasta su uso. </li><li> Corte y retire la piel y el tejido de la garganta hasta la tráquea se revela. Borrar el tejido suficiente para trabajar con facilidad en el campo (de nuevo, evitar cortar cualquier principales vasos sanguíneos). </li><li> Con unas tijeras curvas, cortados en la tráquea para despejar el camino. </li><li> Pase el punto de un fórceps curvados bajo la tráquea y sujete el extremo de un trozo de hilo de sutura. Tire del hilo de sutura en la tráquea. </li><li> Haga un medio nudo suelto sobre la tráquea, la baja en la garganta. </li><li> CAREFUlly cortar una muesca, un tamaño suficiente para que la cánula, por encima del hilo de sutura. </li><li> Cuidadosamente insertar la cánula en el agujero y abajo de la tráquea más allá del punto del hilo de sutura. Presione suavemente hacia adelante hasta que la cánula sale justo a la entrada a los pulmones (demasiado lejos: pulmones punzantes, demasiado cortos: la tráquea colapso cuando se trata de recuperar BAL). </li><li> Apretar hilo de sutura y el nudo completo para sellar alrededor de la tráquea cánula. </li><li> Bloqueo de la jeringa (que contiene 1 ml de PBS) en la cánula, y presione suavemente el líquido en el pulmón. Lóbulos pulmonares de forma individual debe inflar lentamente. No llene excesivamente. Para un total de ratón cultivadas 0,9-1,0 ml es el máximo absoluto. 0,8 ml puede ser más seguro. Bloqueo de la jeringa a la cánula sin apretar, de lo contrario es probable que cause daños al tratar de desactivar. </li><li> Retirar el líquido de los pulmones. Si se encuentra resistencia (tejido aspirado dentro de la cánula), presione lentamente la cánula más allá en el pulmón y volver a remover. También pruebe a girar la cánula en su lugar. Si todos los ELSe no, retirar la cánula parte del camino, la tráquea es mucho más probable que se hunda en este caso. </li><li> Retire la jeringa de la cánula, el líquido depositado en el contenedor BAL, y repetir 2 veces con solución de PBS fresca. </li><li> Mantenga la solución BAL en hielo hasta centrifugarse. </li><li> Usar el líquido de BAL y el suero para medir la OVA de IgE específica mediante disponible en el mercado del ratón IgE kits de ELISA (Bioproductos MD, St. Paul, MN). </li></ol> B. Contar las células y determinar Diferenciales <ol><li> Centrifugar el líquido de BAL 5 minutos a ~ 600 × g, 4 ° C. </li><li> Resuspender el sedimento celular suavemente en PBS y mantener en hielo. </li><li> Cargar un estándar hemacitómetro Neubauer con la suspensión celular diluida y contar las células. </li><li> Retire las alícuotas de 2 × 10 4 células en 10 a 40 l de volumen de cytospins. Diluir las células, si es necesario. </li><li> Para cytospins, mezcle 2 × 10 4 células, 130 l de PBS y el FBS al 10 l. Agregue la mezcla de célula entera de doubLe citospina embudo y centrifugar 10 min a 700 rpm, utilizando cytoslides dobles para las muestras duplicadas. </li><li> Permitir que los portaobjetos se seque a temperatura ambiente durante 1 h antes de la tinción. </li><li> Mancha de las diapositivas mediante el uso de Diff-Quick mancha (Siemens, Newark, DE). </li></ol> IV. Los resultados representativos Constricción de las vías respiratorias después de estímulos provocadores excesiva es una característica prominente de asma clínica. Se describen dos métodos para la medición de la hiperreactividad bronquial a la metacolina como en ratones OVA-sensibilizado y desafiado: Pletismografía del cuerpo entero (Figura 2) y oscilación forzada utilizando el sistema de flexiVent (Figura 3). Ambos métodos demuestran que la OVA de sensibilización y desafío produce hiperreactividad bronquial en los ratones. Rica en eosinófilos inflamación de las vías es otra característica destacada de tanto clínico del asma y la enfermedad de las vías respiratorias alérgicas en ratones. Como se muestra en la Figura 4 </strong&gt;, OVA de sensibilización y el desafío aumenta considerablemente el número total de células que pueden ser recuperados de las vías respiratorias por el BAL. El número de eosinófilos y, en menor medida, los neutrófilos son especialmente aumentado. La evidencia indica que los resultados de las vías respiratorias alérgicas enfermedades de la sobreproducción de anticuerpos IgE frente a antígenos de sensibilización. La sensibilización y el desafío con OVA utilizando los protocolos que describen aumenta los niveles de IgE en suero y líquido de BAL de ratones tratados (Figura 5). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3771/3771fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema experimentales para OVA inducida por el asma alérgica. Ratones se sensibilizaron dos veces ip con 20 mg de OVA emulsionado en 2 mg de hidróxido de aluminio en 0,2 ml de PBS estéril, o 2 mg de hidróxido de aluminio en 0,2 ml de estéril solo PBS, seguido en el los puntos indicados por el tiempo que desafían con un 0,1% OVA o solución estéril de PBS o por el ex diario<html> POSICION durante 30 minutos a la OVA nebulizado 1% en PBS o PBS solo entrega a través de un nebulizador ultrasónico (Buxco). Veinticuatro horas después de la exposición OVA final, se determinó la capacidad de respuesta las vías respiratorias. Posteriormente, el líquido de BAL, muestras de sangre, células de pulmón, y los tejidos se recogieron para su posterior análisis. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3771/3771fig2.jpg" /> Figura 2. Los ratones de evaluación de la inducida por alergenos hiperreactividad bronquial por un método no invasivo. (N = 4/group) fueron sensibilizados y desafiados con OVA. Veinticuatro horas después del último desafío, la hiperreactividad bronquial a la metacolina inhalada se determinó a través de todo el cuerpo pletismografía como se describe en el protocolo. Penh se determinó y expresó como Penh relación (promedio Penh durante el intervalo de tiempo 8-min con metacolina dividido por el promedio Penh durante el intervalo de 8-min con PBS). *, P &lt;0,05 vs PBS. iles/ftp_upload/3771/3771fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. Los ratones de evaluación de la inducida por alergenos hiperreactividad bronquial por un método no invasivo (oscilación forzada). (N = 4/group) fueron sensibilizados y desafiados con OVA. Veinticuatro horas después del desafío último, hiperreactividad bronquial a concentraciones crecientes de metacolina inhalada se determinó por la oscilación forzada (flexiVent) método descrito en el protocolo. A, B) la vía aérea de resistencia; C) elastancia del pulmón. *, P &lt;0,05 vs PBS. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3771/3771fig4.jpg" /> Figura 4. Recuento de células BAL fluido. Los ratones (n = 4/group) fueron sensibilizados y desafiados con OVA. Veinticuatro horas después del último reto, (Arriba) BAL células se recogieron y se contaron las células totales, como se describe en el protocolo. (Abajo) Cytospin diapositivas fueron pREPARADO y se tiñeron con Diff-Quick. Total = total de células; Eos = eosinófilos; Neu = neutrófilos, macrófagos, Mac = LYM = linfocitos. *, P &lt;0,05 vs PBS. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3771/3771fig5.jpg" /> Figura 5. OVA-IgE específica. Los ratones (n = 4/group) fueron sensibilizados y desafiados con OVA. Veinticuatro horas después del desafío último, la IgE se midió en el líquido de BAL y en el suero de la sangre recogida por punción cardiaca como se describe en el protocolo. *, P &lt;0,05 vs PBS.

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Los experimentos en animales se realizaron de conformidad con las directrices y regulaciones establecidas por el Comité Atlanta VAMC IACUC bajo el protocolo # V010-10.

Los modelos animales de enfermedad de las vías respiratorias alérgicas constituyen instrumentos importantes para los estudios pertinentes para el asma clínica. Una serie de modelos diferentes, que emplean diferentes especies y antígenos, se han desarrollado. El ratón, una especie de laboratorio atractivas y de uso frecuente, también ofrece una serie de ventajas para los modelos de la enfermedad de las vías respiratorias alérgicas. 9,10 Aunque estos modelos no asemejar al asma en todos los aspectos, 11</s...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del Material </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Ovoalbúmina </td><td> Sigma-Aldrich St. Louis, MO </td><td> A5503 </td><td></td></tr><tr><td> Hidróxido de aluminio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 239186 </td><td></td></tr><tr><td> Acetil-β-methylcholine cloruro de </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A2251 </td><td></td></tr><tr><td> Sal de sodio pentobarbital </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P3761 </td><td></td></tr><tr><td> Pletismografía de cuerpo entero (WBP) del sistema </td><td> Buxco de Investigación de Sistemas Wilmington, Carolina del Norte </td><td></td><td> <a href="http://www.buxco.com" target="_blank">http://www.buxco.com</a> </td></tr><tr><td> FlexiVent </td><td>SCIREQ, Inc. Montreal, Canadá </td><td></td><td> <a href="http://www.scireq.com" target="_blank">http://www.scireq.com</a> </td></tr><tr><td> Microscopio de luz </td><td> Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cytospin 4 </td><td> Thermo Scientific Asheville, Carolina del Norte </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Diff-Quick mancha </td><td> Siemens Newark, DE </td><td> B4132-1A </td><td></td></tr><tr><td> Pipeta repetitiva </td><td> Tridak Torrington, CT </td><td> STP4001-0025 </td><td></td></tr></tbody></table>

modelo murino de asma inducida por alergenos

Murine Model of Allergen Induced Asthma

El asma es una causa importante de morbilidad y mortalidad, que afecta a unos 300 millones de personas en todo el mundo. 1 Más de un 8% de la población de EE.UU. tiene asma, con la creciente prevalencia. 2 Al igual que con otras enfermedades, los modelos animales de enfermedad de las vías respiratorias alérgicas facilitan en gran medida comprensión de la fisiopatología subyacente, ayudan a identificar posibles dianas terapéuticas, y permitir que las pruebas preclínicas de posibles nuevas terapias. Los modelos de la enfermedad de las vías respiratorias alérgicas se han desarrollado en varias especies animales, pero los modelos murinos son particularmente atractivas debido al bajo costo, disponibilidad, y bien caracterizados sistema inmunológico de estos animales. 3 Disponibilidad de una gran variedad de cepas transgénicas aumenta aún más el atractivo de estos modelos. 4 A continuación se describen dos modelos murinos de enfermedad de las vías respiratorias alérgicas, tanto en el empleo de la ovoalbúmina como antígeno. Después de sensibilización inicial por inyección intraperitoneal, un modelo Delivres la exposición al antígeno por nebulización, el otro por la entrega intratraqueal. Estos dos modelos ofrecen ventajas complementarias, con cada imitando las características principales de asma humano. 5 Las principales características de asma aguda incluyen una respuesta exagerada a los estímulos vía aérea, tales como la metacolina (hiperreactividad de las vías respiratorias; AHR) y eosinófilos rica inflamación de las vías. Estos son también efectos importantes de la exposición al alérgeno en los modelos murinos, 5,6, y se describen las técnicas para su medición y por lo tanto la evaluación de los efectos de la manipulación experimental. En concreto, se describen ambos invasivos y no invasivos 7-8 técnicas para la medición de la hiperreactividad de las vías respiratorias, así como los métodos para evaluar la infiltración de células inflamatorias en las vías respiratorias y el pulmón. Las vías respiratorias células inflamatorias son recogidos por lavado broncoalveolar, mientras que la histopatología de pulmón se utiliza para evaluar los marcadores de inflamación en todo el órgano. Estostécnicas proporcionan herramientas poderosas para el estudio del asma en formas que no serían posibles en los seres humanos.

Los modelos experimentales de ratón de asma alérgica ofrecen nuevas posibilidades para el estudio de patogénesis de la enfermedad y el desarrollo de nuevas terapias. Estos modelos se adaptan bien a los factores de medición que regulan la respuesta inmune alérgica, inflamación de las vías, y la fisiopatología pulmonar.

Modelo murino de asma inducida por alergenos

El asma es una causa principal de morbilidad y mortalidad que afecta a unos 300 millones de personas en todo el mundo.1 Más del 8 % de la población de los EE. UU. padece asma, ...

El objetivo general del siguiente experimento es producir un modelo murino de asma. Primero, los ratones se sensibilizan al volin mediante inyección intraperitoneal como segundo paso. Los ratones se exponen al volin, ya sea por vía intratraqueal o mediante nebulización.Esto induce una reacción alérgica en las vías respiratorias similar a una exacerbación asmática humana y puede medirse mediante una prueba de desafío con metilcolina. Además, la infiltración celular en las vías respiratorias y los niveles séricos de IgE pueden cuantificarse para evaluar la gravedad de estas características típicas del asma. En última instancia, los ratones desarrollan manifestaciones similares al asma, cuya gravedad puede verse afectada por manipulaciones experimentales adicionales.Este modelo animal puede ayudar a responder preguntas importantes en el campo del asma, como los efectos del tratamiento con fármacos investigacionales específicos o de la modulación de vías de señalización específicas. Quienes demostrarán este procedimiento hoy serán Irvin y Somia, estudiantes de posgrado en mi laboratorio. Prepare la solución de sensibilización emulsionando un miligramo por mililitro de volin en PBS estéril que contiene 10 miligramos por mililitro de hidróxido de aluminio. Sensibilice los ratones inyectando 200 microlitros de la solución de sensibilización, o una solución control sin volin, por vía intraperitoneal para este protocolo.Sensibilice los ratones como se describe en el día cero y siete. Luego realice el desafío en días alternos, comenzando desde el día 14 hasta el 22 para el desafío intratraqueal. Coloque el ratón anestesiado sobre una superficie inclinada.Enganche un hilo debajo de los incisivos frontales del ratón y sostenga la cabeza hacia atrás. Luego, nivele la pata para enderezar la tráquea y sujete las patas traseras a la superficie de trabajo con cinta adhesiva. Para asegurar la posición, humedezca la zona del cuello y del pecho del ratón con etanol al 70 % y limpie con clorhexidina para desinfectar el sitio quirúrgico utilizando pinzas; pinche la piel de la garganta y tire suavemente hacia adelante con tijeras quirúrgicas estériles.Realice una pequeña incisión vertical. Cargue una jeringa de un mililitro con 50 microlitros de Volin al 0,1 % en PBS. Coloque una aguja de calibre 27 e insértela en una pipeta repetitiva con una mano.Utilice fórceps estériles para exponer la tráquea con la otra mano. Sostenga la pipeta paralela a la tráquea. Inserte cuidadosamente la aguja e inyecte la solución.Cierre suavemente la herida y séllela con una sutura, teniendo cuidado de mantener la esterilidad. Coloque el ratón sobre una almohadilla calefactora y permita que se recupere antes del desafío mediante nebulización.Utilice el método descrito anteriormente para sensibilizar a los ratones el día cero y el día 14. Luego, exponga a los ratones diariamente entre el día 21 y el día 25. Para realizar la exposición, coloque a los ratones en la cámara principal de un sistema de pletismografía corporal total y permita que se aclimaten durante al menos 10 minutos.Luego, coloque un mililitro de albúmina al 0,1 % en PBS estéril en la copa del nebulizador y nebulice durante 30 minutos. Para realizar mediciones no invasivas de hiperreactividad de las vías respiratorias, acostumbre a los ratones a la cámara como se indicó previamente. Luego registre las lecturas basales durante tres minutos.A continuación, coloque un mililitro de PBS en la copa del nebulizador, nebulice durante dos minutos y supervise las variables respiratorias durante seis minutos adicionales durante la fase de secado tras la nebulización. Este ejemplo ilustra el aumento de la reactividad de las vías respiratorias desarrollada por los ratones tratados con ovalbúmina para realizar mediciones invasivas de la hiperreactividad de las vías respiratorias. Coloque el ratón anestesiado en posición supina, desinfecte el cuello con etanol y clorhexidina, y exponga la tráquea tal como se describió anteriormente en este video.Una vez que la tráquea sea visible, use tijeras estériles finas para realizar una pequeña incisión. Tenga cuidado de no seccionar la tráquea e inserte suavemente el tubo traqueal. Coloque una sutura alrededor de la tráquea para prevenir fugas de aire.Coloque al ratón sobre su espalda y conecte el tubo traqueal al ventilador. Inicie la ventilación mecánica para un ratón de 20 gramos. Establezca la frecuencia respiratoria en 150 movimientos por minuto y el volumen corriente en 200 microlitros para obtener mediciones respiratorias basales.Luego repita la prueba tras la administración de PBS o dosis crecientes de metilcolina mediante un nebulizador ultrasónico. Mediante la medición invasiva, se pueden medir tanto la resistencia de las vías aéreas como la elastina pulmonar, tal como se espera. Los ratones tratados con volin presentaron un aumento de la resistencia y de la elastina tras el desafío.Tras la eutanasia, exponga la cavidad abdominal del ratón y luego use tijeras para perforar cuidadosamente el diafragma mientras lo hace. Tenga cuidado de no perforar los pulmones ni el corazón. Retire la caja torácica.Luego, punzurar el corazón utilizando una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 27 y recolectar lentamente la sangre; conservar la sangre para la separación del suero y el análisis de anticuerpos IgE específicos contra ova. A continuación, exponer la tráquea y usar tijeras curvas para despejar un camino debajo de ella. Pasar la punta de una pinza curva por debajo de la tráquea y luego atar un trozo de hilo de sutura en un nudo medio suelto alrededor de la tráquea en una posición baja de la garganta.Una vez que el hilo esté en su lugar, realice una pequeña incisión en la tráquea por encima del nudo e inserte cuidadosamente una cánula en el orificio. Luego presione suavemente hacia adelante hasta que alcance la entrada de los pulmones. Apriete y complete el nudo.Luego conecte una jeringa de un mililitro que contenga PBS a la cánula e inyecte suavemente el líquido en los pulmones. Observe la inflamación de los pulmones. Tenga cuidado de no llenar en exceso y romper los pulmones.Retire el líquido de lavado, rotando suavemente o presionando ligeramente la cánula un poco más hacia adentro si encuentra resistencia. Una vez recolectado el líquido, retire la jeringa y transfiera el líquido a un tubo sobre hielo. Repita el procedimiento dos veces con PBS fresco.Después de este procedimiento, las células de las vías respiratorias pueden aislarse mediante centrifugación, como se muestra aquí. Las vías respiratorias de los ratones sensibilizados y expuestos a volin contienen muchas más células totales que las de los ratones control. Mediante tinciones rápidas diferenciales, pueden distinguirse y contarse eosinófilos, neutrófilos, macrófagos alveolares y linfocitos.Además, puede observarse que los ratones tratados desarrollan niveles más elevados de anticuerpos IgE específicos contra volin en suero y en el líquido de lavado broncoalveolar tras su desarrollo. Este modelo animal ha allanado el camino para que los investigadores en el campo del asma exploren los mecanismos subyacentes a esta enfermedad importante en un modelo murino conveniente.

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Mediciones repetidas de la fisiología respiratoria y el muestreo de roedores de las células de las vías respiratorias inflamatorias son deseables, pero en general no es factible. A continuación se describe un método reproducible para la intubación por vía oral ratones que permite mediciones repetidas de la hiperreactividad de las vías respiratorias y el muestreo de las células de las vías respiratorias inflamatorias.

A reversible, método no invasivo para las mediciones de resistencia de las vías y Toma de Muestras Líquido del Lavado broncoalveolar en ratones

El presente protocolo proporciona una descripción paso a paso detallado de los procedimientos necesarios para ejecutar las mediciones de la mecánica del sistema respiratorio, así como la evaluación de las vías respiratorias de respuesta a la metacolina inhalada en ratones utilizando la técnica de oscilación forzada (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc , Canadá).

Evaluación de la mecánica del sistema respiratorio en ratones utilizando la técnica de oscilación forzada

Mientras que el estudio in vitro de las interacciones huésped-patógeno permite la caracterización de respuestas inmunes específicas, se requieren modelos in vivo para observar los efectos de respuestas complejas. Utilizando la exposición a Candida albicans seguida de una infección pulmonar mediada por Pseudomonas aeruginosa, establecimos un modelo murino de interacciones microbianas implicadas en la patogenicidad de la neumonía asociada a la ventilación.

El estudio de las comunidades microbianas<em&gt; En Vivo</em&gt;: Un Modelo de anfitrión mediada por la interacción entre<em&gt; Candida Albicans</em&gt; Y<em&gt; Pseudomonas Aeruginosa</em&gt; En las vías respiratorias

El método descrito aquí permite la visualización de la activación de la inflamación dependiente del promotor de IL-8 en los pulmones de ratones a través de imágenes de bioluminiscencia no invasivas (BLI). El mismo animal puede ser sometido a BLI múltiples veces durante hasta dos meses a partir del momento de la entrega de la construcción de indicador de luciferasa.

Un modelo de ratón IL-8 transgénicamente transgéni-<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoreo a Largo Plazo de las Respuestas Inflamatorias

El objetivo del presente artículo es proporcionar una descripción detallada de los procedimientos recomendados para evaluar la función respiratoria en ratones conscientes por Pletismografía de doble cámara.

Evaluación de la función respiratoria en ratones conscientes por Pletismografía de doble cámara

El protocolo introdujo aquí permite la caracterización de la capacidad de pulmón homing de linfocitos humanos primarios en condiciones inflamatorias en vivo. La infiltración pulmonar de células inmunes humanas eventualmente transferidas en un modelo murino de inflamación alérgica puede ser reflejada y cuantificada mediante microscopía de fluorescencia de luz hoja de tejido pulmonar químicamente limpia.

Avanzadas de la proyección de imagen de pulmón Homing de linfocitos humanos en un Experimental en modelo Vivo de inflamación alérgica basada en microscopia de luz hoja

Los alérgenos ambientales, como los ácaros del polvo de la casa (HDM), a menudo contienen sustancias microbianas que activan las respuestas inmunitarias innatas para regular la inflamación alérgica. El protocolo presentado aquí demuestra la identificación de especies de dsRNA en los alérgenos de HDM y la caracterización de sus actividades inmunogénicas en la modulación de la inflamación pulmonar eosinofílica.

Identificación y caracterización de especies de ARN inmunogénico en alérgenos de HDM que modulan la inflamación pulmonar eosinofílica

Una plataforma alta puede fijar ratas sin restricciones y exponer completamente los acupoints en la parte posterior durante la manipulación de la acupuntura. Este artículo describe los métodos para la fabricación de la plataforma alta, establece un modelo de rata de asma y mide los cambios en la función respiratoria utilizando un sistema de pletimografía de todo el cuerpo (WBP) no invasivo y en tiempo real.

Acupuntura en un modelo de rata de asma

Este protocolo describe una técnica de inmunofluorescencia multicolor para evaluar el modelo de rinitis alérgica en ratas.

Marcaje inmunofluorescente en secciones de tejido de la mucosa nasal de ratas con rinitis alérgica mediante inmunoensayo multicolor

Aquí, describimos la medición de la tos utilizando un sistema de pletismografía de cuerpo entero (WBP) no invasivo y en tiempo real y los procedimientos normativos para la recolección de muestras de tejido de ratones e introducimos algunos métodos para evaluar la inflamación de las vías respiratorias.

Métodos para detectar la tos y la inflamación de las vías respiratorias en ratones

Este protocolo describe el desarrollo de un modelo de ratón con hipersensibilidad a la tos, que puede servir como modelo ideal para estudiar los mecanismos de la tos crónica.

Establecimiento de un modelo de ratón con hipersensibilidad a la tos por inhalación de ácido cítrico

Aprende a desarrollar un modelo murino de asma inducida por alérgenos mediante inyección intraperitoneal y desafío intratraqueal. Este método permite evaluar la inflamación de vías aéreas y niveles de IgE en investigación inmunológica.

Modelo murino de asma inducida por alergenos

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