Microscopía Multiphoton de cerebro de ratón Borrado Expresando YFP

La microscopía de múltiples fotones de tejidos fijados normalmente se limita a profundidades de penetración poco profundas de apenas unas pocas cientos de micras. Recientemente demostramos el primer uso de la microscopía de múltiples fotones a profundidades de varios milímetros en órganos fijados de ratón mediante la clarificación óptica con una solución de alcohol bencílico y benzoato de bencilo. En nuestra demostración inicial, la técnica permitió visualizar la fluorescencia intrínseca del tejido.

Sin embargo, existe un interés creciente en utilizar métodos de aclarado óptico con tejidos que expresan proteínas fluorescentes como la GFP. Aquí presentamos un protocolo para la microscopía de múltiples fotones de tejido cerebral aclarado con la misma solución de alcohol bencílico que preserva la fluorescencia de la proteína verde fluorescente expresada por el muslo. Un promotor en el cerebro de ratón permite la obtención de imágenes de órganos enteros de ratón con alta resolución mediante microscopía de múltiples fotones, lo cual es posible al aclarar ópticamente el órgano antes de la obtención de imágenes sin aclarar. Multiphoton.

La obtención de imágenes del cerebro está limitada a 300 micrones por debajo de la superficie del tejido debido a los efectos de dispersión de la luz provocados por las diferencias en los índices de refracción del agua y las proteínas que componen el tejido cerebral. Para superar esta limitación, el órgano se deshidrata y el agua se reemplaza con un líquido que tiene un índice de refracción similar al de las proteínas que constituyen el tejido. Este proceso de clarificación óptica ayuda a reducir considerablemente la dispersión de la luz, lo que permite una mejor visualización a mayor profundidad bajo la superficie del tejido.

Las imágenes de Batta et al demuestran cómo esta técnica puede aplicarse para observar la histología de diferentes órganos de ratón utilizando fluorescencia intrínseca y generación de segundo armónico. Esta primera imagen corresponde al testículo de ratón, tomada a 1,4 milímetros por debajo de la superficie del tejido. La propiedad de alta resolución de la microscopía de múltiples fotones nos permite acercarnos y obtener una vista clara de las células espermáticas individuales que se forman en los túbulos seminíferos.

Como se observa más a la derecha, mostramos una imagen del pulmón de ratón, tomada también a 1,4 milímetros por debajo de la superficie del tejido. Esta imagen demuestra una adquisición multiphotónica de dos canales en la que los componentes de elastina se etiquetan en rojo mientras que el colágeno se etiqueta en verde, y al hacer zoom, los alvéolos individuales son fácilmente distinguibles. Finalmente, mostramos imágenes de alta resolución de las regiones internas del cerebro de ratón tomadas a 850 micrómetros por debajo de la superficie del tejido. Al hacer zoom en el neocórtex y el hipocampo del cerebro, se pueden observar claramente astrocitos individuales y cuerpos celulares neuronales.

Sin embargo, cuando se utilizan órganos transparentados ópticamente que pueden contener proteínas fluorescentes como la YFP, el protocolo de transparentación óptica de badra no conserva la señal fluorescente de estas proteínas. El protocolo presentado aquí es una nueva forma de realizar la transparentación óptica completa y el análisis por imagen de órganos enteros de ratón, conservando al mismo tiempo la señal fluorescente de la YFP y las neuronas, deshidratando el cerebro mediante una serie gradiente de etanol y realizando la transparentación con una solución uno a dos de alcohol bencílico y benzoato de bencilo, conocida comúnmente como BAB, que se ha encontrado que reduce el daño a las proteínas fluorescentes y preserva su señal fluorescente. Para el análisis por imagen de múltiples fotones, primero se pesa a los ratones YFP y luego se anestesian mediante inyección intraperitoneal de xilacina y cetamina.

Debe confirmarse un nivel quirúrgico de anestesia antes de proceder a la cirugía. El animal debe revisarse cada cinco minutos para verificar si reacciona ante un apretón firme en el dedo del pie o en la cola. Si el animal reacciona, se requiere una dosis suplementaria de ketamina y xilacina.

Una vez anestesiados, los ratones se mantienen sujetando cada miembro a una camilla quirúrgica utilizando cinta de laboratorio, de modo que el ratón quede en posición supina, exponiendo su pecho para la cirugía. Para comenzar, se realiza una incisión debajo del proceso xifoides con el fin de hacer un corte a lo largo de la base de la caja torácica utilizando tijeras y pinzas para retirar la piel mientras se realiza el corte; luego, se hacen dos cortes a ambos lados del esternón del ratón para crear una aleta de tejido que se mantiene alejada de la cavidad torácica utilizando un hemostato, dejando así expuesto el corazón. A continuación, se inserta una aguja de calibre 23 en el ventrículo izquierdo del corazón, y se realiza una pequeña incisión en la pared muscular de la aurícula derecha para permitir que salga la sangre. Inmediatamente después de cortar la aurícula derecha, se inicia una perfusión con solución salina tamponada con fosfato a cuatro grados Celsius hasta que ya no salga más sangre por la aurícula derecha.

Durante la perfusión, se utiliza una bomba peristáltica ajustada a una potencia de bombeo que expulsa el líquido entre 3,8 y 5 cm de distancia respecto a la punta de la aguja. Una vez que se ha drenado toda la sangre, el medio de perfusión se cambia a una solución de paraformaldehído al 4 % a cuatro grados Celsius hasta que el cuerpo del ratón se vuelva notablemente rígido y tenso. Tras la perfusión, se retira al ratón de la camilla quirúrgica y se le decapita para comenzar la extirpación del cerebro utilizando fórceps y tijeras de iris.

El cráneo se retira en pequeñas secciones, comenzando desde la parte posterior del cráneo y avanzando hacia adelante. Se realizan pequeños cortes cada dos a cuatro milímetros con las tijeras a través del cráneo, mientras que la pinza se utiliza para extraer cuidadosamente el hueso del cerebro en pequeñas secciones; este procedimiento se lleva a cabo hasta que se expone toda la superficie superior del cerebro. Luego, el cerebro se extrae del cráneo utilizando una espátula quirúrgica y se coloca en un vial de vidrio con paraformaldehído al 4 % para fijarlo durante seis horas.

Aunque en esta demostración nos centramos principalmente en la obtención de imágenes del cerebro de ratón que expresa YFP, también realizaremos la clarificación óptica de un ratón, una pata trasera y un corte de intestino delgado para mostrar mejor las capacidades de clarificación de este procedimiento. Tras la fijación post, el cerebro y otros tejidos se lavan dos veces en PBS. Las muestras de tejido se deshidratan luego a temperatura ambiente mediante una serie de incubaciones en etanol con concentraciones del 50 %, 70 %, 90 % y 100 % de etanol.

Cada incubación dura dos horas y luego una segunda. Se realiza una incubación con etanol al 100 % durante 12 horas para extraer eficazmente el agua del tejido fijado. Después de la deshidratación, se descarta la última solución de etanol al 100 % y las muestras de tejido se sumergen en una solución uno a uno de etanol a BAB durante dos horas antes de ser inmersas en la solución de clarificación al 100 % BAB.

Una vez en BAB, las muestras del cerebro y otros tejidos se volverán notablemente transparentes dentro de las cuatro a cinco horas. Aquí mostramos un video con lapso de tiempo de las primeras seis horas del proceso de aclarado óptico. La marca de salto indica el momento en que la solución uno a uno de etanol a BAB se sustituyó por una solución al 100 % de BAB.

Al final de seis horas, todos los órganos muestran signos de transparencia; por ejemplo, el hueso de la pata trasera del ratón es ahora claramente visible para obtener los mejores resultados de aclarado. El cerebro debe dejarse aclarar durante seis días a temperatura ambiente, protegido de la luz intensa. Una vez que el cerebro esté aclarado y listo para la obtención de imágenes, se fija al fondo de la placa de Petri utilizando acrílico Sano o pegamento instantáneo.

Después de que el pegamento se seque, el cerebro se sumerge en BAB y la placa de Petri se coloca bajo el objetivo para la adquisición de imágenes. Para la adquisición de imágenes, utilizamos un microscopio de multiphotones que incorpora un láser de titanio-safiro MI tie, ajustable entre una longitud de onda de excitación de 710 a 990 nanómetros. La longitud de onda de excitación que utilizamos para generar señales de YFP es de 886 nanómetros.

La señal fluorescente reflejada se captura entonces mediante un objetivo NIK icon cinco x que permite la obtención de imágenes con un amplio campo de visión. La señal fluorescente reflejada se filtra utilizando un filtro de banda pasante 5 35 50 y se recoge mediante un multiplicador de alta eficiencia cuántica. Las imágenes OMA Matsu Multiplier dos se procesan utilizando software de imagen de escaneo a una resolución de 2048 por 2048 píxeles y una velocidad de escaneo de dos milisegundos por línea para generar imágenes de alta resolución de YFP.

Una vez finalizada la adquisición de imágenes, el cerebro se retira del platillo P y se almacena en BAB, protegido de la luz, para futuras adquisiciones de imágenes. Las imágenes y videos representativos mostrados aquí demuestran la capacidad de adquisición de imágenes multiphotón de alta resolución posibilitada por la transparencia óptica. La adquisición de imágenes de todo el cerebro permite que las neuronas marcadas con YFP en las diferentes capas del hipocampo y la neocorteza sean claramente visibles hasta una profundidad de dos milímetros por debajo de la superficie del tejido.

Aquí mostramos un video de una pila de imágenes de 1,2 milímetros de una preparación completa de la boca, tomada de 0,8 a dos milímetros dentro del cerebro para revelar las diferentes capas anatómicas del hipocampo. A continuación se presenta una imagen representativa de una sección coronal de 1,94 milímetros denominada Bergman, tomada de la pila de imágenes de dos milímetros de profundidad, en la que se han etiquetado las diferentes capas del hipocampo. Al acercarse al neocórtex, las axones individuales y los cuerpos celulares de las neuronas piramidales de la capa cinco del neocórtex son claramente distinguibles hasta 1,02 milímetros por debajo de la superficie del tejido.

Aquí mostramos una serie de imágenes de neuronas de la capa cinco tomadas entre 700 y 1020 micrones por debajo de la superficie del tejido. A continuación se presenta una imagen representativa de esa serie tomada a 774 micrones de profundidad en el cerebro. Utilizando esta misma serie de imágenes, se realizó una reconstrucción tridimensional de la región neuronal mediante el software Image J.

La capacidad de alta resolución de la microscopía multibot también nos permite presentar imágenes de neuronas individuales completas. Aquí mostramos una reconstrucción de una neurona de la capa cinco de la neocorteza en la que los procesos dendríticos son claramente visibles. Esto concluye nuestra presentación del método de aclarado óptico, cerebro completo de ratón que expresa YFP.

Realizar esta técnica es relativamente sencillo y, como hemos mostrado, puede utilizarse para observar e imaginar muchas regiones y estructuras diferentes del esguince del ratón. Gracias por ver este video y buena suerte.