Cultivo de Células progenitoras neurales en un hidrogel de péptidos 3-dimensional de auto-montaje

El objetivo general de este procedimiento es acelerar el análisis de la diferenciación neuronal de células progenitoras neurales humanas cultivadas en un entorno tridimensional. Esto se logra primero cultivando las células en una matriz pura de hidrogel basado en péptidos autorreorganizables. A continuación, las células se liberan de los andamios tridimensionales.

En el tercer paso, se realiza la tinción fitoquímica inmunológica de las células en la etapa final. Las células se cuentan mediante análisis citométrico de flujo. En última instancia, la tasa de diferenciación neuronal o la tasa de apoptosis puede determinarse mediante el análisis citométrico de flujo para marcadores neuronales o apoptóticos, respectivamente.

Con esta técnica, la cuantificación de la diferenciación neural es mucho más rápida y los datos de Optane se amplían en una base más amplia y en técnicas de microfotografía. Para la inclusión de células en la matriz de gelatina, coloque primero una laminilla de vidrio esterilizada de 13 milímetros de diámetro en cada uno de dos pocillos de una placa de cultivo celular de cuatro pocillos. Luego, guarde la placa sobre una superficie limpia para su uso posterior. A continuación, desprenda las células progenitoras neurales humanas o H NPCs añadiendo 2,5 mililitros de tripsina recién preparada.

Añada benzon a la placa de cultivo e incube la suspensión celular a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Después de cinco minutos, detenga la reacción con una solución de inhibidor de tripsina benzon. Luego, tras centrifugar las células desprendidas a 3000 × g a temperatura ambiente durante cinco minutos, resuspenda el pellet resultante con cinco mililitros de una solución de sacarosa al 10%, y lave a continuación la suspensión celular en las mismas condiciones de centrifugación.

Después de desechar el sobrenadante de resuspensión, suspenda el sedimento en la solución de sacarosa hasta alcanzar una concentración final de células de un vez 10 a la sexta células por mililitro. Ahora, lo más rápidamente posible, mezcle 60 microlitros de la suspensión celular con la solución uno, transfiera 120 microlitros de esta suspensión al tubo cónico con la solución dos y mezcle cuidadosamente; a continuación, aplique inmediatamente 100 microlitros de la mezcla sobre cada uno de los cubreobjetos en la placa de cuatro pocillos. Finalmente, agregue lentamente 200 microlitros de medio de cultivo celular a cada pocillo.

Después de dos o tres minutos, agregue otros 200 microlitros de medio de cultivo celular a los pocillos para iniciar la autoensamblaje de la matriz. Incube las células a 37 grados Celsius durante una hora en la zona calefaccionada de su banco de trabajo limpio. Sin mover la placa de cultivo celular más de lo necesario después de que las matrices se hayan ensamblado, utilice una pipeta de 1000 microlitros para eliminar la mayor parte, pero no toda, del medio, con el fin de evitar que las matrices se sequen.

Luego, lave las matrices con 500 microlitros de medio fresco durante 10 minutos. Finalmente, retire el medio de lavado. Añada 500 microlitros adicionales de medio y coloque la placa de cultivo en un incubador.

Si es posible, almacene las matrices en su propio incubador para evitar agitaciones accidentales de las estructuras durante el primer día del experimento de tinción. Retire el medio de las matrices con una pipeta de 1000 microlitros y luego lave los andamios con PBS una vez durante cinco minutos.

Luego, retire el PBS y agregue 400 microlitros de paraformaldehído a cada pocillo para fijar las matrices e incúbelas durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de fijar los andamios, lávelos con 500 microlitros de PBS durante cinco minutos. A continuación, incube las estructuras con el tampón de bloqueo durante seis a nueve horas, cambiando el tampón cada dos a tres horas, y realice una incubación final durante la noche en tampón de bloqueo fresco a cuatro grados Celsius. Al día siguiente, retire el tampón de bloqueo.

Añada la solución de anticuerpos a los pocillos e incube nuevamente las matrices durante la noche a cuatro grados Celsius. Ahora, retire la solución de anticuerpo primario y lave los andamios con 500 microlitros de PBS durante ocho horas, cambiando el PBS cada dos horas y luego durante la noche a cuatro grados Celsius con PBS fresco. Después del lavado nocturno, retire el PBS e incube los andamios con la solución de anticuerpo secundario durante cuatro horas a temperatura ambiente en la oscuridad.

Luego, lave las muestras con PBS de cuatro a seis veces durante una hora cada vez, e incube las estructuras con PBS fresco a cuatro grados Celsius en la oscuridad durante la noche. Ahora agregue 50 microlitros de MOE all dab co sobre los portaobjetos para prepararlos para el montaje de las matrices. Luego, monte cuidadosamente una laminilla sobre cada portaobjetos.

Finalmente, utilice un microscopio fluorescente para obtener microfotografías individuales y Zacks similares a la tinción de H NPCs en verde para la expresión del marcador neuronal beta tres tubulina mostrada aquí. Después de lavar los andamios con 500 microlitros de HBSS durante un minuto, use una pipeta de 1000 microlitros para transferir los andamios a un tubo cónico de 15 mililitros. A continuación, resuspenda varias veces la solución celular con una pipeta de 1000 microlitros para romper mecánicamente las matrices y posteriormente centrifugue la solución de andamios a 3000 veces G a temperatura ambiente durante cinco minutos, retire el sobrenadante con una pipeta y luego resuspenda el sedimento en 500 microlitros de solución de tripsina benzina pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces.

Luego incubar las células a 37 grados Celsius. Detener la reacción después de cinco minutos con un mililitro de inhibidor de tripsina. Pipetear la solución de benza nase hacia arriba y hacia abajo varias veces tras centrifugar la suspensión celular bajo las mismas condiciones de centrifugación.

Elimine cualquier resto de matriz lavando las células dos veces con dos mililitros de tampón HBSS. Finalmente, elimine los agregados pasando la solución de suspensión celular a través de un centrífugo con filtro celular de 70 micrones bajo las mismas condiciones y recolecte las células en medio de cultivo celular. Comience fijando las células desagregadas en paraformaldehído al 1 % durante 15 minutos a temperatura ambiente en un agitador.

Luego, después de centrifugar las células, reuspenda el precipitado en tampón de lavado. Ahora, tras centrifugar las células durante 10 minutos a 350 × g a cuatro grados Celsius, resuspenda el precipitado resultante en 25 microlitros de la solución de anticuerpo. Incube la suspensión celular durante dos horas a temperatura ambiente en un agitador.

Luego, agregue 300 microlitros de tampón pon directamente a las muestras y, a continuación, lave las suspensiones celulares dos veces bajo las mismas condiciones de centrifugación. Después del segundo lavado, agregue 25 microlitros del anticuerpo secundario y luego incube las células durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad. A continuación, después de lavar las células dos veces más con tampón saponina, re suspenda el precipitado en 500 microlitros de tampón de lavado para el análisis citométrico de flujo.

En esta figura se muestran H NPCs encapsuladas y matriz pura, donde las células crecen formando esferas, estructuras densamente empaquetadas cuyo diámetro puede alcanzar varios cientos de micrómetros entre las esferas. Se pueden observar haces de prolongaciones formados por las células, como indican las flechas blancas. Aunque apenas pueden reconocerse células individuales, las células encapsuladas en matriz pura suplementada con laminina crecen en estructuras menos densas y están distribuidas de manera más homogénea, como se observa en esta figura; incluso pueden reconocerse células individuales en áreas menos densas, como indican las flechas negras. Aquí, H NPCs diferenciadas durante cuatro días en matriz pura suplementada con laminina, tinción verde para la expresión del marcador neuronal.

Se muestra la beta tres tubulina para evaluar el porcentaje de células positivas. El número total de células puede determinarse mediante el recuento de núcleos celulares teñidos aquí en azul con DAPI. Esta microfotografía representa la proyección completa de un apilado Z de imágenes tomadas con un microscopio fluorescente.

Las células liberadas de la matriz pueden volver a sembrarse, por ejemplo, sobre cubreobjetos como se muestra en esta figura para estudios funcionales posteriores. Esta microfotografía muestra células cultivadas en 3D tras haber sido sometidas al procedimiento de liberación mencionado previamente y cultivadas durante tres días. La tinción para la tubulina beta tres en rojo revela una morfología comparable a la de las células alojadas en el andamiaje 3D, utilizando células sin tinción como control negativo.

El AG representado aquí como el marco negro se estableció para el análisis subsiguiente de células positivas para beta tres tubulina en este diagrama de dispersión, donde las células positivas aparecen dentro del marco negro en la parte derecha del eje x, y una población intermedia en el marco punteado, que muy probablemente representa restos celulares, también puede observarse. En esta figura final se muestra una comparación entre el recuento celular manual y la enumeración mediante citometría de flujo. Se puede detectar una proporción mucho mayor de células positivas mediante análisis por citometría de flujo, como indican los cuadrados negros abiertos, de lo que típicamente puede enumerarse mediante recuento manual, como indican los triángulos negros sólidos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar métricas deficientes para el cultivo de MPC de borde en andamios 3D y de cómo liberar las células del andamio para analizadores citométricos de flujo.