Rapid Point-of-Care Ensayo de la eficacia anticoagulante enoxaparina en sangre entera

Demostración de un ensayo cuantitativo rápido de la inhibición de la coagulación de la sangre por el bajo peso molecular de la heparina, enoxaparina. La contribución de la enoxaparina se evalúa mediante la eliminación de su influencia a través de la digestión con heparinasa. Una descripción más completa de la prueba se detalla en nuestro artículo publicado.

A modo de introducción, nos remitimos aquí a los trabajos publicados sobre el curso temporal de los niveles plasmáticos de la heparina enoxaparina de bajo peso molecular en sujetos humanos. Hoy estamos demostrando nuestros resultados con un ensayo rápido en el punto de atención para la heparina de bajo peso molecular. En este caso, la entidad es Enoxaparina.

Los resultados mostrados en esta diapositiva muestran la concentración plasmática en pacientes que han estado recibiendo el fármaco de forma crónica una vez al día, 40 miligramos al día, y el coste del tiempo de esa última administración seguida hasta su posterior desaparición, se puede ver entonces que aproximadamente cuatro horas después de la administración, se alcanza una concentración máxima de 0,4 unidades internacionales por ML, Y ese nivel está dentro del rango terapéutico del fármaco. Un punto de particular interés también, sin embargo, es cuánto queda 12 horas después de la administración, ya que existe una directriz clínicamente aceptada que dice que se deben esperar al menos 12 horas después de la administración de heparina de bajo peso molecular, en este caso Enoxaparin antes de realizar algún procedimiento particularmente invasivo, lo que podría resultar en un riesgo de sangrado. Es de interés para nosotros que todavía hay una cantidad claramente detectable presente en ese momento, y nos hemos centrado en eso en algunos de nuestros estudios, como demostraremos.

También se presenta en este trabajo el hecho de que los individuos con insuficiencia renal tienen niveles considerablemente más altos del fármaco a lo largo del curso del tiempo, y vemos que la pauta de 12 horas podría ser muy inadecuada en el caso de un paciente con insuficiencia renal o como se conoce en una mujer embarazada o en pacientes obesos. Me gustaría presentar a los investigadores que han estado involucrados en este proyecto en el Colegio Médico de Nueva York. Mi nombre es Mario Osa.

Soy profesor de farmacología aquí. Soy la Dra. Surya Patula, profesora asociada de anestesiología clínica en el Colegio Médico de Nueva York. Mi nombre es Keshar Kal.

Soy estudiante de tercer año de medicina. Este es el aparato que utilizamos para estos ensayos. El aparato es producido por Omicron Corporation.

Se puede utilizar tanto en línea como con pilas, por lo que es un verdadero punto de atención en ese sentido. El aparato tiene dos compartimentos controlados termostáticamente y utilizamos estos compartimentos para la preincubación de las muestras en la preparación para el ensayo real, así como para el ensayo de coagulación en sí. Una característica importante del ensayo es el uso de una preparación de heparinasa altamente purificada y disponible comercialmente.

Lo compramos a la corporación Siemens. Se proporciona en una forma muy estable y es fácilmente soluble en solución salina o cualquier solución acuosa. El uso de heparina ECA es especialmente valioso en nuestro abordaje porque nos permite obtener el valor basal de la coagulación del paciente.

En ausencia de cualquier influencia de la heparina, la heparina, la ECA es capaz de degradar completamente la heparina de bajo peso molecular y la heparina no fraccionada, pero nuestro interés particular aquí es la heparina de bajo peso molecular y degradar a la inactividad y producir un valor para el tiempo de coagulación en ausencia de cualquier influencia de la heparina. Lo que estamos ilustrando aquí es el curso temporal de la degradación de la heparina de bajo peso molecular, en este caso la enoxaparina por la heparinasa. Los datos se representan como un porcentaje del tiempo de corte de referencia, por lo que lo que vemos aquí es que se agregó enoxaparina a un anti 10.

Una unidad internacional por ML provoca aproximadamente un 50% de extensión en el tiempo de coagulación de la sangre. Luego, después de diferentes períodos de incubación con heparinasa a 37 grados centígrados, vemos el costo de tiempo para la recuperación de los tiempos de coagulación basales. En otras palabras, la degradación completa de la enoxaparina a la inactividad.

En cuanto al efecto anticoagulante, lo vemos ya en un minuto y medio. Básicamente, hay una recuperación del 100% del tiempo de coagulación de referencia. Después de inspeccionar este curso de tiempo, elegimos usar cinco minutos de incubación como nuestra preincubación estándar de la sangre antes de medir el tiempo de coagulación.

Los tubos de ensayo para este ensayo de punto de atención se han modificado ligeramente con respecto a la forma en que los recibimos del fabricante. Estos tubos originalmente contenían caolín activador, que está presente para medir el tiempo de coagulación activado. Hemos descubierto que cuando usamos el tubo sin el activador, aumenta su sensibilidad de manera bastante sustancial.

Hemos llamado a esto nuestro ensayo mínimamente activado porque creemos que la única fuente posible de activación sería ahora la superficie de vidrio del tubo y tal vez el imán. El imán es la parte esencial del ensayo automatizado. Estos tubos giran en los pozos de los tubos y cuando el imán es atrapado por un coágulo de densidad para provocar su pérdida de movimiento, entonces eso se detecta y señala la finalización de la coagulación.

También estudiamos el ensayo utilizando el cartucho de tiempo de platín con trombo parcial activado por ómicron. El ensayo se lleva a cabo de la misma manera. Hay un poco más de activación presente en este sistema.

Nuestro primer paso es reconstituir la heparinasa de lirio a medida que la recibimos en su vial. Añadimos 0,25 ml de solución salina al vial y luego dejamos pasar aproximadamente 20 segundos para que se disuelva por completo. A continuación, aspiramos todo el contenido del vial en una jeringa de tuberculina, recuperando normalmente unos 0,2 ml en este siguiente paso.

Las adiciones para la preincubación se añaden a las muestras de sangre recién extraídas que contienen enoxaparina en tubos vacutainer de tres ml. La primera edición representa la heparinasa y que se está mezclando en este momento. El siguiente punto es la adición de 0,2 ml de solución salina al tubo que contiene enoxaparina pero no heparinasa para un volumen total de VO comparable.

Utilizamos el temporizador incorporado del instrumento para contar los 300 segundos. Es decir, cinco minutos de preincubación. Los tubos de vacío se retiran cuando se completa la preincubación.

El paso final es la transferencia de dos ml de las muestras preincubadas a nuestros tubos de ensayo mínimamente activados. Estos tubos están precargados con cien microlitros de cloruro de calcio 0,25 molar para iniciar la coagulación. Este primer tubo es el pre incubado con heparinasa.

La segunda muestra es la que contiene enoxaparina pero no heparinasa. Los temporizadores expresan el tiempo transcurrido desde la adición de cloruro de calcio, y ahora podemos ver que la primera muestra está completa. Es decir, el vial superior a los 200 segundos necesario para completar la coagulación.

La muestra que no contenía heparinasa se está llevando a cabo de manera más larga y ya ha terminado. Esta es una simulación de nuestro resultado típico con sangre enriquecida con 0,4 unidades internacionales de Enoxaparina por ml. Eso es aproximadamente un acortamiento de 45 segundos del tiempo de coagulación a esta concentración de enoxaparina o una disminución del 18% en el tiempo de coagulación.

Como se puede ver, la detección de coágulos está automatizada y los tiempos se conservan en el instrumento hasta que se completa la inspección. Debemos mencionar que hemos probado este ensayo a una concentración tan baja como 0,1 unidades internacionales de enoxaparina por ml. Como señalamos en la introducción, esta es la concentración que podría estar presente 12 horas después de una dosis terapéutica típica de Enoxaparina.

También hemos sido capaces de detectar de forma fiable a esta concentración.