Name: La infección de embriones de pez cebra con patógenos bacterianos intracelulares (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: Aprende a inyectar bacterias fluorescentes en embriones de Danio rerio para visualizar interacciones entre patógenos y células inmunitarias mediante microscopía confocal. Este protocolo permite estudiar respuestas inmunitarias innatas en tiempo real.

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Los autores desean agradecer a Cui Chao, Piso de Kort, Stoop Esther y Carvalho para las imágenes de Ralph en la Figura 4, Nehrdich Ulrike y Davy de Witt para el cuidado de los peces, y otros miembros del laboratorio útil para los debates. Este trabajo es apoyado por el Programa Smart Mix del Ministerio holandés de Asuntos Económicos y el Ministerio de Educación, Cultura y Ciencia, la Comisión Europea séptimo proyecto marco ZF-SALUD (SALUD-F4-2010-242048), la Unión Europea Marie Curie- Red de Formación Inicial FishForPharma (PITN-GA-2011 a 289209), y por el NHMRC Australia (637.394). El australiano Instituto de Medicina Regenerativa con el apoyo de subvenciones del Gobierno del Estado de Victoria y el Gobierno de Australia.

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<li>Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+disseminated+candidiasis+in+zebrafish+reveals+role+of+phagocyte+oxidase+in+limiting+filamentous+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth.</a> Eukaryot. Cell. 10, 932-944 (2011).</li>
<li>Colucci-Guyon, E., Tinevez, J. Y., Renshaw, S. A., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+of+professional+phagocytes+in+vivo%3A+unlike+macrophages%2C+neutrophils+engulf+only+surface-associated+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Strategies of professional phagocytes in vivo: unlike macrophages, neutrophils engulf only surface-associated microbes.</a> J. Cell Sci. 124, 3053-3059 (2011).</li>
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<li>Mathias, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+inflammation+by+retrograde+chemotaxis+of+neutrophils+in+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Resolution of inflammation by retrograde chemotaxis of neutrophils in transgenic zebrafish.</a> J. Leukoc. Biol. 80, 1281-1288 (2006).</li>
<li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Dev. Biol. 7, 42-42 (2007).</li>
<li>Gray, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+intravital+imaging+of+macrophage+and+neutrophil+behaviour+during+inflammation+using+a+novel+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+Haemost%22%5BJournal%5D)">Simultaneous intravital imaging of macrophage and neutrophil behaviour during inflammation using a novel transgenic zebrafish.</a> Thromb. Haemost. 105, 811-819 (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los métodos de infección se describen en este artículo se utilizan con frecuencia para estudiar la función de los genes receptores de inmunidad innata o de los genes de virulencia bacteriana 1. Los micro-inyección por vía intravenosa métodos (protocolos 5 y 6.1) se utilizan con mayor frecuencia para este tipo de estudios. La vena caudal en la isla sangre posterior es el lugar más conveniente para la inyección intravenosa de 1-día-embriones. Como la vena caudal se vuelve más difícil de penetrar en las etapas posteriores, se prefiere que el conducto de Cuvier como sitio de la inyección intravenosa de embriones en 2-3 fdd. En todos los casos es crítico para inyectar a los embriones con números consistentes de las bacterias, los cuales deben ser controlados por los inóculos de siembra de la inyección para el conteo de ufc. Los siguientes aspectos deben ser considerados para lograr inyecciones reproducibles. En primer lugar, es esencial disponer de alta calidad agujas de vidrio microcapilares inyección. Si la punta de la aguja es demasiado grande, la inyección creará un agujero punción suficientemente grande para que se produzca sangrado ylas bacterias inyectadas fluirá hacia fuera de la circulación sanguínea. En segundo lugar, las bacterias debe ser inyectado directamente en la circulación sanguínea. Si la punta de la aguja no está dentro de la vena o si se propaga de inyección de fluidos en la extensión del saco vitelino, el embrión debe ser desechado en el experimento. En tercer lugar, usando PVP40 como un portador para inyectar M. marinum ayudará en la prevención de las bacterias que se hunda en la aguja de vidrio. PVP40 mejora la homogeneidad de la suspensión, lo que resulta en inóculos más reproducible a lo largo de la duración de las inyecciones. PVP40 también puede ser usada para S. inyecciones typhimurium, pero aquí es menos importante porque el tamaño más grande y brillante de fluorescencia de las bacterias permite un control visual sobre el inóculo de la inyección durante los experimentos. Para la práctica de las inyecciones se recomienda el uso de tinte rojo de fenol (1% v / v) o 1 m esferas fluorescentes disponibles en diferentes colores (Invitrogen). Una vez que la técnica se domina, se tarda aproximadamente 30 minutES para inyectar 50-100 embriones, incluyendo el tiempo requerido para alinear los embriones en placas de agarosa y ajustando el volumen de inyección bacteriana. Mientras que las inyecciones por vía intravenosa en la isla de sangre (protocolo 5) o en el conducto de Cuvier (protocolo 6.1) son los más utilizados, las vías alternativas de infección se describen en este artículo de vídeo han demostrado ser útiles para estudiar los macrófagos y la quimiotaxis de neutrófilos (protocolos 6.2, 6.3 y 6.4), para estudiar el crecimiento de cepas bacterianas atenuadas (protocolo 6.5), y para adaptar el modelo de infección pez cebra para aplicaciones de alto rendimiento (protocolo 6.6) 4-8. Los descritos micro-inyección métodos también se pueden aplicar para las inyecciones de virus 18, 19, esporas de hongos 14, 20 o parásitos protozoarios (Maria Forlenza, comunicación personal). Una adición útil a los procedimientos de inyección descritas en este artículo de vídeo es un procedimiento descrito recientemente para la inyección subcutánea de bacterias en zebrembriones afish 21. Este procedimiento fue utilizado para estudiar la fagocitosis de las bacterias por los neutrófilos, los cuales fueron encontrados a las bacterias eficientemente engullen en las superficies del tejido pero, en contraste con los macrófagos, eran virtualmente incapaz de fagocitar bacterias después de la inyección en la sangre o en las cavidades corporales llenas de líquido. Para subcutáneos embriones inyecciones se colocan similar al de las inyecciones de cola musculares descritos en este artículo de vídeo, pero se inserta la aguja justo debajo de la piel para inyectar las bacterias sobre un somito. Es importante considerar que la microinyección es esencialmente una vía artificial de la infección. Sin embargo, los primeros embriones son altamente resistentes a la exposición externa a los patógenos bacterianos. De hecho, los ensayos de inmersión, donde los embriones se bañan en una suspensión bacteriana, no se pueden reproducir en nuestras manos 22. Mientras que algunos embriones pueden infectarse tras la inmersión, se ha observado una gran variación en las tasas de mortalidad y en el expresoión de los genes marcadores inflamatorios entre embriones individuales en dichos ensayos. Los métodos de inyección de micro-descritos en este artículo conseguir infecciones reproducibles y son particularmente útiles para estudiar las interacciones bacterianas con las células inmunes del huésped innatas. Un enfoque eficaz para cuantificar la infección bacteriana en los embriones individuales es el de analizar las imágenes fluorescentes de embriones infectados con el encargo, el software dedicado cuantificación pixel 17, 23. Este enfoque se ha demostrado que se correlaciona bien con los resultados de los recuentos cfu después de placas de embriones infectados. Del mismo modo, los cambios relativos en el número de leucocitos por embrión han sido cuantificados por análisis digital de imágenes en las líneas transgénicas de leucocitos fluoróforo reportero, este enfoque sería aplicable a la cuantificación de la respuesta del huésped a la infección leukopoietic 24. La función de los genes receptores inmunes innatas puede ser investigado eficazmente in vivo mediante la combinación de los modelos de infección descritoscon la caída morfolino. Morpholinos son oligonucleótidos sintéticos que se dirigen a los ARN antisentido específicos y reducir la expresión de los productos génicos cuando se inyectan en embriones de pez cebra 1-celulares etapa como se muestra en artículos de vídeo otros en esta revista 10, 25. En estudios desmontables morfolino, es de gran importancia que todos los grupos de embrión a comparar se realizaron correctamente antes de las inyecciones bacterianas. Esto es especialmente importante porque los embriones tienen un desarrollo del sistema inmune que hace cada vez más competente en el tiempo. Hay varias líneas de reportero transgénicos actualmente disponibles para distinguir los principales subconjuntos de inmunidad innata, los macrófagos y los neutrófilos, en embriones de pez cebra. El MPX y promotores Lyz se han utilizado para generar líneas de neutrófilos reportero 16, 26, 27, y el CSF1R (FMS) y promotores mpeg1 se utilizaron para producir reporteros macrófagos 14, 28. Mientras CSF1R (FMS) es, además, se expresa en xantóforos, mpeg1 expresión es exclusivamente en los macrófagos. Como se muestra en este artículo de vídeo, las líneas se han desarrollado recientemente mpeg1 reporteros son muy útiles para la fagocitosis por los macrófagos de imagen bacteriana.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Proveedor </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Rojo fenol </td><td> Sigma </td><td> P0290 </td></tr><tr><td> Glicerol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 228210 </td></tr><tr><td> Middlebrook 7H10 agar Difco </td><td> Becton, Dickinson y Compañía </td><td> 262710 </td></tr><tr><td> BBL Middlebrook OADC Enriquecimiento </td><td> Becton, Dickinson y Compañía </td><td> 211886 </td></tr><tr><td> Difco caldo Middlebrook 7H9 </td><td> Becton, Dickinson y Compañía </td><td> 271310 </td></tr><tr><td> BBL Middlebrook ADC Enriquecimiento </td><td> Becton, Dickinson y Compañía </td><td> 211887 </td></tr><tr><td> Tween 80 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P1754 </td></tr><tr><td> Polivinilpirrolidona (PVP40) </td><td> Calbiochem, Merck KGaA </td><td> 529504 </td></tr><tr><td> N &lt;/ Em&gt;-feniltiourea (PTU) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7629 </td></tr><tr><td> Etilo 3-aminobenzoato metanosulfonato sal (tricaína) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5040 </td></tr><tr><td> Metil celulosa </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M0387 </td></tr><tr><td> SeaPlaque agarosa (bajo punto de fusión de agarosa) </td><td> Lonza Inc. </td><td> 50100 </td></tr><tr><td> FluoSpheres (1,0 micras, rojo fluorescente (580/605)) </td><td> Invitrogen </td><td> F8821 </td></tr><tr><td> FluoSpheres (1.0 m, de color amarillo-verde fluorescente (505/515)) </td><td> Invitrogen </td><td> F8823 </td></tr></tbody></table>

la infección de embriones de pez cebra con patógenos bacterianos intracelulares

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Pez cebra (Danio rerio), los embriones se utiliza cada vez más como un modelo para estudiar la función de los vertebrados del sistema inmune innato en las interacciones huésped-patógeno 1. Los principales tipos de células del sistema inmune innato, los macrófagos y neutrófilos, se desarrollan durante los primeros días de la embriogénesis antes de la maduración de los linfocitos que se requieren para las respuestas inmunitarias adaptativas. La facilidad de obtener un gran número de embriones, su accesibilidad debido a la externa para el desarrollo, la transparencia óptica de estadios embrionario y larval, una amplia gama de herramientas genéticas, los amplios recursos y colecciones de mutantes de las líneas transgénicas, el reportero se suman a la versatilidad del pez cebra modelo. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) y Mycobacterium marinum puede residir de manera intracelular en los macrófagos y se utilizan con frecuencia para estudiar las interacciones huésped-patógeno en embriones de pez cebra. Los procesos de infección de estas dospatógenos bacterianos son interesantes para comparar ya que S. la infección es aguda typhimurium y letal en un día, mientras que M. la infección es crónica marinum y se puede exponer a la etapa de larva 2, 3. El sitio de micro-inyección de bacterias en el embrión (Figura 1) determina si la infección rápidamente se convertirá sistémica o inicialmente permanecerá localizada. Una infección sistémica rápida puede ser establecido por micro-inyección de bacterias directamente en la circulación sanguínea a través de la vena caudal en la isla posterior o sangre a través del conducto de Cuvier, un canal de circulación de ancho en el saco vitelino conecta el corazón a la vasculatura tronco. En un DPF, cuando los embriones en esta etapa tienen los macrófagos phagocytically activos, pero los neutrófilos aún no han madurado, la inyección en la isla de sangre se prefiere. Para las inyecciones en el 2-3 fdd, cuando los embriones también se han desarrollado funcionales (mieloperoxidasa que produce) los neutrófilos, el conducto de Cuvier se prefiere como tque el sitio de inyección. Para estudiar la migración dirigida de las células mieloides hacia infecciones locales, las bacterias pueden ser inyectados en el músculo cola, vesícula ótica, o rombencéfalo ventrículo 4-6. Además, la notocorda, una estructura que parece ser normalmente inaccesible a las células mieloides, es altamente susceptible a la infección local 7. Una alternativa útil para aplicaciones de alto rendimiento es la inyección de bacterias en la yema de los embriones en las primeras horas después de la fecundación 8. La combinación de bacterias fluorescentes y las líneas de transgénicos de pez cebra con los macrófagos fluorescentes o neutrófilos crea condiciones ideales para la multi-color de imágenes de las interacciones huésped-patógeno. Este artículo video describe protocolos detallados para la infección por vía intravenosa y locales de los embriones de pez cebra con S. typhimurium o M. marinum bacterias y para la imagen posterior de fluorescencia de la interacción con las células del sistema inmune innato.

Embriones de pez cebra transparentes han demostrado ser útiles los ejércitos de modelo para visualizar y las interacciones funcionales de estudio entre las células inmunes y los patógenos bacterianos intracelulares, tales como<em&gt; Salmonella typhimurium</em&gt; Y<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt;. Micro-inyección de bacterias y multi-color de imagen de fluorescencia son técnicas esenciales que intervienen en la aplicación de pez cebra modelos embrión infección.

La infección de embriones de pez cebra con patógenos bacterianos intracelulares

Los embriones de pez cebra (Danio rerio) se utilizan cada vez más como modelo para estudiar la función del sistema inmunitario innato de los vertebrados en la interacción hospedador-patógeno...

El objetivo general de este procedimiento es microinyectar embriones de pez cebra con bacterias fluorescentes para la obtención de imágenes en vivo de la interacción con las células inmunitarias del huésped. Esto se logra primero preparando y cargando la aguja de inyección con suspensiones bacterianas. A continuación, los embriones se clasifican por etapa y se alinean en una placa de inyección.Luego, se inyecta el inóculo bacteriano utilizando una vía que permite lograr una infección bacteriana local o sistémica. Finalmente, los embriones se montan y se obtienen imágenes de ellos. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren la localización intracelular de patógenos bacterianos dentro de fagocitos fluorescentes del hospedador embrionario transparente de pez cebra mediante microscopía de fluorescencia y microscopía confocal.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología, ya que el modelo de embrión de pez cebra es muy potente para la obtención de imágenes en vivo de las interacciones entre el huésped y el patógeno. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque requiere mucha práctica para inyectar de forma reproducible bacterias mediante microinyección en la circulación sanguínea de embriones de pez cebra, con el fin de provocar una infección sistémica, o en compartimentos específicos para lograr infecciones locales. Después de fabricar agujas de microcapilar de vidrio y biselar sus puntas en un ángulo de 45 grados, determine la etapa de los embriones de pez cebra a las 28 horas post-fertilización verificando una circulación sanguínea constante, el inicio de la pigmentación en el ojo, una cola recta y la posición del corazón justo ventral al ojo.Una vez que los embriones estén anestesiados, utilice una punta de microcargador para cargar la aguja con un inóculo bacteriano previamente preparado. Monte la aguja cargada en un micromanipulador conectado a un soporte y colóquela debajo de un microscopio estereoscópico. Establezca el tiempo de inyección en 0,2 segundos y la presión de compensación en 15 hectopascales.Ajuste la presión de inyección entre 700 y 900 hectopascales para obtener el volumen de inyección correcto para la aguja utilizada. Coloque el micromanipulador con la aguja cargada en la posición adecuada antes de realizar la inyección. Coloque los embriones anestesiados sobre una placa de inyección plana con agarosa al 1% y elimine cualquier exceso de agua de huevo.A continuación, utilice una herramienta de bucle de cabello para alinear los embriones para cada inyección. Mueva la placa manualmente durante las inyecciones para orientar los embriones con sus colas apuntando hacia la punta de la aguja. Coloque la punta de la aguja directamente encima de la vena coddle, cerca de la abertura urogenital.Perfore el peridermo con la punta de la aguja e inyecte la dosis deseada de bacterias marcadas con fluorescencia. Utilizamos aproximadamente 250 unidades formadoras de colonias o UFC de salmonella typhimurium y aproximadamente 120 UFC de mycobacterium marum. La suspensión bacteriana inyectada seguirá el flujo sanguíneo a través de la vena coddle hacia el monitor cardíaco si la inyección se realizó correctamente, lo cual se verifica observando un aumento en el volumen del sistema vascular inmediatamente después del pulso.Verifique frecuentemente que el volumen de inyección permanezca constante durante el experimento. Para tener un control de la consistencia de las inyecciones a lo largo del experimento, inyecte una gota de bacterias directamente sobre una gota de PBS estéril en un medio de crecimiento bacteriano. Aproximadamente cada 30 inyecciones de embriones, siembre esta gota en un plato y cuente las colonias bacterianas tras la incubación.Para determinar la UFC en el volumen de inyección, utilice un microscopio estereoscópico fluorescente para observar células individuales de estria fluorescentes que circulan en el torrente sanguíneo inmediatamente después de la inyección, y deseche los embriones que no hayan sido inyectados adecuadamente. Los agregados fluorescentes de bacterias M marum deben ser visibles a los dos días posteriores a la infección y aumentarán de tamaño con el tiempo. Para inyectar en el conducto de Cuvier, alinee embriones anestesiados de dos a tres días posteriores a la fertilización.Para la inyección en la vena coddle a un ángulo de 45 grados desde el lado dorsal del embrión, inserte la aguja en el punto inicial del conducto de Cuvier. Justo dorsal a la ubicación donde el conducto comienza a ensancharse sobre el saco vitelino para la posición de inyección en el ventrículo del encéfalo posterior. Anestesie los embriones a las 32 horas post-fecundación con su lado dorsal orientado hacia la punta de la aguja.Introduzca la aguja en el ventrículo del cerebelo desde una posición anterior sin tocar el neurohilio para inyectar en los músculos de la cola. Coloque embriones anestesiados de uno a dos días post-fecundación con la cola orientada hacia la punta de la aguja y con esta a un ángulo aproximado de 65 grados; realice la inyección en el músculo por encima de la abertura urogenital para inyecciones en la vesícula ótica. Oriente embriones anestesiados de dos a tres días post-fecundación con la cola dirigida hacia la aguja.Inyecte en un ángulo de 65 grados y a baja presión para introducir el líquido en el cordón del nódulo utilizando embriones de uno a dos días posteriores a la fertilización, con la cola orientada en dirección opuesta a la aguja. Introduzca la aguja a través del tejido muscular de la cola hacia el cordón.Para una inyección en la yema de embriones en estadio de 16 a 1000 células, atraviese con la aguja el corion hasta el centro de la yema para observar la infección. Anestesie los embriones infectados en una placa de Petri con capa de auguros al 1 %, cubierta con agua de huevo que contiene trica. Utilice una herramienta de bucle de cabello para alinear los embriones en la posición correcta para la observación mediante un microscopio estereoscópico de fluorescencia.Pueden observarse individualmente células fluorescentes s tym circulando en el torrente sanguíneo inmediatamente después de la inyección. Si se requiere una posición diferente a la vista lateral, monte los embriones en metilcelulosa al 1,5 % y utilice una herramienta de bucle de cabello para manipular el embrión hacia la posición necesaria para obtener imágenes de la infección mediante un microscopio confocal invertido.Coloque una gota de aeros de punto de fusión bajo en un recipiente de vidrio con fondo de cristal. Coloque el embrión anestesiado en la gota de aeros con una cantidad limitada de agua de huevo y utilice una herramienta de lazo de cabello para manipular el embrión hasta colocarlo en posición. Deje que el aeros se solidifique y sumerja la gota de aeros en agua de huevo que contenga trica.La muestra ya está lista para la inyección de imágenes confocales de bacterias salmonella typhimurium o mycobacterium marum en la isla sanguínea de embriones a un día. La fertilización da como resultado la fagocitosis rápida por macrófagos y la diseminación de las bacterias estreptocócicas relativamente grandes y fluorescentes marcadas con DS.Red, que pueden visualizarse directamente mediante microscopía de fluorescencia estereoscópica e imagen confocal a las dos horas. La infección muestra que muchas bacterias son fagocitadas por macrófagos fluorescentes.Una dosis de inyección de 250 UFC de styria tipo silvestre inducirá una respuesta proinflamatoria intensa y será letal en un día. En contraste, la inyección intravenosa de erum provoca una infección persistente en la que los macrófagos infectados forman agregados compactos considerados como las etapas iniciales de los granulomas, que son la característica distintiva de la tuberculosis. La imagen confocal de un agregado similar a un granuloma en la línea transgénica EG uno EGFP a los cinco días posteriores a la infección muestra el crecimiento intracelular de bacterias M num marcadas con m-cherry.Dentro de los macrófagos fluorescentes verdes, se pueden inyectar bacterias en el ventrículo del cerebro posterior, un compartimento que carece de macrófagos a las 32 horas posteriores a la fertilización. La inyección de 20 a 100 UFC de bacterias M marum marcadas con cherry en este compartimento provoca una rápida infiltración por macrófagos que fagocitan las bacterias, como se muestra aquí. Mediante el uso del transgénico M-P-X-E-G-F-P, la inyección de aproximadamente 20 UFC de Styria en la vesícula ótica induce la atracción de neutrófilos a las tres horas posteriores a la infección. Aunque esta respuesta no se observa en las inyecciones control con PBS, la notocorda, que parece resistente a la infiltración por leucocitos, constituye un compartimento permisivo para el crecimiento de mutantes de erum que están fuertemente atenuados cuando se inyectan en otros tejidos.Tras la inyección en el saco vitelino de una dosis de 2240 UFC, las bacterias se diseminan durante varios días hacia los tejidos embrionarios y forman agregados similares a granulomas, comparables a los observados con el método convencional de inyección intravenosa. Al realizar este procedimiento, es fundamental recordar que la correcta determinación de la etapa de desarrollo de los embriones de pez cebra es crítica, ya que el sistema inmunitario embrionario adquiere mayor competencia a medida que avanza el desarrollo.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el perfilado del transcriptoma y la inmunohistoquímica para responder preguntas adicionales, como la forma en que el sistema inmunitario innato del embrión responde a infecciones patógenas.

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