Name: A largo plazo Prueba de toxicidad letal con el Crustáceo Artemia franciscana /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 40 s
Description: Aprende a evaluar la toxicidad letal a largo plazo en Artemia franciscana mediante un protocolo estandarizado de 14 días. Este método permite determinar concentraciones letales y evaluar el impacto de contaminantes en organismos marinos.

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Producido por Loredana Manfra del Instituto para la protección del medio ambiente y la investigación (ISPRA-Departamento de Monitoreo de la Calidad Ambiental) y Federica Savorelli de la Agencia Regional para la Protección del Medio Ambiente (Emilia-Romaña, Italia). Los miembros de referencia para el subgrupo de trabajo sobre el crustáceo Artemia en el Grupo de Métodos biológicos - Agua salada / agua salobre y de sedimentos de la Comisión UNICHIM de la Calidad del Agua (el instituto para el funcionamiento de las normas técnicas en el sector químico). Grabación y edición de Marco Pisapia de Ispra (Unidad de la web). Producción de Coordinación de Anna Maria Cicerón y Erika Magaletti del ISPRA (Departamento de Monitoreo de la Calidad Ambiental). Nos gustaría agradecer a la Agencia Regional para la Protección del Medio Ambiente de Emilia-Romaña, Ferrara Rama, el Grupo de Métodos biológicos - Agua salada / salobreEl agua y los sedimentos de la Comisión UNICHIM de Calidad del Agua y Migliore Luciana, la Universidad Tor Vergata (Roma) por su cooperación; Rossella Boscolo y Massimo Gabellini de Ispra (Departamento de Prevención y Mitigación de Impactos) por su apoyo financiero; Matassa Fabio y Londres, el Escuela de Idiomas en Roma por su apoyo lingüístico.

1. Método Estándar Nuestras pruebas consiste en exponer larvas de Artemia a un intervalo de concentraciones de la sustancia o de una muestra de ensayo con el fin de determinar los niveles de concentración o dilución que pudieran causar la muerte del 50% de los organismos (CL 50) expuestos durante 14 días y cumplir con las condiciones definidas por este método. Si es necesario y posible, la siguiente también se puede determinar: a) el nivel de concentración que provoca la muerte de un 20% de los organismos expuestos (LC 20), b) el más alto nivel de concentración analizada que no determina una tasa de mortalidad superior a la de el control negativo (NOEC); el menor nivel de concentración de ensayo que determina, después de 14 días, una tasa de mortalidad mayor que la del control negativo (LOEC). 2. Ensayo de Materiales 2.1 huevos de Artemia Para llevar a cabo las pruebas, Artemia franciscana </emLas larvas&gt; de menos de 48 horas de edad (nauplios) son obligatorios, en la etapa II o III, obtenido a partir de los huevos recién nacidos 5. Los huevos o quistes certificados utilizados para la realización de análisis están disponibles comercialmente, por ejemplo, de la División de Control de Calidad Investigación, EE.UU. Agencia de Protección Ambiental, Cincinnati, OH 45268, EE.UU. o desde el Laboratorio de Investigaciones Biológicas de la Contaminación Acuática de la Universidad de Gante, Bélgica. 2,2 agua de dilución Agua salada sintética se puede utilizar como agua de dilución, preparada por disolución de reconocidos reactivos de calidad analítica o una formulación disponible comercialmente en agua destilada o desionizada. Mezclas de sal para crear el agua salada ideal son comercialmente disponibles, por ejemplo, las mezclas del Océano instantáneos. Se recomienda un agua de dilución con una salinidad igual a 35 (± 2) PSU, así como una concentración de oxígeno disuelto de más de 80% del valor de saturación y una temperatura de 25 (± 2) y°, C. Después de aireación durante 48 horas y la filtración en filtros con una porosidad de al menos 0,45 m, la dilución se pueden almacenar durante un máximo de 30 días en la oscuridad a una temperatura de 0-4 ° C. 2.3 cultivo de algas Se recomienda que los organismos de ensayo son alimentan de microalgas Dunaliella tertiolecta, que crecen exponencialmente y alcanzar densidades de 1.3x10 6 - 2.0x10 6 células / ml. Las pruebas en muestras del medio ambiente requiere de cultivos con densidades superiores a 2.0x10 6 células / ml 6. Se sugiere que Dunaliella tertiolecta crece en un medio de cultivo con agua de mar (30 (± 2) fuente de alimentación y 20 (± 1) ° C) con la adición de nutrientes esenciales, minerales y vitaminas. Algunas indicaciones sobre la composición de las algas y la preparación de los medios de comunicación se presentan en el Apéndice. La densidad celular inicial se sugiere a ser aproximadamente 10 5 células / ml. El cultivo de algas se mantiene en untermostato de ambiente a 20 (± 1) ° C, sistema de iluminación con lámparas fluorescentes de 3000 (± 300) lx, con una relación fotoperíodo de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad. Otras especies de fitoplancton también podría ser utilizado para la alimentación, pero sería necesario realizar estudios comparativos con estas especies de fitoplancton para encontrar el &quot;equivalente&quot; las especies de Dunaliella tertiolecta, debido a las condiciones experimentales (por ejemplo, densidades celulares iniciales, iluminación de luz, temperatura, composición de medios de cultivo y tiempo de exposición) varía entre las especies de fitoplancton. Además de la tolerancia de las microalgas a diferentes contaminantes debe tenerse en cuenta debido a los efectos contaminantes sobre el crecimiento y desarrollo de impacto fitoplancton también a la Artemia. 2.4 Sustancia de referencia La sustancia de referencia en este ensayo es dodecil sulfato de sodio. 2,5 de vidrio para laboratorio <ol><li> Contenedores de prueba con 100 vasos de vidrio de borosilicato (18 ml para realizar las pruebas y 18 para la transferencia de soluciones). </li><li> Un matraz (por ejemplo 500 matraz ml) para preparar la solución estándar. </li><li> Seis frascos (por ejemplo 200 matraces ml) para preparar las soluciones de prueba. </li><li> Vidrio o poliestireno 5 cm de diámetro placas de Petri con desprendible cubre a ser utilizado para la activación de los quistes y transferir Artemia desde el plato de la eclosión de los recipientes de ensayo. </li><li> Pipetas Pasteur de vidrio (con las puntas redondeadas por la llama) para la transferencia de los nauplios. </li><li> De vidrio o de cánulas desechables Pasteur 3 ml pipetas de plástico (para cortar) para la transferencia de Artemia. </li><li> Micropipetas y pipetas graduadas para preparar las soluciones de pruebas. </li><li> Seis cilindros graduados (por ejemplo 50 cilindros ml) para la transferencia de soluciones de evaluación de los matraces a tél probando contenedores. </li></ol> 3. Quiste de activación 3,1. Placas de Petri que contienen quistes + verter el agua Para generar organismos de ensayo, 20 mg de quistes se colocan en una placa de Petri que contiene 12 ml de agua de dilución 48 horas antes del ensayo. 3,2. La incubación en la luz y en la oscuridad La placa de Petri se mantiene a 25 (± 2) ° C y en un 4000 (± 1000) lux (lúmenes por metro cuadrado) intensidad de la luz durante una hora. 3,3. Sustitución del medio utilizando el microscopio Después de 24 horas, las larvas de la eclosión se transfieren a una nueva placa de Petri llena de agua artificial. La transferencia se realiza utilizando el microscopio, es decir, utilizando una fuente de luz de modo que la eclosión, las larvas fototrópico migrar hacia el haz de luz. Una pipeta Pasteur de vidrio se utiliza para realizar la transferencia, asegurando que solamente el naciente larvas are transferido y no los quistes o las larvas todavía en las membranas. 3,4. La incubación en la oscuridad El plato que contiene las larvas se coloca en una cámara termostática oscuridad durante 24 horas a 25 (± 2) ° C. 4. Preparación de las soluciones de prueba 4,1. Un peso de la sustancia + Introducir en el matraz Se recomienda que la solución estándar para la sustancia de prueba se preparó disolviendo 0,5 g de la sustancia en un matraz de 500 ml. El matraz se llena con agua desionizada o destilada y la solución se agita hasta que la sustancia de pruebas se ha disuelto completamente. Las soluciones tienen que ser preparados en el momento de uso, a menos que no se sabe si la sustancia es estable en solución. En ese caso, la solución estándar se pueden preparar hasta dos días antes de la prueba. 4,2. Preparación del control negativo, añadiendo agua de dilución y wi algasª de la pipeta de 10 ml El control negativo se prepara en un matraz (por ejemplo, 200 ml de volumen) mediante la adición de una alícuota de la suspensión de algas en el agua de dilución de modo que una densidad de 10 5 células / ml se obtiene. 4,3. Preparación de las soluciones de pruebas: la adición de agua de dilución, las algas y la solución estándar Se sugiere que las soluciones de ensayo se preparan en cinco matraces de 200 ml mediante la adición de la solución estándar para el agua de dilución en las cantidades especificadas de manera que las concentraciones deseadas para las pruebas se obtiene. Para alimentar los organismos, partes alícuotas de una suspensión microalgas Dunaliella tertiolecta pueden utilizarse y se añadió a alcanzar una densidad de 10 5 células / ml cuando se preparan soluciones de prueba. La siguiente orden de adición, se recomienda: agua de dilución, la suspensión de algas y la solución estándar. Después de la preparación de soluciones de prueba, tienen que ser utilizados en el ensayo tan pronto como sea posible. 4,4. La transferencia de las soluciones de la mufla a los contenedores de prueba, y luego a las placas de Petri Las cantidades iguales (50 ml) de las soluciones de ensayo se introduce en los recipientes de ensayo utilizando la probeta graduada. Tres réplicas para cada concentración se realizan. Para cada serie de pruebas, un contenedor de control se prepara con una cantidad de agua de dilución igual al volumen de las soluciones de ensayo. Volúmenes iguales (aproximadamente 12 ml) de las soluciones de ensayo se introducen en las placas de Petri. Para cada serie de pruebas, un plato de Petri de control se utiliza. 5. Preparación para las pruebas 5,1. Nauplios en la fase II-III Cuarenta y ocho horas después de la activación de quistes, los nauplios llegar a la fase II-III de las larvas y luego son utilizables para la prueba. 5,2. Nauplios de transferencia en las placas de Petri utilizando el microscopio La placa de Petri utilizado para quiste<html> activación se saca de la cámara termostática. Una pequeña cantidad de larvas se transfieren a las placas de Petri que contenían el control y las soluciones de prueba. Esta tarea se va a realizar con el microscopio utilizando una pipeta de diámetro suficientemente grande para que los organismos no se dañan. En esta fase de la prueba, la transferencia se puede realizar con una pipeta Pasteur de vidrio (con punta redondeada por llama) y una fuente de luz situada lateralmente que fomenta la Artemia a agregarse. 5,3. Nauplios transferencia de las placas de Petri en los contenedores de prueba con el microscopio Diez larvas se transfieren desde los platos Petri soluciones de ensayo a los recipientes de ensayo. También esta operación tiene que ser realizado mediante la utilización de la pipeta Pasteur y microscopio. Se recomienda que un volumen que no exceda de 1 ml se transfiere durante el paso de las larvas de no afectar el volumen total del sistema de prueba. e_step &quot;&gt; 5.4. los envases llenos de cubierto con parafilm Los vasos de precipitados de ensayo están cubiertas con parafilm (dejando un hueco para el paso de aire), y se mantuvo a una temperatura de 25 (± 2) ° C durante toda la duración de la prueba y en una iluminación de 900 (± 100) lx con un fotoperíodo razón de 14 horas de luz de 10 horas de oscuridad. 6. Sustitución del Suplemento media y la Alimentación 6,1. Supervivencia de control de la frecuencia Dos días después de la prueba ha comenzado, y después de los días 5, 7, 9 y 12 de la Artemia se observa bajo el microscopio para verificar la tasa de supervivencia y para reemplazar el medio y el suplemento alimenticio. Número de organismos vivos se cuenta en cada recipiente de ensayo. Después de la observación bajo el microscopio y la estimulación ligera mecánica (por ejemplo, tocar las larvas con una pipeta Pasteur de vidrio) los organismos que no muestran un cierto movimiento en torno al 10 segundos debe considerarse muerto. 6,2. Preparación de una solución de ensayo que muestra muestreo algas con una pipeta de 10 ml y de muestreo de la sustancia de ensayo con una micropipeta. La transferencia de las soluciones de la mufla a los recipientes de prueba Aunque las pruebas, las soluciones de ensayo debe ser reemplazado periódicamente, y se preparó en el mismo día que se van a utilizar. Las soluciones de ensayo se hacen de la solución estándar previamente preparada. 6,3. Artemia transferencia, utilizando una pipeta Pasteur de corte, de los contenedores de prueba de edad para los tres nuevos contenedores La transferencia de Artemia se realiza mediante el uso de una pipeta con un diámetro lo suficientemente amplio como para no dañar los organismos. Durante esta fase, un plástico de 3 ml pipeta Pasteur (a cortar) puede ser utilizado. 6,4. Las larvas en un vaso que contiene ya sea en vivo o muerto Artemia Después de 1<html> 4 días de exposición al final de la prueba, el número de larvas supervivientes se contaron y se registran en la hoja de cálculo. LC 50 y / o LC 20, NOEC y LOEC de 14 días, se calculan y registran, así como los límites de confianza al 95% su caso, métodos y cálculo. 7. Los resultados representativos Al final de la prueba (14 días), se calcula el porcentaje de mortalidad para cada concentración, de acuerdo con la siguiente fórmula: (M s / N) * 100 Donde: M s es el número promedio de personas murieron en la muestra analizada N es el número total de personas expuestas El cuadro 1 muestra un ejemplo de los datos de prueba (14d) con Artemia expuestos a dodecil sulfato de sodio. <table border="1"><tbody><tr><td> Las concentraciones (mg / l) </td>&quot;&gt; Número de personas murieron en cada réplica </td><td> Mortalidad (%) </td></tr><tr><td></td><td> Yo </td><td> II </td><td> III </td><td></td></tr><tr><td> El control negativo </td><td> 0 </td><td> 2 </td><td> 1 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 1,56 </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 0 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 3,12 </td><td> 2 </td><td> 0 </td><td> 2 </td><td> 13 </td></tr><tr><td> 6,25 </td><td> 3 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 27 </td></tr><tr><td> 12,5 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 90 </td></tr><tr><td> 25,0 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 50,0 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 100 </td></tr></tbody></table> Además, determinar elCL 50 por un valor de trama gráfica gaussiana logarítmica o el uso de métodos estadísticos apropiados (por ejemplo, de Spearman-Karber o método de prueba). El cálculo de LC 50 para los datos de la tabla 1 es 8,18 (7,15-9,37) mg / l. Si la concentración máxima probada causó una menor tasa de mortalidad del 50%, no debe proceder al cálculo del valor LC 50 que luego sería poco fiable o incluso no computable. En este caso, sin embargo, sería apropiado para repetir la prueba mediante la ampliación de la gama de concentraciones ensayadas. Por otra parte, el valor LC 50 más correctamente expresado como mayor que la concentración más alta probada, lo que posiblemente indica el porcentaje de mortalidad en la concentración más alta probada y la mayor concentración corresponde a un efecto que no. Los resultados se consideran válidas si al final de la prueba de las siguientes condiciones se han cumplido: <ol class="lalpha"><li> el control de la tasa media de mortalidades ≤ 20%; </li><li> donde utilizando dodecilsulfato de sodio, la LC 50 a los 14 días está incluido en el 8,0 (± 5) mg / l de intervalo. </li></ol> Si las condiciones anteriores no se han cumplido, todos los datos obtenidos con el mismo lote de organismos debe ser considerada no válida y se repite la prueba.

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<li>Qualitá dell'acqua - Determinazione della tossicitá letale a 14 giorni con Artemia franciscana (Crustacea: Anostraca). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Commissione+UNICHIM+%22Qualit%C3%A1+dell%27acqua%22+Gruppo+di+Lavoro+%22Metodi+Biologici%22+Sottogruppo+%22Acque+salate%2Fsalmastre+e+sedimenti%22%22">Commissione UNICHIM "Qualitá dell'acqua" Gruppo di Lavoro "Metodi Biologici" Sottogruppo "Acque salate/salmastre e sedimenti"</a>. , UNICHIM. (2010).</li>
<li>Varo, I., Navarro, J. C., Amat, F., Guilhermino, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+cholinesterases+and+evaluation+of+the+inhibitory+potential+of+chlorpyrifos+and+dichlorvos+to+Artemia+salina+and+Artemia+parthenogenetica%5BTitle%5D)+AND+%22Chem%22%5BJournal%5D)">Characterisation of cholinesterases and evaluation of the inhibitory potential of chlorpyrifos and dichlorvos to Artemia salina and Artemia parthenogenetica.</a> Chem. 48, 563-569 (2002).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Artemia es uno de los organismos de prueba más valiosas disponibles para los ensayos de ecotoxicidad y la investigación realizada hasta el momento nos permite afirmar que es posible sostener varias opciones relacionadas con el uso de Artemia en toxicología y ecotoxicología. Las características que hacen de este organismo en una especie adecuada para los bioensayos son: una amplia distribución geográfica, alta adaptabilidad a condiciones ambientales adversas y nutrientes variados, la cultura de laborato...

Producido por Loredana Manfra del Instituto para la protección del medio ambiente y la investigación (ISPRA-Departamento de Monitoreo de la Calidad Ambiental) y Federica Savorelli de la Agencia Regional para la Protección del Medio Ambiente (Emilia-Romaña, Italia). Los miembros de referencia para el subgrupo de trabajo sobre el crustáceo Artemia en el Grupo de Métodos biológicos - Agua salada / agua salobre y de sedimentos de la Comisión UNICHIM de la Calidad del Agua (el instituto para el funcionamiento de las normas técnicas en el sector químico). Grabación y edición de Marco Pisapia de Ispra (Asesor Científico y Servicios de Documentación). Producción de Coordinación de Anna Maria Cicerón y Erika Magaletti del ISPRA (Departamento de Monitoreo de la Calidad Ambiental). Nos gustaría agradecer a la Agencia Regional para la Protección del Medio Ambiente de Emilia-Romaña, Ferrara y Poder de la BiologGrupo de Metodología en iCal - Agua salada / agua salobre y de sedimentos de la Comisión UNICHIM de la Calidad del Agua por su cooperación; Rossella Boscolo y Massimo Gabellini de Ispra (Departamento de Prevención y Mitigación de Impactos) por su apoyo financiero, y la London School of Languages ​​en Roma por su apoyo lingüístico. <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número del producto </td></tr><tr><td> Dodecilsulfato sódico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L4390 </td></tr></tbody></table> Apéndice El alga los medios de comunicación tiene que estar preparado con reactivos analíticos de calidad. Un litro de solución nutriente se preparó disolviendo 300 g de NaNO 3, 30 g de KH 2 g PO 4 y 20 de NH 4 Cl en agua destilada. Cuatro soluciones iniciales (A, B, C, D) De minerales se preparan como sigue: <ul><li> Un litro de solución &quot;A&quot; que contiene 30 g de ZnSO 4 H 2 O, 25 g de CuSO 4 5 H 2 O, 30 g de CoSO 4 7 H 2 O y 20 g de MnSO 4 H 2 O en agua destilada; </li><li> Un litro de solución &quot;B&quot; que contiene 50 g de FeCl 3 • 6 H 2 O en agua destilada; </li><li> Un litro de solución &quot;C&quot; que contiene 25 g de Na 2 MoO 4 • 2 H 2 O en agua destilada; </li><li> Un litro de solución &quot;D&quot; que contiene 50 g de Na 2 EDTA di • 2 H 2 O en agua destilada. </li></ul> Un litro de una solución final de los minerales (solución &quot;E&quot;) se obtiene añadiendo partes alícuotas de las soluciones arriba mencionadas a agua destilada. La siguiente orden de adición se recomienda: 100 ml de solución de &quot;D&quot;, 10 ml de solución de &quot;C&quot;, 10 ml de solución &quot;B&quot; y 10 ml de solución &quot;A&quot;. Tres iniciativassoluciones l (F, G, H) de las vitaminas se preparó como sigue: <ul><li> Un litro de solución &quot;F&quot;, que contiene 100 mg de biotina en agua destilada; </li><li> Un litro de solución &quot;T&quot; que contiene 10 g de tiamina en agua destilada; </li><li> Un litro de solución &quot;H&quot; que contiene 100 mg de cobalamina en agua destilada. </li></ul> Un litro de una solución final de vitaminas (solución &quot;I&quot;) se obtiene añadiendo 10 ml de las tres soluciones iniciales a agua destilada. Un litro de la algas medios se prepara disolviendo 1 ml de la solución nutritiva, 1 ml de la solución mineral final (solución &quot;E&quot;) y 1 ml de la solución de vitaminas final (solución &quot;I&quot;) en agua de mar. Este último puede ser obtenida disolviendo reconocidos reactivos de calidad analítica o una formulación disponible comercialmente en agua destilada o desionizada. Mezclas de sal para crear el agua salada ideal son comercialmente disponibles, por ejemplo, las mezclas del Océano instantáneos. Se trata de recomendacionesDed la utilización de agua de mar con una salinidad de 30 (± 2) fuente de alimentación y temperatura de 20 (± 1) ° C.

a largo plazo prueba de toxicidad letal con el crustáceo artemia franciscana</em

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Nuestras actividades de investigación como objetivo el uso de métodos biológicos para la evaluación de la calidad ambiental, con especial referencia al agua salada / agua salobre y de sedimentos. La elección de los indicadores biológicos debe estar basada en el conocimiento científico confiable y, posiblemente, de la disponibilidad de procedimientos normalizados. En este artículo, presentamos un protocolo estandarizado que se utiliza el medio marino crustáceo Artemia para evaluar la toxicidad de productos químicos y / o de matrices ambientales marinas. Los científicos proponen que la artemia (Artemia) es un candidato adecuado para el desarrollo de un bioensayo estándar para la utilización en todo el mundo. Una serie de documentos han sido publicados sobre los efectos tóxicos de diversos productos químicos y sustancias tóxicas en artemia (Artemia). La principal ventaja de este crustáceo de los estudios de toxicidad es la disponibilidad total de los quistes secos, los cuales pueden ser inmediatamente utilizado en las pruebas y difícil cultivo no se exigió <sup&gt; 1,2. Quiste basados ​​en ensayos de toxicidad son baratos, disponible de forma continua, sencilla y fiable y, por tanto una respuesta importante a las necesidades rutinarias de detección de toxicidad, por los requisitos de control industrial o con fines de regulación 3. El método propuesto consiste en la mortalidad como criterio de valoración. El número de supervivientes se contaron y el porcentaje de muertes se calcularon. Las larvas se considera muerto si no realiza movimientos internos o externos durante varios segundos de observación 4. Este procedimiento fue las pruebas estandarizadas de una sustancia de referencia (dodecil sulfato de sodio), y algunos resultados se presentan en este trabajo. En este artículo se acompaña de un vídeo que describe la realización de las pruebas de toxicidad de procedimiento, que muestra todos los pasos relacionados con el protocolo.

Este estudio se refiere al desarrollo y la estandarización de un protocolo metodológico para determinar el valor a largo plazo (14 días) toxicidad letal ejercida por las sustancias químicas, aguas residuales industriales o de aguas residuales y líquidos de muestras ambientales en el crustáceo de agua salada,<em&gt; Artemia franciscana</em&gt;.

A largo plazo Prueba de toxicidad letal con el Crustáceo Artemia franciscana</em

Nuestras actividades de investigación se centran en el uso de métodos biológicos para la evaluación de la calidad ambiental, con especial referencia a las aguas saladas/salobres...

Somos Laura Manfra y Federica Selli, investigadoras del Instituto Superior para la Protección y la Investigación Ambiental, ISRA, departamento del Laboratorio de Monitoreo de la Calidad Ambiental del Fitoplancton, Ecotoxicología y Ecología. Nuestras actividades de investigación se centran en el uso de métodos biológicos para la evaluación de la calidad ambiental, con especial referencia al agua salada, agua salobre y sedimentos. Nuestro último estudio aborda el desarrollo y la estandarización de un valioso protocolo metodológico para determinar la toxicidad letal a largo plazo de 14 días ejercida por sustancias químicas, residuos industriales, aguas residuales o muestras ambientales líquidas sobre el crustáceo marino *Artemia franciscana*.Este video describe la realización de pruebas de toxicidad procedimental. Nuestras pruebas consisten en exponer larvas de artia a una serie de concentraciones de una sustancia o a una muestra de ensayo con el fin de determinar la concentración o los niveles de dilución que provocarían la muerte del 50 % de los organismos expuestos durante un período de 14 días, cumpliendo así las condiciones definidas por este método. Si es necesario y posible, también se pueden determinar los siguientes parámetros.El nivel de concentración que provoca la muerte del 20 % de los organismos expuestos es el nivel más alto de concentración analizado que no determina una tasa de mortalidad mayor que la del control negativo, y el nivel más bajo de concentración ensayado que determina, tras 14 días, una tasa de mortalidad superior a la del control negativo. Para realizar las pruebas, nuestro equipo requirió larvas de Franciscan de menos de 48 horas de edad, en estadio dos o tres, obtenidas de huevos recién eclosionados. Puede utilizarse agua salina sintética como agua de dilución, preparándola mediante la disolución de reactivos de calidad analítica reconocida o una formulación comercialmente disponible en agua destilada o desionizada.Después de la agitación durante 48 horas y la filtración en filtros con una porosidad de al menos 0,45, puede conservarse la dilución durante un máximo de 30 días en la oscuridad. A una temperatura de cero a cuatro grados, debe alimentar a los organismos de prueba con microalgas Ella Ter, que crecen exponencialmente con densidades entre 1,3 × 10⁶ y 2,0 × 10⁶ células/mL. La sustancia de referencia en este ensayo es el sulfato de dodecilsodio.Además del equipo de laboratorio habitual, también necesitará los siguientes recipientes para pruebas, incluyendo vasos de vidrio de borosilicato de 100 milímetros, un matraz de 500 milímetros para preparar la solución patrón, de seis a cien matraces de milímetros para preparar las soluciones de prueba, placas de Petri de vidrio o polímero de cinco centímetros de diámetro con tapas desmontables para activar los quistes y transferir las artemias desde el recipiente de eclosión hasta los recipientes de prueba. Pipetas Pasteur de vidrio, cuyas puntas han sido redondeadas con llama para transferir las artemias, o pipetas plásticas desechables de tres milílitros que se cortarán para transferir las artemias, micropipetas y pipetas graduadas para preparar las soluciones de prueba. Seis cilindros graduados de 50 milílitros para transferir las soluciones de prueba desde los matraces hasta los recipientes de prueba con el fin de generar los organismos de prueba.Coloque 20 miligramos de quistes en una placa de Petri que contenga 12 mililitros de agua de dilución 48 horas antes de la prueba. Mantenga la placa a 25 grados y a una intensidad de luz de 4.000 lúmenes por metro cuadrado durante una hora. Después de 24 horas, transfiera las larvas emergidas a una nueva placa de Petri llena con agua artificial.Realice la transferencia con el microscopio utilizando una fuente de luz para que las larvas fototrópicas recién eclosionadas migren hacia el haz de luz. Use una pipeta de vidrio de Pasteur para realizar la transferencia, asegurándose de que solo transfiera las larvas emergentes y no las quistes ni las larvas aún dentro de las membranas. Coloque el recipiente que contiene las larvas en una cámara termostática oscura durante otras 24 horas a 25 grados.La solución patrón para la sustancia de prueba debe prepararse disolviendo medio gramo de la sustancia en un matraz de 500 mililitros. Complétese con agua desionizada o destilada y agítese hasta que se disuelva completamente. Las soluciones deben prepararse en el momento de su uso, a menos que no se sepa si la sustancia es estable en solución.En ese caso, puede preparar la solución patrón hasta dos días antes de la prueba. Debe preparar el control negativo en un matraz de 200 mililitros añadiendo una cantidad adecuada de una suspensión de algas al agua de dilución, de modo que obtenga una densidad de 10 elevado a la potencia de cinco células. Las soluciones de prueba deben prepararse en matraces de cinco a cien mililitros añadiendo la solución patrón al agua de dilución en la cantidad especificada para obtener las concentraciones deseadas para la prueba.Para alimentar a los organismos, debe usar una suspensión de microalgas de la especie *Dunaliella tertiolecta*, añadiéndolas al preparar las soluciones de prueba hasta alcanzar una densidad de 10 elevado a cinco células por mililitro. Pero antes de comenzar, le recomendamos seguir este orden de adición: dilución, suspensión algal y luego la solución patrón. Introduzca cantidades iguales, 50 mililitros de las soluciones de prueba, en los recipientes de ensayo utilizando el cilindro graduado.Prepare tres réplicas para cada concentración en cada serie de pruebas. Prepare un recipiente de control con una cantidad de agua de dilución igual al volumen de las soluciones de ensayo. Introduzca volúmenes iguales, aproximadamente 12 mililitros, de las soluciones de ensayo en las placas de Petri.Para cada serie de pruebas, prepare un plato de Petri control. 48 horas después de la activación de los quistes, las larvas alcanzarán el segundo o tercer estadio larval y ya estarán listas para su uso en pruebas. Saque el plato de Petri que utilizó para la activación de los quistes de la cámara termostática.Transfiera una pequeña cantidad de larvas a las placas de Petri que contienen las soluciones control y de prueba. En esta fase del ensayo, puede realizar la transferencia con una pipeta de vidrio cuya punta ha sido redondeada con llama y una fuente de luz colocada lateralmente, lo que favorece la agregación de las artemias. Transfiera 10 larvas desde las soluciones de prueba.Placas de Petri a los recipientes de prueba. Realice también esta operación utilizando la pipeta previa y cubra los vasos de precipitados de prueba con parafilm, dejando una abertura para el paso de aire, manteniéndolos a una temperatura de 25 grados durante toda la duración del ensayo. Y a una iluminación de 900 lúmenes por metro cuadrado con una relación fotoperiódica de 14 horas de luz a 10 horas de oscuridad, dos días después del inicio de la prueba.Luego, tras 5, 7, 9 y 12 días, observe las artias al microscopio y verifique su tasa de supervivencia. Debe considerarse muerto a cualquier organismo que no muestre algún movimiento durante aproximadamente 10 segundos al reemplazar el medio y los suplementos alimenticios. Durante la prueba, debe reemplazar periódicamente las soluciones de ensayo, preparándolas el mismo día en que se vayan a utilizar.Prepare las soluciones de prueba a partir de la solución estándar que preparó previamente. Realice la transferencia ARTIA utilizando EPI PET con un diámetro suficientemente amplio para no dañar a los organismos durante esta fase. Puede utilizar una pipeta plástica de póster de tres milímetros que se cortará después de 14 días de exposición.Al finalizar las pruebas, cuente el número de larvas sobrevivientes y registre el resultado en su hoja de trabajo. Calcule la CL50 y/o la CL20, la NOEC y la LOEC a los 14 días e informe sus valores. Los límites de confianza al 95 % fueron apropiados, así como los métodos de cálculo.Si al final de la prueba se han cumplido las siguientes condiciones, la tasa media de mortalidad de los controles es menor o igual al 20 % y se está utilizando dodecilsulfato de sodio. La CL50 a 14 días se encuentra incluida en el intervalo de 8,0 miligramos por litro. Si no se han cumplido las condiciones anteriores, todos los datos obtenidos con el mismo lote de organismos deben considerarse inválidos y debe repetirse la prueba.

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Investigación

JoVE Journal

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