Cultivo de Células progenitoras neurales en un hidrogel de péptidos 3-dimensional de auto-montaje

El objetivo general de este procedimiento es acelerar el análisis de la diferenciación neuronal de células progenitoras neurales humanas cultivadas en un entorno tridimensional. Esto se logra cultivando primero las células en la matriz pura de hidrogel a base de péptidos autoensamblables. A continuación, las células se liberan de los andamios tridimensionales.

En el tercer paso, se realiza la tinción inmunofitoquímica de las células en el paso final. Las celdas se enumeran mediante análisis de citometría de flujo. En última instancia, la tasa de diferenciación neuronal o la tasa de apoptosis se pueden determinar a través del análisis de citometría de flujo para marcadores neuronales o apoptóticos, respectivamente.

Con esta técnica, la cuantificación de la diferenciación neuronal es mucho más rápida y los datos de Optane se encuentran en una base más amplia y técnicas de microfotografía Para la incrustación de células en la matriz pura, primero coloque una cubierta de vidrio esterilizada de 13 milímetros de diámetro en cada uno de los dos pocillos de una placa de cultivo celular de cuatro pocillos. A continuación, guarde la placa en un banco limpio para su uso posterior. A continuación, separa las células progenitoras neurales humanas o NPC H añadiendo 2,5 mililitros de tripsina recién preparada.

Benzon una solución a la placa de cultivo e incubación de la suspensión celular a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Después de cinco minutos, detenga la reacción con la solución de benzón, inhibidor de tripsina. Luego, después de hacer girar las celdas separadas a 3000 veces G a temperatura ambiente durante cinco minutos, suspenda el pellet resultante con cinco mililitros de una solución de sacarosa al 10% y luego lave la suspensión de la celda en las mismas condiciones de centrífuga.

Después de desechar el snat Resus, suspenda el pellet en la solución de sacarosa hasta una concentración celular final de una vez 10 a la sexta celda por mililitro. Ahora, tan pronto como sea posible, mezcle 60 microlitros de suspensión celular con la solución uno, transfiera 120 microlitros de esta suspensión al tubo cónico con la solución dos y mezcle cuidadosamente y luego coloque inmediatamente 100 microlitros de la mezcla en cada uno de los cubreobjetos de la placa de cuatro pocillos. Finalmente, agregue lentamente 200 microlitros de medio de cultivo celular a cada pocillo.

Después de dos o tres minutos, agregue otros 200 microlitros de medios de cultivo celular a los pocillos, iniciando el autoensamblaje de la matriz. Incube las células a 37 grados centígrados durante una hora en la zona calentada de su banco limpio. Absteniéndose de mover la placa de cultivo celular tanto como sea posible después de que las matrices se hayan ensamblado, use una pipeta de 1000 microlitros para eliminar la mayoría de los medios, pero no todos, para evitar que las matrices se sequen.

A continuación, lavar las matrices con 500 microlitros de medios frescos durante 10 minutos. Por último, retire los medios de lavado. Agregue 500 microlitros más de medio y coloque la placa de cultivo en una incubadora.

Si es posible. Guarde las matrices en su propia incubadora para evitar sacudidas accidentales de las estructuras el primer día del experimento de tinción. Retire los medios de las matrices con una pipeta de 1000 microlitros y, a continuación, lave los andamios con PBS una vez durante cinco minutos.

A continuación, retire el PBS y añada 400 microlitros de paraldehído a cada pocillo para fijar las matrices e incubarlas durante 30 minutos a temperatura ambiente. Una vez fijados los andamios, lávelos con 500 microlitros de PBS durante cinco minutos. Luego incube las estructuras y el tampón de bloqueo durante seis a nueve horas, cambiando el tampón una vez cada dos o tres horas con una incubación final durante la noche en un tampón de bloqueo fresco a cuatro grados centígrados al día siguiente, retire el tampón de bloqueo.

Agregue la solución de anticuerpos a los pocillos y vuelva a incubar las matrices a cuatro grados centígrados durante la noche. Ahora, retire la solución de anticuerpos primarios y lave los andamios en 500 microlitros de PBS durante ocho horas, cambiando el PBS cada dos horas y luego durante la noche a cuatro grados Celsius con PBS fresco. Después del lavado nocturno, retire el PBS e incube los andamios con la solución de anticuerpos secundarios durante cuatro horas a temperatura ambiente en la oscuridad.

A continuación, lavar las muestras con PBS de cuatro a seis veces durante una hora cada vez, y luego incubar las estructuras con PBS fresco a cuatro grados centígrados en la oscuridad durante la noche. Ahora agregue 50 microlitros de MOE all dab co en los portaobjetos del microscopio para prepararlos para el montaje de las matrices. A continuación, monte con cuidado un cubreobjetos en cada corredera.

Por último, se utiliza un microscopio fluorescente para obtener micrografías individuales y Zacks similares a las NPCs H que se tiñen de verde para la expresión del marcador neuronal beta tres tubulina que se muestra aquí. Después de lavar los andamios con 500 microlitros de HBSS durante un minuto, use una pipeta de 1000 microlitros para transferir los andamios a un tubo cónico de 15 mililitros. A continuación, vuelva a suspender la solución celular varias veces con una pipeta de 1000 microlitros para interrumpir mecánicamente las matrices y, posteriormente, centrifugar la solución de andamio a 3000 veces G a temperatura ambiente durante cinco minutos, retire el sobrenadante con una pipeta y luego vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de solución de tripsina bencina pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces.

A continuación, incubar las células a 37 grados centígrados. Detenga la reacción después de cinco minutos con un mililitro de inhibidor de tripsina. La solución de nase de Benza se pipetea hacia arriba y hacia abajo varias veces después de girar la suspensión celular en las mismas condiciones de centrífuga.

Elimine cualquier residuo de la matriz lavando las celdas con dos mililitros de tampón HBSS dos veces. Finalmente, elimine los agregados pasando la solución de suspensión celular a través de una centrífuga de filtro celular de 70 micras en las mismas condiciones y recoja las células en un medio de cultivo celular. Comience fijando las células disgregadas en paraldehído paraformado al 1% durante 15 minutos a temperatura ambiente en un agitador.

Luego, después de girar las celdas reus, suspenda el pellet en el tampón de lavado. Ahora, después de centrifugar las células durante 10 minutos a 350 veces G a cuatro grados centígrados, suspende el pellet resultante en 25 microlitros de la solución de anticuerpos. Incubar la suspensión celular durante dos horas a temperatura ambiente en un agitador.

A continuación, añada 300 microlitros de tampón pon directamente a las muestras y, a continuación, lave las suspensiones celulares dos veces en las mismas condiciones de centrífuga. Después del segundo lavado, agregue 25 microlitros del anticuerpo secundario y luego incube las células durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Luego, después de lavar las celdas dos veces más con tampón de saponina, vuelva a suspender el pellet y 500 microlitros de tampón de lavado para el análisis de citometría de flujo.

En esta figura se muestran las NPC H encapsuladas y en matriz pura, las células crecen en esferas, estructuras densamente empaquetadas donde el diámetro de las esferas puede ser de hasta varios cientos de micras entre las esferas. Los paquetes de procesos construidos por las células se pueden observar como lo indican las flechas blancas. Aunque las células individuales apenas se pueden reconocer, las células encapsuladas en matriz pura suplementada con laminina crecen en estructuras menos densas y se distribuyen de manera más homogénea como se ve en esta figura, las células individuales incluso se pueden reconocer en áreas menos densas como lo indican las flechas negras Aquí, H NPCs diferenciadas durante cuatro días en laminado suplementado pur Matrixx teñido verde para la expresión del marcador neuronal.

Se muestra que la beta tres tubulina evalúa el porcentaje de células positivas. El número total de células se puede determinar enumerando los núcleos celulares teñidos aquí en azul con dappy. Esta microfotografía representa la proyección completa de una pila Z de imágenes tomadas con un microscopio fluorescente.

Las células liberadas de la matriz se pueden volver a asentar, por ejemplo, en cubreobjetos, como se muestra en esta figura para estudios funcionales posteriores. Esta microfotografía muestra células cultivadas en 3D después de ser sometidas al procedimiento de liberación mencionado anteriormente y cultivadas durante tres días. La tinción de beta tres tubulina en rojo revela una morfología comparable a las células alojadas en el andamio 3D utilizando células no teñidas como control negativo.

El AG representado aquí como el marco negro se estableció para el análisis posterior de las células beta tres tubulina positivas en este diagrama de puntos, las células positivas aparecen dentro del marco negro en la parte derecha del eje x y la población intermedia en el marco punteado y muy probablemente representando restos de células también se pueden observar. En esta figura final se muestra una comparación del recuento manual de células y la enumeración por citometría de flujo. Se puede detectar una proporción mucho mayor de células positivas mediante el análisis de citometría de flujo, como lo indican los cuadrados negros abiertos, y luego se pueden enumerar típicamente mediante el recuento manual, como lo indican los triángulos negros sólidos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar métricas deficientes para el cultivo de MPC de borde en andamios 3D y cómo liberar las celdas del andamio para analizadores métricos de citos de flujo.