Name: Monitoreo en tiempo real de las interacciones ligando-receptor con transferencia de energía de resonancia fluorescente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: Aprende a monitorear interacciones ligando-receptor mediante transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET) utilizando liposomas de polidiacetileno (PDA) funcionalizados. Este método permite detectar biomoléculas con alta sensibilidad.

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El apoyo financiero para este trabajo fue proporcionado por la National Science Foundation, National Institute of Health (NIH), el Centro de Tecnología de Materiales (MTC) y la ORDA en SIUC. Damos las gracias a una subvención NSF (CHE-0959568) para la compra de un FE-SEM. Nos gustaría dar las gracias al profesor Mateo McCarroll útil para los debates. Julia Reyes agradecer a COLCIENCIAS, Agencia Colombiana y la Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia por su erudición y apoyo financiero.

A. Síntesis y Caracterización de liposomas PDA 4,5,6 Nota 1: Proteger la solución PDA de la luz utilizando envoltorio de papel de aluminio en cada recipiente a través de todas las etapas experimentales. Nota 2: Dos conjuntos diferentes de solución de liposomas (B y C) se prepararon siguiente procedimiento A (Síntesis y caracterización de liposomas PDA). 1. Síntesis de N-hidroxisuccinimida Diacteylene (NHS-PCDA) <ol><li> Para preparar liposomas, un ingrediente esencial PCDA-NHS es necesario. Hemos sintetizado PCDA-NHS mediante el siguiente procedimiento: </li><li> Añadir 10,12-pentacosadiynoic ácido (PCDA) (0,267 g, 0,713 mmol), N-hidroxisuccinimida (0,0914 g, 0,786 mmol) y 1 - (3 - (dimetilamino) propil)-3-etilcarbodiimida (0,144 g, 0,713 mmol ) en seco CH 2 Cl 2 (20 ml). </li><li> Se agita la solución a temperatura ambiente durante 2 h. </li><li> Retire cuidadosamente el disolvente mediante el uso de rotary evaporador para producir una película delgada seca. </li><li> Use embudo de separación para extraer el residuo con éter dietílico (25 ml) y agua (25 ml) tres veces. </li><li> Se seca la capa orgánica con MgSO 4 (1,0 g) durante media hora. Filtrar y eliminar el disolvente por evaporación rotatoria para obtener un polvo sólido blanco (0,24 g,&gt; 90%). </li><li> Analizar compuesto final en virtud de Resonancia Magnética Nuclear (RMN). </li><li> 1 H RMN (300 MHz, DMSO), δ (ppm): 0,893 (t, 3H), 1,268 (m, 26H), 1,512 (m, 4H), 1,754 (m, 2H), 2,252 (t, 4H), 2,365 (m, 1H), 2,610 (m, 1H), 2,842 (s, 2H). </li></ol> 2. Preparación de liposomas 5,6,7 <ol><li> Disolver PCDA: PCDA-NHS: 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC) :: 8: 1: 1 en 20 ml de diclorometano. </li><li> Filtrar la solución con un papel de filtro para eliminar los agregados. </li><li> Se evapora el disolvente completamente para producir una película delgada de monómeros. </li><li> Seque la película fina durante la noche bajo vacuum. </li><li> Hidratar la película con agua desionizada (50 ml) para hacer una solución de liposomas de la concentración deseada (0.65 a 1 mM). </li><li> Someter a ultrasonidos la suspensión resultante con un sonicador de sonda a 76 ° C durante ~ 18 min. </li><li> Cuidadosamente pasar la solución a través de un filtro de papel para eliminar los agregados de lípidos </li><li> Se enfría la solución a 4 ° C durante la noche para promover la auto-ensamblaje de los monómeros. La solución final debe ser ópticamente transparente. </li><li> Polimerizar los monómeros de diacetileno autoensambladas (liposoma) por irradiación con 254 nm de la radiación UV durante ~ 2 min utilizando una fuente de UV Ray Pen (4,5 mW / cm 2) en el aire. </li><li> La solución de liposomas era estable a temperatura ambiente durante al menos dos semanas. La solución fue más estable cuando está refrigerada. </li></ol> B. Preparación de Rodamina-etiquetados albúmina de suero bovino (BSA-Rh) modificados liposomas PCDA 1. La unión de BSA-Rh a la superficie del liposoma <ol><li> Disolver BSA en PBS-Rh buffer (concentración iónica fue 0,01 M, pH 7,2) para hacer que la concentración final de 1,2 M de solución de BSA-rodamina. </li><li> Añadir 2 ml (1,2 mM) de BSA-Rodamina a 10 ml de solución de liposomas preparada en la etapa A.2. (Véase más arriba) a temperatura ambiente. </li><li> Reacción clásica para la unión de grupos amino del residuo de lisina de las proteínas a ácido carboxílico activado por NHS grupo se ha seguido (esquema de reacción en la Figura 2). NHS-PCDA fue diseñado (Figura 2, etapa 1) para covalentemente moléculas de unión a proteínas con liposomas utilizando NHS-amina reacciones (Figura 2, Paso 2). NHS es un excelente agente dejando que impulsa la reacción de amina de ácido carboxílico en la dirección de avance. El rendimiento de esta reacción en las condiciones adecuadas deben ser cuantitativos. </li><li> La eliminación de BSA libre-Rh: Remoje un Spectra / Por Biotech éster de celulosa (CE) membrana (PM C O: 100.000) en agua desionizada water durante 15 min. Esta membrana se utiliza para la diálisis de reaccionar BSA-rodamina (peso molecular ~ 66000 Da) en agua desionizada. </li><li> Transferir cuidadosamente la solución en la membrana de diálisis. </li><li> Cambiar el agua a las 2 h, 8 h, 14 h, 24 h, 36 h y durante la diálisis. </li><li> Recoger la solución final en un frasco cubierto con papel de aluminio. </li></ol> C. Preparación de SR-diamina y biotina-etiquetados liposomas 1. En lugar de utilizar DMPC en el paso 2,1, utilizaremos biotina-etiquetados-(1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(biotinil) (biotina-DOPE). <ol><li> Siga todos los pasos a través de 2,2 a 2,9. </li><li> En lugar de BSA-Rh en el paso B, el uso Diamina Sulphorodamine etiquetados (SR-diamina). </li><li> Siga todos los pasos en B. </li><li> Los liposomas en esta preparación contenía biotina y SR-diamina en sus superficies. Los pasos subsiguientes fueron similares a A y B (ver arriba) con una excepción: estreptavidina se añadió a la solutia investigar biotina-estreptavidina interacciones a través de cambios en la eficiencia de FRET. </li></ol> D. Representante Resultados <img alt="Figura Título" src="/files/ftp_upload/3805/3805figtitle.jpg" /> Figura título. Una historieta explicar la reacción y FRET proceso que ocurre en la superficie del liposoma (preparado siguiendo el paso B). A. Seguimiento de unión a proteínas a liposomas utilizando FRET 1 Monitoreo de FRET entre la rodamina y liposomas PDA preparados en la etapa B. Los espectros de excitación y emisión de BSA-Rh y espectro de absorción de PDA se toman (Figura 3A). Podemos ver claramente que el espectro de emisión de BSA-Rh se solapa con el espectro de absorción de PDA. Esto satisface el requisito de resonancia para el mecanismo de FRET. BSA-rodamina liposomas etiquetados antes y después de la polimerización se analizaron con UV-Vy es la espectroscopia de fluorescencia. Para el donante y el aceptor aislado, la eficiencia de FRET es altamente dependiente de la distancia donante-aceptor (r) y J 1 (valor p). La extinción de la emisión se observó (Figura 3B) porque de FRET entre la rodamina y PDA debido a la aparición de espectro electrónico de absorción de PDA azul después de la fotopolimerización. En nuestro caso, la eficiencia de FRET es cero para los liposomas no polimerizados y rodamina porque J = 0 para los liposomas no polimerizados en la región visible. Se realizaron experimentos similares con sólo liposomas PDA que no contenían NHS en su superficie. En estos casos, BSA-Rh no fue etiquetada para la superficie de los liposomas. En ese caso, la distancia media entre la rodamina y PDA (r promedio) fue mucho mayor que el radio de Forster (R 0 = 2,8 nm). Por lo tanto, no se observó una gran disminución en la intensidad de fluorescencia. Esta observación de unlso sugiere que la extinción de la fluorescencia es dominante cuando r &lt;2,8 nm. J y R 0 valores se calcularon utilizando las fórmulas siguientes: [1] J (λ) = ∫ F D (λ) ε A (λ) λ 4 dλ R 0 = 0,211 [k 2 n -4 Q D J (λ)] 1/6 El coeficiente de extinción (ε) de azul-PDA está en el intervalo de ~ 2000-10000 M -1 cm -1 antes de la adición de estreptavidina. El coeficiente de extinción de azul-PDA es dependiente de la condición de la foto-polimerización. [2] Por ejemplo, los valores varepsilon será mayor para una solución que se polimerizó un tiempo más largo. Además, el auto-ensamblaje de los monómeros diacetileno también puede afectar a los valores e. El calcul Jciones tomar en cuenta estos cambios, y reflejan los cambios en los coeficientes de extinción debido a la PDA biotina-estreptavidina interacciones moleculares. valores de J se calculan mediante la absorción PDA experimental y SR-101 Datos de las emisiones. Los cambios en los valores de J son debido a cambio en el espectro electrónico de absorción de PDA después de la adición de estreptavidina a la solución (Figura 4C). La unidad de los valores de J es de M -1 cm -1 nm 4. B. Supervisión de FRET con la adición de estreptavidina-biotina a la solución de liposomas etiquetados Nota 1: Monitoreo de FRET entre rodamina y PDA liposomas preparados en el paso C anterior. Los espectros de excitación y emisión de Sulphorodamine-etiquetados diamina (SR-diamina) y el espectro de absorción de la PDA se toman (Figura 4A). Liposomas no polimerizados y biotina polimerizado etiquetadas se analizaron mediante UV-Visy espectroscopia de fluorescencia. La emisión de la rodamina (SR-101) se reduce en aproximadamente un 45% después de la polimerización (Figura 4B), sugiriendo temple de emisión debido a la FRET. Añadir 40 ml de alícuotas (1 M) de solución de estreptavidina a 2 ml de solución de liposomas. Con la adición de estreptavidina a la solución, los cambios en el valor de J se observó (Figura 4C). Como biotina se une a la estreptavidina, la intensidad del pico azul de PDA liposoma (centrado a ~ 645 nm en la Figura 1) se redujo mientras que un aumento en el pico de absorción a 540 nm se observa (F igura 1S). Figura 4D muestra los cambios en la FRET eficiencia. La eficiencia de FRET disminuyó con el aumento en la concentración de estreptavidina también es consistente con nuestra predicción. Registre la emisión SR después de cada adición alícuota de 40 l de estreptavidina. Se observó un aumento constante en la emisión de rodamina después de la adición de streptavidina (Figura 5). Este aumento en la emisión de rodamina es debido a una disminución en el valor de J para el espectro de emisión Sulphorodamine y espectro de absorbancia PDA siguiendo las interacciones de biotina-estreptavidina. A nivel molecular, las interacciones biotina-estreptavidina conducir a cambios sutiles en la longitud de la conjugación eficaz de la PDA que resulta en una disminución en la forma azul-PDA a una más estable termodinámicamente rojo-PDA forma 2. Esta es la base de los cambios en los valores de J. Curiosamente, las diferencias sutiles en las interacciones moleculares para la biotina unida covalentemente o no covalentemente a liposomas PDA se puede probar usando nuestro ensayo de detección 4. También hemos realizado experimentos de control y han monitorizado la emisión de las muestras de control en las mismas condiciones experimentales como los de estreptavidina-biotina sistema. Los experimentos de control se componen de: (1) soluciones de liposomas que contenían biotina en susuperficie se añadieron una solución tampón de mismo volumen y concentración, y (2) solución de liposomas sin receptores de biotina en su superficie se añadieron estreptavidina de mismo volumen y concentración. La intensidad del solución de biotina-etiquetados liposomas después de la adición de estreptavidina mostró intensidad mejorada, pero la intensidad de la solución de liposomas de los experimentos de control (por ejemplo, véase Figura 2S), por otra parte, mostraron una disminución en la intensidad de emisión. Esto se atribuye a la dilución de la solución. Estos experimentos indican claramente que la emisión mejorada de la solución se debe a interacciones moleculares específicas. Radio Forster (R 0) para el par de rodamina y PDA se calcula (ecuación 2) ser ~ 2.80 nm. Esto significa que para aisladas PDA-rodamina pares, 50% de las moléculas de rodamina estado excitado tendrá su energía transferida al PDA cuando r es 2,80 nm. Nos obs<html> erved que cuando la biotina se une covalentemente a la cadena principal PDA, el incremento de las emisiones fue 2-3 veces mayor que el de forma no covalente de biotina unido a liposomas. 4 Estos resultados sugieren fuertemente que el sistema propuesto es sensible para distinguir diferencias sutiles en las interacciones en el transductor (enlazador entre la biotina y la bicapa de liposomas) debido a los receptores unidos covalentemente y no covalentemente unidos a liposomas. Dependiendo de las capacidades de adquisición de exploración y datos del espectrofotómetro, supervisión en tiempo real (en milisegundos a segunda escala de tiempo) de las interacciones proteína (en la espectroscopía UV-Vis) son posibles con este sistema de detección. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig1.jpg" /> Figura 1. Espectros de absorción de soluciones PDA azul y rojo. (Recuadro) micrografías ópticas tomadas con una cámara digital. g &quot;/&gt; Figura 2. El esquema de reacción para la síntesis PCDA-NHS (paso 1). La reacción del PCDA-NHS al sustituyente amina de proteínas (paso 2). El paso 2 es la base de la unión de los residuos de lisina de las proteínas en el ácido carboxílico del PCDA monómero. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3805/3805fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . <img alt="Figura 3A" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig3A.jpg" /> La Figura 3A. Cambio en la observada FRET eficiencia se debe a los cambios en el espectro de absorción de la PDA. Antes de polimerización no hay solapamiento entre BSA-Rh emisión y absorción PDA, pero después se superpone polimerización absorción PDA con BSA-Rh emisión, que es el requisito para FRET. Rodamina es un donante (rojo) y liposomas polimerizados PDA actuar como un aceptor (azul). <img alt="Figura 3B" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig3B.jpg" /> Figura3B. Espectros de fluorescencia de BSA-Rh liposomas etiquetados antes (azul) y después de la polimerización PCDA (rojo). Una gran disminución en la emisión de rodamina se observó debido a la FRET entre la rodamina y PDA. <img alt="Figura 4A" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig4A.jpg" /> La Figura 4A.. Solapamiento espectral (J) para el cambio del espectro de absorción PDA (azul o rojo) y el espectro de emisión Sulphorodamine (naranja) La Figura 4A es el espectro representativo para condiciones extremas, es decir, cuando un exceso de estreptavidina se añadió a la solución. La Figura 4A muestra una casi completa azul a rojo transformación PDA después de la adición de un exceso de estreptavidina. Se ve claramente que J (solapamiento espectral) aumenta con azul de desplazamiento del espectro de absorción PDA <img alt="Figura 4B" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig4B.jpg" /> La figura 4B. Espectros de fluorescencia antes (azul) y después (red) polimerización liposoma. <img alt="Figura 4C" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig4C.jpg" /> Figura 4C Estado para FRET:. J cambio entre el donante (Sulphorodamine) y aceptor (PDA) con la adición de estreptavidina para la solución de liposomas. <img alt="Figura 4D" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig4D.jpg" /> Figura 4D. FRET cambio en la eficacia entre el donante (Sulphorodamine) y aceptor (PDA) con la adición de estreptavidina a la solución de liposomas. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig5.jpg" /> Figura 5. Rodamina espectro de emisión después de la adición de partes alícuotas de estreptavidina a la solución de liposomas PDA. El recuadro muestra una vista más grande de los cambios en los espectros de emisión SR-101.

<ol><li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLakowicz%2C+JR+%22Principles+of+Fluorescence+Spectroscopy%22">Principles of Fluorescence Spectroscopy</a>. , 3rd ed, Kluwer Academic/Plenum Publishers. (1999).</li>
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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Hemos llevado a cabo la unión selectiva de residuos de lisina de la proteína en la superficie de los liposomas utilizando NHS-amina reacción. Este método basado en FRET es capaz de hacer monitoreo en tiempo real de la biotina-estreptavidina y vinculante proteína (BSA) que se une a la superficie del liposoma. Procedimiento similar se puede aplicar para estudiar la dinámica de unión de interacciones de proteínas diferentes con sus receptores selectivos. Hay flexibilidad en la elección de fluoróforos que proporcionarán los...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> 10,12-pentacosadiynoic ácido (PCDA) </td><td> Productos químicos EFP </td><td> 3261 </td><td> Sensible a la luz </td></tr><tr><td> N-hidroxisuccinimida (NHS) </td><td> Acros Organics </td><td> 157270250 </td><td> Sensible a la humedad </td></tr><tr><td> 1 - (3 - (dimetilamino) propil)-3-etilcarbodiimida (EDC) </td><td> Chem-Impex International </td><td> 00050 </td><td></td></tr><tr><td> 1,2-Dimyristoyl-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC) </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 850345P </td><td></td></tr><tr><td> Rodamina-etiquetados Ser bovinoum albúmina (BSA-Rh) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A4537 </td><td></td></tr><tr><td> (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(biotinil) (biotina-DOPE) </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 870282 </td><td></td></tr></tbody></table>

monitoreo en tiempo real de las interacciones ligando-receptor con transferencia de energía de resonancia fluorescente

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET es un proceso por el cual la energía es no radiativamente transferido de una molécula donadora excitada a una molécula aceptora del estado fundamental de largo alcance a través de interacciones dipolo-dipolo 1. En el presente ensayo de detección, que utilizan una propiedad interesante de PDA: azul-cambio en el espectro de absorción UV-Vis electrónico de PDA (Figura 1) después de un analito interacciona con los receptores unidos a PDA 2,3,4,7. Este cambio en el espectro de absorción PDA proporciona cambios en el solapamiento espectral (J) entre PDA (aceptor) y rodamina (donante) que conduce a cambios en la eficiencia de FRET. Por lo tanto, las interacciones entre analito (ligando) y los receptores se detectan a través de FRET entre los fluoróforos donantes y PDA. En particular, se muestra la detección de una molécula de proteína estreptavidina modelo. También demuestran la unión covalente de albúmina de suero bovino (BSA) a la superficie del liposoma con FRET mecanismo. Estas interacciones entre tél liposomas bicapa y moléculas de proteína se puede detectar en tiempo real. El método propuesto es un método general para la detección de productos químicos pequeño y grandes moléculas bioquímicas. Dado que la fluorescencia es intrínsecamente más sensible que la colorimetría, el límite de detección del ensayo puede ser en sub-rango nanomolar o inferior 8. Además, PDA puede actuar como un aceptor universal en FRET, lo que significa que varios sensores puede ser desarrollado con PDA (aceptor) funcionalizado con los donantes y los receptores de diferentes unidos en la superficie de los liposomas PDA.

Demostramos FRET entre polidiacetileno conjugado polímero (PDA) y el fluoróforo unido a la superficie de liposomas de PDA para la detección de biomoléculas. Liposomas PDA también contenía moléculas receptoras en sus superficies para las biomoléculas para ser utilizados como sondas. Ligando-receptor interacciones conducen a cambios en la eficiencia de FRET entre el fluoróforo y el PDA que es la base del mecanismo de detección.

Monitoreo en tiempo real de las interacciones ligando-receptor con transferencia de energía de resonancia fluorescente

El FRET es un proceso mediante el cual la energía se transfiere de forma no radiativa desde una molécula donadora excitada a una molécula aceptora en estado fundamental a través de un alcance largo...

El objetivo general del siguiente experimento es monitorear las interacciones entre ligandos y receptores mediante transferencia de energía de resonancia por fluorescencia. El método presentado aquí utiliza una propiedad interesante del DESPLAZAMIENTO AL AZUL de la PDA en el espectro de absorción electrónica UV-vis de la PDA. Después de que un analito interactúa con receptores unidos a la PDA, primero se sintetiza el polímero de diacetileno de PDA o la PDA, y luego se preparan liposomas de PDA.A continuación, la BSA marcada con el dominio Rod se une a la superficie del liposoma de PDA. Cuando se mide la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia, el espectro de emisión de la BSA unida al liposoma con el dominio Rod se superpone con el espectro de absorción del PDA.Esto satisface el requisito de resonancia para el mecanismo de transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET). Por lo tanto, se pueden obtener datos que indican interacciones entre ligandos y receptores. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como ELISA, es que este método es muy sencillo y económico.Dado que la fluorescencia es intrínsecamente más sensible que la ca

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Investigación

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Biología

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Este protocolo describe un ensayo basado en BRET para medir las interacciones de la quinasa CRAF con las proteínas 14-3-3 en células vivas. El protocolo describe los pasos para la preparación de las celdas, la lectura de las emisiones BRET y el análisis de datos. También se presenta un ejemplo de resultado con la identificación de los controles adecuados y la resolución de problemas para la optimización del ensayo.

Ensayo basado en transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia (BRET) para medir las interacciones de CRAF con proteínas 14-3-3 en células vivas

La electrofisiología es el estándar de oro para investigar la actividad de los canales iónicos. Sin embargo, hay muchos enfoques alternativos, incluidos los métodos ópticos. Aquí, describimos un método para monitorear la actividad de la repetición rica en leucina que contiene canales aniónicos formados por 8 canales (LRRC8) utilizando un método basado en la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) entre subunidades.

Monitorización de la actividad de repeticiones ricas en leucina que contiene 8 canales (LRRC8/VRAC) mediante transferencia de energía de resonancia de Förster de emisión sensibilizada (SE-FRET)

Este artículo ofrece una descripción detallada de cómo crear muestras para el seguimiento de una sola proteína en bicapas lipídicas soportadas por sólidos. También explica un microscopio de fluorescencia sencillo con sensibilidad a una sola molécula y una tasa de fotogramas rápida. Finalmente, describimos el procedimiento para extraer trayectorias de una sola proteína.

Seguimiento de proteínas individuales en bicapas lipídicas mediante microscopía de fluorescencia

Aprende a monitorear interacciones ligando-receptor mediante transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET) utilizando liposomas de polidiacetileno (PDA) funcionalizados. Este método permite detectar biomoléculas con alta sensibilidad.

Monitoreo en tiempo real de las interacciones ligando-receptor con transferencia de energía de resonancia fluorescente

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