El aislamiento de la microglía Primaria cultivos mixtos de células gliales del tejido neonatal cerebro de rata

Aislamiento de la microglía primaria a partir de la heterogeneidad celular del cerebro es esencial para investigar su papel en las dos condiciones fisiológicas y patológicas. Este protocolo describe un aislamiento mecánico y técnica mixta de cultivo celular que proporciona un alto rendimiento y alta pureza, viables células primarias microgliales para

El objetivo general de este procedimiento es preparar cultivos primarios de células microgliales a partir de cerebros de ratas neonatos. Esto se logra primero aislando el cerebro y extirpando las meninges. El segundo paso es homogeneizar el cerebro y colocar el cultivo glial mixto en matraces T 75.

A continuación, los matraces se incuban durante 10 a 14 días hasta que una monocapa de astrocitos ha alcanzado la confluencia. El paso final es agitar los matraces para liberar la microglía que crece sobre la monocapa de astrocitos, lo que da como resultado un cultivo purificado de microglía. En última instancia, la microglía primaria de alta pureza se puede utilizar en ensayos posteriores de cultivo y cocultivo de células individuales in vitro.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el método del gradiente de Perico, es que la disrupción mecánica nominal minimiza la disfunción o activación de la microglía, y la microglía para los experimentos se puede generar durante semanas después de la preparación inicial. Voy a demostrar este procedimiento junto con Tammy Tero, una estudiante graduada en el laboratorio del Dr. Clifton Dau. Los cultivos de microglía de alta pureza obtenidos durante este protocolo se pueden utilizar en experimentos in vitro para estudiar la función de la microglía en condiciones fisiológicas normales, así como en condiciones de enfermedades patológicas.

La microglía, la capacidad de respuesta al daño tisular, así como los estímulos inflamatorios, tienen una relevancia directa para las lesiones neurológicas y las enfermedades neurodegenerativas. Por lo general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades porque no están familiarizadas con la forma de eliminar las meninges del tejido cerebral de manera oportuna para reducir la contaminación de fibroblastos en los cultivos primarios de microglía. Además, se debe tener cuidado de no dañar la monocapa de astrocitos durante la agitación de los matraces y la manipulación de los cultivos de microglía.

Para prepararse para el procedimiento, Chi Livi es de L 15 medios a cuatro grados Celsius, listo para placas de Petri de 60 por 15 milímetros que contienen L 15 medios y se coloca en hielo. Caliente el medio de cultivo a 37 grados centígrados y asegúrese de que todas las herramientas quirúrgicas hayan sido esterilizadas. Después de decapitar a un cachorro de rata P uno a P cinco con tijeras afiladas, deje caer la cabeza en etanol al 70%.

Después de haber recogido las cabezas de cinco cachorros de rata, transfiera las cabezas a una solución salina. Extraiga todo el cerebro de cada cabeza haciendo incisiones cuidadosamente en ambos lados del cráneo por encima de las orejas, y extrayendo el cerebro hacia afuera y dentro de una de las emisiones de Petri que contienen medio L 15 en hielo. Una vez que los primeros cinco cerebros se han transferido a L 15 en hielo, los siguientes cinco cachorros se pueden procesar de la misma manera cuando se han recolectado todos los cerebros.

Retire las meninges agarrando suavemente un borde de la lámina meníngea con pinzas y despegándola con cuidado de la corteza subyacente. Es fundamental extirpar a fondo las meninges y hacerlo lo más rápido posible. Después de quitar las meninges, transfiera cada uno de los cerebros a una placa de Petri fresca de L 15 medium en hielo.

Utilice una pipeta de 10 mililitros para aspirar el tejido cerebral y el medio de la placa a un tubo cónico estéril de 50 mililitros. A continuación, centrifugar a 2.500 RCF durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Después del aspirado por centrifugación.

A continuación, el supinato utiliza una pipeta estéril de 10 mililitros para Reese. Suspenda el pellet en cuatro o cinco mililitros de medio L 15 fresco, pipetee el medio y el pañuelo hacia arriba y hacia abajo 10 veces. A continuación, coloque un colador de células de poro de 100 micras en un tubo cónico nuevo de 50 mililitros.

Utilice una pipeta estéril de cinco mililitros para pipetear la suspensión de tejido hacia arriba y hacia abajo y, a continuación, con la pipeta enjuagada al filtro de células, dispense el material a través del filtro de células en el tubo cónico. Enjuague el colador con cuatro a cinco mililitros de medios L 15 recién enfriados. A continuación, centrifuga tus 2.500 RCF durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.

Para cada cerebro de cachorro de rata procesado, prepare un matraz estéril T 75 añadiendo 12 mililitros de medios de cultivo de antes de la guerra en cada matraz. A continuación, después de aspirar el suministro de las células granuladas, agregue de cinco a seis mililitros de medio de cultivo al gránulo de celdas, pipetee hacia arriba y hacia abajo 10 veces con una pipeta de 10 mililitros. A continuación, transfiera un volumen igual de suspensión de celdas a cada matraz T 75.

Incubar los matraces en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados durante una a tres semanas, permitiendo que las células permanezcan inalteradas durante los primeros cinco días después de la siembra inicial. Después de cinco días, reemplace el medio acondicionado en cada matraz con 12 mililitros de medio fresco para lograr la confluencia. Esto debe hacerse con mucho cuidado sin tocar el fondo del matraz donde se unen las células.

Una vez que los cultivos gliales mezclados estén completamente confluidos, retire el matraz de la incubadora. Cubra las tapas de los matraces con param para evitar el intercambio de gases con el aire ambiental y coloque los matraces en una incubadora agitadora configurada a 100 RPS y 37 grados Celsius durante una hora después de que haya transcurrido la hora, use una pipeta de 10 mililitros para recoger los medios de los matraces sin interrumpir la capa de astrocitos y dispense en tubos cónicos de 50 mililitros. Agregue medios frescos a los matraces y devuélvalos a la incubadora.

Después de centrifugar los tubos a 2.500 RCF durante cinco minutos a cuatro grados centígrados, aspire el supinato y vuelva a suspender las células en un mililitro de medio de recubrimiento de microglía. A continuación, cuente las células utilizando un citómetro humano y procedimientos estándar. Una vez que se ha determinado el número de células, agregue un volumen apropiado de medio de siembra microglial para obtener una celda.

La concentración de dos por 10 a las cinco células por placa de mililitro es apropiada para el experimento y el retorno a la incubadora. Para permitir que la microglía se adhiera durante la noche. Las células han sido inmunoteñidas con un anticuerpo específico para IBA uno, un marcador microglial, que aparece en rojo.

La contaminación del cultivo con células neuronales es mínima, como lo demuestra esta imagen de microscopio de inmunotinción utilizando un anticuerpo para el nuevo marcador neuronal NA, que aparece en rojo. El portaobjetos ha sido teñido con DPI para teñir todos los núcleos celulares de azul. Esta imagen muestra la inmunotinción con GFAP y marcador de astrocitos.

Los astrocitos aparecen de color verde. Aquí vemos una imagen del cultivo microglial inmunoteñido con un anticuerpo específico para CC uno, un marcador de oligodendrocitos. Los oligodendrocitos aparecen de color rojo.

Este histograma muestra los resultados de la cuantificación de cada tipo de célula. Se puede ver que los cultivos microgliales en placa tienen una pureza superior al 90%. Esta imagen de microscopio de fluorescencia muestra un cultivo microglial que ha sido tinción inmunológica para IBA uno.

Las áreas rojas son perlas de látex marcadas con fluorescencia. El cultivo microglial que se muestra aquí ha sido tratado con un nanogramo por mililitro de lipo polisacárido, y se puede ver que las células microgliales tienen fagocitosis en las perlas de látex marcadas con fluorescencia. Aquí, los resultados del ensayo de fagocitosis se muestran en un histograma.

Se observa un aumento de la fagocitosis después del tratamiento con LPS. Esta figura muestra que la producción de óxido nítrico también aumenta en los cultivos microgliales después de la adición de LPS. Por último, los cultivos de neuronas de microglía, tanto directos como con insertos transpocillos, son susceptibles a un aumento de la muerte celular después de la incubación con LPS, medido por la liberación de lactato deshidrogenasa Una vez dominada la primera parte de esta técnica, hasta la siembra en T 75, los matraces se pueden hacer en una hora y media, y el procedimiento completo se puede hacer en dos semanas.

Otra consideración durante la optimización de este protocolo es determinar la duración del tiempo. Los cultivos gliales mixtos deben mantenerse antes de aislar la microglía primaria para la siembra Después del establecimiento de cultivos de alta pureza. Con este procedimiento, la función de la microglía se puede evaluar in vitro, la medición de la producción de óxido nítrico, la liberación de citocinas y quimiocinas, así como la actividad fásica, todo ello puede determinarse y medirse mediante ensayos de laboratorio de rutina.

Así, con el desarrollo de este procedimiento, los investigadores en el campo de la neurociencia tienen la capacidad de explorar la actividad de la microglía en un entorno celular homogéneo e investigar sus funciones en diversas condiciones neurológicas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar cultivos primarios de células microgliales a partir de cerebros de ratas neonatales. Primero se aísla el cerebro y se extirpan las meninges, y luego se homogeneiza el cerebro y se coloca en matraces, los matraces se incuban durante 10 a 14 días hasta que una monocapa de astrocitos alcanza la confluencia.

El paso final es agitar los matraces para liberar la microglía que crece sobre la monocapa de astrocitos, lo que da como resultado un cultivo purificado de microglía.