Microscopía Multiphoton de cerebro de ratón Borrado Expresando YFP

Microscopía multifotónica de órganos enteros de ratón es posible por ópticamente despejar el órgano antes de formación de imágenes, pero no todos los protocolos de preservar la señal fluorescente de proteínas fluorescentes. El uso de un método de compensación óptica con base de etanol y alcohol bencílico deshidratación: bencil benzoato de compensación, se muestran imágenes de alta resolución multifotónica de cerebro de ratón que expresa toda YFP.

La microscopía multifotónica de tejido fijo normalmente se limita a profundidades de penetración poco profundas de solo unos pocos cientos de micras. Recientemente demostramos el primer uso de la microscopía multifotónica a una profundidad de varios milímetros en órganos fijos de ratón utilizando un aclaramiento óptico con la solución de benzoalcohol y benzoato de benzoilo. Nuestra demostración inicial, la técnica, obtuvo imágenes de fluorescencia intrínseca del tejido.

Sin embargo, existe un interés creciente en el uso de métodos de aclaramiento óptico con tejidos que expresan proteínas fluorescentes como GFP. Aquí presentamos un protocolo para la microscopía multifotónica de tejido cerebral aclarado con la misma solución de benzoalcohol que conserva la fluorescencia de la proteína fluorescente amarilla expresada por el muslo. Un promotor en el cerebro del ratón La obtención de imágenes de órganos completos de ratón de alta resolución mediante microscopía multifotónica es posible gracias a la eliminación óptica del órgano antes de la obtención de imágenes sin aclaración. Multifotón.

Las imágenes del cerebro se limitan a 300 micras por debajo de la superficie del tejido debido a los efectos de dispersión de las luces creadas por las diferencias en los índices de refracción del agua y las proteínas que componen el tejido cerebral. Para superar esta limitación, el órgano se deshidrata y el agua se sustituye por un líquido que tiene un índice de refracción similar al de las proteínas que componen el tejido. Este proceso de aclaramiento óptico ayuda a reducir en gran medida la dispersión de la luz para ofrecer mejores imágenes más allá de la superficie del tejido.

Las imágenes de Batta et al demuestran cómo se puede aplicar esta técnica para ver la histología de diferentes órganos de ratón utilizando fluorescencia intrínseca y generación de segundos armónicos. Esta primera imagen es del testículo de ratón, tomada a 1,4 milímetros por debajo de la superficie del tejido. La propiedad de alta resolución de la microscopía multifotónica nos permite acercarnos y obtener una visión clara de los espermatozoides individuales que se forman en los tubulares seminíferos.

Como se ve en el extremo derecho, mostramos una imagen del pulmón del ratón, que también se tomó a 1,4 milímetros por debajo de la superficie del tejido. Esta imagen es una demostración de imágenes multifotónicas de dos canales en las que los componentes de elastina están marcados en rojo mientras que el colágeno está marcado en verde, el zoom en oli individuales es fácilmente distinguible. Finalmente, mostramos imágenes de alta resolución de las regiones internas del cerebro del ratón que se encuentran a 850 micras por debajo de la superficie del tejido. Al acercar el neocórtex y el hipocampo del cerebro, se pueden ver claramente los astrocitos individuales y los cuerpos de células neuronales.

Sin embargo, cuando se aclaran ópticamente órganos que pueden contener proteínas fluorescentes como YFP, el protocolo de aclaramiento óptico de badra no conserva en absoluto la señal fluorescente de estas proteínas fluorescentes. El protocolo presentado aquí es una forma novedosa de realizar la limpieza óptica de todo el órgano y la obtención de imágenes del esguince de ratón, al tiempo que se preserva la señal fluorescente de YFP y las neuronas, deshidratando el cerebro utilizando una serie graduada con etanol y aclarando con una solución de uno a dos de benzoalcohol, benzoato, también conocido como BAB, para reducir el daño a las proteínas fluorescentes y preservar su señal fluorescente. Para la obtención de imágenes multifotónicas, primero se pesa a los ratones YFP y luego se les anestesia con una inyección intraperitoneal de ketamina xilacina.

Se debe confirmar una placa quirúrgica de anestesia antes de proceder a la cirugía. El animal debe ser revisado cada cinco minutos para ver si reacciona a un pellizco firme del dedo del pie o de la cola. Si el animal reacciona, se requiere una dosis suplementaria de ketamina xilacina.

Una vez anestesiados, los ratones permanecen adheriendo cada extremidad a una cama quirúrgica con cinta de laboratorio para que el ratón esté en posición supina exponiendo su pecho para la cirugía. Para comenzar, se realiza una incisión debajo de la apófisis xifoides con el fin de hacer un corte a lo largo de la base de la caja torácica con tijeras y pinzas para retirar la piel a medida que se realiza el corte. A continuación, se hacen dos cortes a cada lado del esternón del ratón para crear un colgajo de tejido que se mantiene alejado de la cavidad torácica utilizando un hemostático para dejar el corazón expuesto. A continuación, se inserta una aguja de calibre 23 en el ventrículo izquierdo del corazón y se hace una pequeña incisión en la pared muscular de la aurícula derecha para permitir que la sangre escape. Inmediatamente después de cortar la aurícula derecha, se inicia una perfusión con solución salina tamponada con fosfato de cuatro grados Celsius hasta que no drene más sangre de la aurícula derecha.

Durante la perfusión, se utiliza una bomba epistolar y se ajusta a una potencia de bombeo que expulsa el líquido a una distancia de 1,5 a dos pulgadas de la punta de la aguja. Una vez que se ha drenado toda la sangre, el medio de perfusión se cambia a una solución de aldehído paraformado al 4% a cuatro grados centígrados hasta que el cuerpo del ratón se vuelve notablemente rígido y rígido. Después de la perfusión, el ratón se retira del lecho quirúrgico y se decapita para comenzar la extirpación del cerebro con fórceps y tijeras de iris.

El cráneo se extrae en pequeñas secciones, comenzando desde la parte posterior del cráneo y avanzando hacia adelante. Se hacen pequeños cortes cada dos a cuatro milímetros con las tijeras a través del cráneo, mientras que las pinzas se usan para separar cuidadosamente el hueso del cerebro en pequeñas secciones, esto se hace hasta que toda la superficie superior del cerebro queda expuesta. A continuación, se extirpa el cerebro del cráneo con una espátula quirúrgica y se coloca para tomar un frasco de vidrio con aldehído paraformado al 4% para fijarlo durante seis horas.

Si bien nos estamos enfocando principalmente en la imagen del cerebro del ratón que expresa YFP para esta demostración, también limpiaremos ópticamente un ratón, una pata trasera y seccionaremos un intestino delgado para mostrar mejor las capacidades de limpieza de este procedimiento. Después de la posfijación, el cerebro y otros tejidos se lavan dos veces en PBS. A continuación, las muestras de tejido se deshidratan a temperatura ambiente mediante una serie de incubaciones de etanol en concentraciones de 50%, 70%, 90% y 100% de etanol.

Cada incubación dura dos horas y luego una segunda. Se lleva a cabo una incubación de etanol al 100% de 12 horas para extraer eficientemente el agua del tejido fijado. Después de la deshidratación, se vierte la última solución de etanol al 100% y las muestras de tejido se sumergen en una solución uno a uno de etanol a BAB durante dos horas antes de sumergirse en una solución de limpieza al 100% BAB.

Una vez en el bebé, el cerebro y otras muestras de tejido se volverán notablemente transparentes en cuatro o cinco horas. Aquí mostramos un video de lapso de tiempo de las primeras seis horas del proceso de limpieza óptica. El salto marca el momento en que la solución uno a uno de etanol a BAB se reemplazó por una solución 100% BAB.

Al final de las seis horas, todos los órganos muestran signos de transparencia, por ejemplo, el hueso de la pata trasera del ratón ahora es claramente visible para obtener mejores resultados de limpieza. El cerebro debe dejarse despejar durante seis días a temperatura ambiente mientras está protegido de la luz brillante. Una vez que el cerebro está limpio y listo para la toma de imágenes, se fija a la parte inferior de la placa de Petri con acrílico Sano o superpegamento.

Después de que el pegamento se seca, el cerebro emerge en BAB y la placa de Petri se coloca debajo del objetivo para la obtención de imágenes. Para la obtención de imágenes, utilizamos un microscopio multifotónico que incorpora un láser de zafiro de titanio de corbata MI ajustable entre una longitud de onda de excitación de 710 a 990 nanómetros. La longitud de onda de excitación que utilizamos para generar señales YFP es de 886 nanómetros.

A continuación, la señal fluorescente reflectante se captura utilizando un objetivo NIK icon five x que permite obtener imágenes de gran campo de visión. La señal fluorescente reflectante se filtra mediante un filtro de paso de banda 5 35 50 y se recoge mediante una carpeta de alta eficiencia cuántica. El multiplicador dos de las imágenes OMA Matsu se procesa utilizando un software de escaneo de imágenes a una resolución de 2048 por 2048 píxeles utilizando una velocidad de escaneo de dos milisegundos por línea para generar imágenes YFP de alta resolución.

Una vez que se completan las imágenes, el cerebro se retira de la placa P dos y se almacena en BAB y se protege de la luz para futuras imágenes. Las imágenes y videos representativos que se muestran aquí demuestran la capacidad de obtención de imágenes multifotónica de alta resolución que es posible gracias al aclarado óptico. Las imágenes de todo el cerebro permiten que las neuronas de la etiqueta YFP en las diferentes capas del hipocampo y el neocórtex sean claramente visibles a una profundidad de hasta dos milímetros por debajo de la superficie del tejido.

Aquí mostramos un video de una pila de imágenes de 1,2 milímetros de esguince bucal completo, tomadas de 0,8 a dos milímetros en el cerebro para revelar las diferentes capas anatómicas del hipocampo. La siguiente es una imagen representativa de una sección coronal de 1,94 milímetros llamada Bergman tomada de la imagen de dos milímetros de profundidad en la que se han marcado las diferentes capas del hipocampo. Al acercarse al neocórtex, los axones individuales y los cuerpos de las células neuronales de las neuronas perales de la capa cinco del neocórtex se distinguen claramente hasta 1,02 milímetros por debajo de la superficie del tejido.

Aquí mostramos una imagen pegada de las neuronas de la capa cinco tomada entre 700 y 1020 micras por debajo de la superficie del tejido. La siguiente es una imagen representativa de esa pila tomada a 774 micras en el cerebro. Usando esta misma pila de imágenes, se realizó una reconstrucción en 3D de la región neuronal usando el software Image J.

La capacidad de alta resolución de la microscopía multibot también nos permite presentar imágenes de neuronas individuales completas. Aquí mostramos una reconstrucción de una neurona de capa cinco del neocórtex en la que los procesos genéticos D son claramente visibles. Con esto concluye nuestra presentación del aclaramiento óptico, el esguince completo del ratón que expresa YFP.

Realizar esta técnica es relativamente sencillo y, como hemos demostrado, se puede utilizar para ver e imaginar muchas regiones y estructuras diferentes del esguince del ratón. Gracias por mirar y buena suerte.