Name: Rapid Point-of-Care Ensayo de la eficacia anticoagulante enoxaparina en sangre entera (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Aprende un ensayo rápido de punto de atención para evaluar la eficacia anticoagulante de la enoxaparina en sangre entera usando heparinasa. Este método permite determinar los tiempos de coagulación basales y monitorear la farmacocinética del fármaco en pacientes.

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Las investigaciones se llevaron a cabo únicamente con el apoyo de los recursos departamentales e institucionales. El aparato de la coagulación (Hemochron 801) fue cedido sin compromiso por el fabricante. Los cartuchos de ensayo fueron adquiridos en sus costos de venta. La cifra de introducción en el video fue modificado a partir de Sanderink, et al. 12 La segunda figura en el vídeo (digestión heparinasa evolución en el tiempo) se reprodujo con permiso de Inchiosa et al. 1

1. Heparinasa Reconstitución <ol><li> Liofilizado I heparinasa se obtiene comercialmente (Siemens, Newark Delaware, DadeHepzyme REF B4240-10) en viales que contienen 1 g de la proteína purificada. La proteína se disolvió en 0,25 ml de solución salina (0,9% NaCl). </li></ol> 2. Toma de muestras de sangre <ol><li> Dos muestras de sangre por vacío en citrato de sodio (0,3 ml 0,109 M; 3,2%) tamponada tubos Vacutainer (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ); los tubos son ambos pre-claveteado con una concentración conocida de enoxaparina; el volumen de sangre que se dibuja es de 2,7 ml. El contenido total es entonces 3,0 ml. </li></ol> 3. Heparinasa Digestión <ol><li> El contenido completo del vial de la heparinasa que puede ser aspirado en una jeringa (aproximadamente 0,2 ml; 80% del vial; 0,8 g de proteína), se transfiere al tubo Vacutainer uno; 0,2 ml de solución salina (0,9% NaCl) se añade a el segundo tubo, que sirve como el Basileaine estado antes de la eliminación del efecto de la enoxaparina. </li><li> Ambos tubos Vacutainer se colocan en los pocillos termostatizado del aparato Hemochron durante un período de 5 min. (La adecuación de un tiempo de digestión 5 minutos con heparinasa se ​​estableció en nuestro trabajo previamente publicado. 1) </li></ol> 4. Ensayos de coagulación <ol><li> Al final de la incubación heparinasa, 2,0 ml de sangre se transfiere al cartucho de ensayo. En el caso del tubo de MAA, es pre-llenado con 0,1 ml de CaCl $ 250 2 mM para iniciar la coagulación. El ensayo aPTT comercial cartucho (A104) está diseñado para iniciar la coagulación en sangre total, que se ha elaborado en tubos vacutainer que contenían citrato de sodio como anticoagulante. </li><li> El aparato Hemochron indica la finalización de la coagulación sanguínea y preserva los tiempos de coagulación en segundos. La diferencia en los tiempos de coagulación entre la muestra tratada con heparinasa y la muestra de referencia, dividido por la coagulación de time para la muestra de referencia, se obtiene el porcentaje de disminución resultante de la eliminación de la enoxaparina. Como se discute abajo, fuertes correlaciones lineales se han obtenido para la relación entre el porcentaje de disminución en el tiempo de coagulación y la concentración de la enoxaparina en muestras enriquecidas de sangre entera, así como para la correlación con las concentraciones medidas de enoxaparina por el ensayo chromgenic de anti-Xa actividad. Anti-Xa ensayos de concentración de enoxaparina se llevaron a cabo con un kit comercial para un ensayo cromogénico de dos etapas (BIOPHEN; Aniara, Mason, OH). </li></ol>

<ol><li>Inchiosa, M. A. J. r, Pothula, S., Kubal, K., Sanchala, V. T., Navarro, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+development+of+a+point-of-care+assay+of+enoxaparin+anticoagulant+activity+in+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Thromb.+Thrombolysis%22%5BJournal%5D)">Toward development of a point-of-care assay of enoxaparin anticoagulant activity in whole blood.</a> J. Thromb. Thrombolysis. 32, 47-53 (2011).</li>
<li>Despotis, G. J., Filos, K. S., Levine, V., Alsoufiev, A., Spitznagel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aprotinin+prolongs+activated+and+nonactivated+whole+blood+clotting+time+and+potentiates+the+effect+of+heparin+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth.+Analg%22%5BJournal%5D)">Aprotinin prolongs activated and nonactivated whole blood clotting time and potentiates the effect of heparin in vitro.</a> Anesth. Analg. 82, 1126-1131 (1996).</li>
<li>Pothula, S., Inchiosa, M. A. Jr, Sanchala, V. T., Sarabu, M., Inchiosa, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+effect+of+protamine+excess+on+blood+coagulation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth+Analg%22%5BJournal%5D)">In vitro effect of protamine excess on blood coagulation assays.</a> Anesth Analg. 96, SCA39(2010).</li>
<li>Inchiosa, M. Jr, Pothula, S., Sanchala, V., Kubal, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+low+plasma+levels+of+low+molecular+weight+heparin%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth+Analg%22%5BJournal%5D)">Detection of low plasma levels of low molecular weight heparin.</a> Anesth Analg. 102, SCA10(2010).</li>
<li>Gogarten, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+new+antithrombotic+drugs+on+regional+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Anaesthesiol%22%5BJournal%5D)">The influence of new antithrombotic drugs on regional anesthesia.</a> Curr. Opin. Anaesthesiol. 19, 545-550 (2006).</li>
<li>Gouin-Thibault, I., Pautas, E., Siguret, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+profile+of+different+low-molecular+weight+heparins+used+at+therapeutic+dose%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Saf%22%5BJournal%5D)">Safety profile of different low-molecular weight heparins used at therapeutic dose.</a> Drug Saf. 28, 333-349 (2005).</li>
<li>Bazinet, A., Almanric, K., Brunet, C., Turcotte, I., Martineau, J., Caron, S., Blais, N., Lalonde, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dosage+of+enoxaparin+among+obese+and+renal+impairment+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+Res%22%5BJournal%5D)">Dosage of enoxaparin among obese and renal impairment patients.</a> Thromb. Res. 116, 41-50 (2005).</li>
<li>El Rouby, S., Cohen, M., Gonzales, A., Hoppensteadt, D., Lee, T., Zucker, M. L., Khalid, K., LaDuca, F. M., Fareed, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+a+HEMOCHRON+JR.+HEMONOXTM+point+of+care+test+in+monitoring+the+anticoagulant+effect+of+enoxaparin+during+interventional+coronary+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Thromb.+Thrombolysis%22%5BJournal%5D)">The use of a HEMOCHRON JR. HEMONOXTM point of care test in monitoring the anticoagulant effect of enoxaparin during interventional coronary procedures.</a> J. Thromb. Thrombolysis. 21, 137-145 (2006).</li>
<li>Yang, V. C., Bernstein, H., Cooney, C. L., Kadam, J. C., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+the+anticoagulant+activities+of+the+low+molecular+weight+heparin+fractions+and+fragments+with+flavobacterial+heparinase%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Removal of the anticoagulant activities of the low molecular weight heparin fractions and fragments with flavobacterial heparinase.</a> Thromb Res. 44, 599-610 (1986).</li>
<li>Maddineni, J., Walenga, J. M., Jeske, W. P., Hoppensteadt, D. A., Fareed, J., Wahi, R., Bick, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Product+individuality+of+commercially+available+low-molecular-weight+heparins+and+their+generic+versions%3A+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Applied+Thrombosis%2FHemostasis%22%5BJournal%5D)">Product individuality of commercially available low-molecular-weight heparins and their generic versions: therapeutic implications.</a> Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 12, 267-276 (2006).</li>
<li>Wijnhoven, T. J., van de Westerlo, E. M., Smits, N. C., Lensen, J. F., Rops, A. L., vander Vlag, J., Berden, J. H., vanden Heuvel, L. P., van Kuppevelt, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+anticoagulant+heparinoids+by+immunoprofiling%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj.+J%22%5BJournal%5D)">Characterization of anticoagulant heparinoids by immunoprofiling.</a> Glycoconj. J. 25, 177-185 (2008).</li>
<li>Sanderink, G. -J. C. M., Guimart, C. G., Ozoux, M. -L., Jariwala, N. U., Shukla, U. A., Boutouyrie, B. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetics+and+pharmacodynamics+of+the+prophylactic+dose+of+enoxaparin+once+daily+over+4+days+in+patients+with+renal+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+Res%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetics and pharmacodynamics of the prophylactic dose of enoxaparin once daily over 4 days in patients with renal impairment.</a> Thromb. Res. 105, 225-231 (2002).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este ensayo de eficacia de enoxaparina puede servir como una opción importante para determinar la seguridad relativa de la realización de un procedimiento invasivo que tiene un riesgo asociado de hemorragia o el desarrollo de un hematoma. Esto sería de particular importancia cuando una inyección epidural se está considerando. La mayoría de las guías recomiendan un período de espera de 12 horas entre la inyección de enoxaparina y la iniciación de un procedimiento invasivo 5 Insuficiencia renal, la obesidad y el embarazo puede influir en los requisitos de dosificación de enoxaparina 6,7 Dado que el ensayo puede ser completado en un 10.. - min período, también podría ser usado en una clínica o consulta del médico, en el que proporcionaría información sobre la adecuación de la anticoagulación en pacientes que están en un riesgo de desarrollo de tromboembolismo venoso. Ajustes inmediatos de dosis podría ser instituido, según sea necesario. La concentración de la enoxaparina en el plasma se puede medir por un cromogénico unssay de la extensión de la inhibición del factor de coagulación, Xa. Sin embargo, esto sólo da su concentración no, específicamente su eficacia anticoagulante, que varía ampliamente entre los pacientes individuales. 6-8 Nuestros estudios se llevaron a cabo sólo con enoxaparina. Sin embargo, se puede anticipar que el ensayo se podría aplicar a cualquier HBPM que se degrada por la heparinasa I. Esto ya es conocido por ser el caso para la dalteparina, nadroparina y tinzaparina. 9-11 Se diseñó el ensayo en relación con las características de el instrumento Hemochron tiempo de coagulación. El instrumento es relativamente barato, también, los tubos de recogida de sangre desechables, heparinasa ampollas y cartuchos de ensayo para realizar un análisis para un paciente es de aproximadamente 15 dólares. Por lo tanto, se espera que sea adecuado para controlar el estado anticoagulante en diversos escenarios clínicos.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Hepzyme </td><td> Siemens </td><td> B4240 </td><td> heparinasa I </td></tr><tr><td> &quot;MAA&quot; cartucho </td><td> Technidyne </td><td> FTK-ACT </td><td> modificada por la eliminación caolín </td></tr><tr><td> TTPa cartucho </td><td> Technidyne </td><td> A104 </td><td></td></tr></tbody></table>

rapid point-of-care ensayo de la eficacia anticoagulante enoxaparina en sangre entera

Rapid Point-of-Care Assay of Enoxaparin Anticoagulant Efficacy in Whole Blood

Existe la necesidad de un ensayo clínico para determinar la medida en que es efectivamente la sangre de un paciente anticoagulada por el bajo peso molecular de la heparina (HBPM), enoxaparina. Hay también urgentes situaciones clínicas en las que sería importante si esto podría ser determinada rápidamente. El presente ensayo está diseñado para lograr esto. Sólo se ensayaron muestras de sangre humana que fueron inoculadas con concentraciones conocidas de enoxaparina. La característica esencial del presente ensayo es la cuantificación de la eficacia de la enoxaparina en la muestra de sangre de un paciente mediante la degradación de que se complete la inactividad con heparinasa. Dos muestras de sangre fueron extraídas en tubos Vacutainer (Becton Dickenson-; Franklin Lakes, NJ) que se cargaron con enoxaparina; una muestra se digirió con heparinasa durante 5 min a 37 ° C, la otra muestra representada estado basal del paciente anticoagulada. El porcentaje de acortamiento del tiempo de coagulación en la muestra tratada con heparinasa, en comparación con la bestado aseline, cedió la contribución anticoagulante de la enoxaparina. Se utilizó el portátil, funciona con baterías Hemochron aparato 801 para la medición de los tiempos de coagulación (International Technidyne Corp., Edison, NJ). El aparato dispone de 2 termostáticas (37 ° C) pozos de tubo de ensayo. Hemos llevado a cabo ensayos en dos tipos de cartuchos de ensayo que están disponibles desde el fabricante del instrumento. Un cartucho se modificó para aumentar su sensibilidad. Hemos eliminado el caolín del cartucho FTK-ACT por extenso lavado con agua destilada, dejando sólo la superficie de vidrio del tubo, y tal vez el imán de detección, como activadores. Llamamos a este ensayo mínimamente activa nuestra (MAA). El uso de un ensayo mínimamente activa ha sido estudiado por nosotros y otros. 2-4 El segundo cartucho que se estudió era un tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT) (A104). Esto fue usado tal como se suministra por el fabricante. Los pozos termostatados del instrumento were utiliza tanto para la digestión con heparinasa y ensayos de coagulación. El ensayo puede ser completada dentro de 10 min. El ensayo MAA mostró cambios robustos en tiempo de coagulación después de la digestión con heparinasa de la enoxaparina sobre un rango de concentración clínica típica. A 0,2 UI anti-Xa de la enoxaparina por ml de muestra de sangre, la digestión con heparinasa causado una disminución media del 9,8% (20,4 seg) en el tiempo de coagulación; menos 1,0 UI por ml de enoxaparina hubo una disminución del 41,4% (148,8 seg). Este informe sólo presenta la aplicación experimental del ensayo; su valor en un entorno clínico todavía debe ser establecido.

La Figura 1 presenta los resultados para las relaciones entre el porcentaje de disminución en el tiempo de coagulación después de la eliminación de la enoxaparina con heparinasa de una serie de concentraciones con púas de enoxaparina (0,2, 0,4 y 1,0 anti-Xa UI por ml). Los resultados se presentan tanto para el MAA y cartuchos de ensayo aPTT. Las concentraciones medidas de enoxaparina de ensayo cromogénico de actividad anti-Xa se incluyen también en la abscisa de cada parcela. La Figura 2 presenta los gráficos de los mismos datos que por ciento de disminución en el tiempo de coagulación frente a medida cromogénico de actividad anti-Xa. Fuertes correlaciones lineales, con altas significancias estadísticas, se encontraron resultados para los cuatro relaciones. <img src="/files/ftp_upload/3852/3852fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Punto de determinaciones de atención de la enoxaparina contribution a tiempos de coagulación de sangre entera con púas basado en el porcentaje de cambio (acortamiento) de tiempo de coagulación después de la incubación con heparinasa. Las concentraciones de enoxaparina púas añadido a la sangre entera y los medidos de anti-Xa concentraciones en plasma (media ± SE, en paréntesis) se colocan en el eje de abscisas de cada gráfica. Todos los porcentajes de cambio en los tiempos de coagulación se presentan como medias y SE, junto con el acortamiento del tiempo de coagulación promedio en segundos. Los datos del mismo paciente están conectados por líneas de trazos. Los datos para los cuatro pacientes identificados con un asterisco en la parcela A son (resultados MAA) lo mismo que los cuatro pacientes en parcela B (ensayos APTT). Todos los resultados representan determinaciones individuales. Los coeficientes de correlación de Pearson fue de r = 0,869 (p = 1,9 x 10 -5) y r = 0,916 (p = 2,8 x 10 -5) para las relaciones con el MAA y aPTTassay, respectivamente. Reproducido con el permiso de Inchiosa et al. 1 . Figura 2 Los resultados de los porcentajes de cambio en los tiempos de coagulación en los ensayos de punto de cuidado que se muestran en las Figuras 1A y B se representan frente a plasma anti-factor Xa A concentraciones resultados MAA,;. B, ensayos de aPTT. Todos los resultados son de un solo ensayos de tiempo de coagulación y un único análisis de anti-factor Xa concentraciones. Los coeficientes de correlación de Pearson fue de r = 0,910 (p = 2,5 x 10 -6) y r = 0,922 (p = 2,0 x 10 -5) para las relaciones con el MAA y el ensayo de APTT, respectivamente Reproducido con permiso de Inchiosa et al. 1

Demostración de un ensayo cuantitativo rápido de la inhibición de la coagulación de la sangre por el bajo peso molecular de la heparina, enoxaparina. La contribución de la enoxaparina se evalúa mediante la eliminación de su influencia a través de la digestión con heparinasa. Una descripción más completa de la prueba se detalla en nuestro artículo publicado.<sup&gt; 1</sup&gt; El ensayo aún requiere la confirmación clínica.

Rapid Point-of-Care Ensayo de la eficacia anticoagulante enoxaparina en sangre entera

Existe la necesidad de un ensayo clínico para determinar el grado en que la sangre de un paciente está anticoagulada eficazmente mediante el...

Como introducción, nos referimos aquí al trabajo publicado sobre el curso temporal de los niveles plasmáticos de la heparina de bajo peso molecular Enoxaparina en sujetos humanos. Hoy presentamos nuestros resultados con un ensayo rápido de diagnóstico en el lugar de atención para heparina de bajo peso molecular. En este caso, la entidad es Enoxaparina.Los resultados mostrados en esta diapositiva representan la concentración plasmática en pacientes que han estado recibiendo el fármaco crónicamente una vez al día, 40 miligramos por día, y el costo temporal de esa última administración seguido hasta su desaparición posterior se puede observar entonces que aproximadamente cuatro horas después de la administración, se alcanza una concentración máxima de 0,4 unidades internacionales por mL, y ese nivel se encuentra dentro del rango terapéutico del fármaco. Un punto de particular interés también, sin embargo, es cuánto permanece 12 horas después de la administración porque existe una guía clínicamente aceptada que indica que se debe esperar al menos 12 horas después de la administración de heparina de bajo peso molecular, en este caso Enoxaparina, antes de realizar algún procedimiento particularmente invasivo, que podría resultar en un riesgo de sangrado. Es de nuestro interés que aún haya una cantidad claramente detectable presente en ese momento, y nos hemos centrado en ello en algunos de nuestros estudios, como demostraremos.También presentado en este trabajo por Sender et al. es el hecho de que los individuos con alteración renal presentan niveles considerablemente más altos del fármaco durante todo el período de tiempo, y observamos que la pauta de 12 horas podría ser muy inadecuada en el caso de un paciente con alteración renal o, como se sabe, en una mujer embarazada o en pacientes con obesidad. Me gustaría presentar a los investigadores que han participado en este proyecto en la Facultad de Medicina de Nueva York. Mi nombre es Mario Osa.Soy profesor de farmacología aquí. Soy el Dr. Surya Patula, profesor asociado de Anestesiología Clínica del Colegio de Medicina de Nueva York. Mi nombre es Keshar Kal.Soy un estudiante de tercer año de medicina. Este es el aparato que utilizamos para estos ensayos. El aparato es producido por la Corporación Omicron.Puede utilizarse conectado a la corriente o con batería, por lo que es verdaderamente un dispositivo de atención inmediata en ese sentido. El aparato tiene dos compartimentos controlados termostáticamente y utilizamos estos compartimentos para una preincubación de las muestras durante la preparación del ensayo propiamente dicho, así como para el ensayo de coagulación en sí. Una característica importante del ensayo es el uso de una preparación altamente purificada y disponible comercialmente de heparinasa.Adquirimos esto de la corporación Siemens. Se proporciona en una forma muy estable y es fácilmente soluble en solución salina o cualquier solución acuosa. El uso de la ECA de heparina es particularmente valioso en nuestro enfoque porque nos permite obtener el valor basal de coagulación del paciente.En ausencia de cualquier influencia de heparina, la ECA es capaz de degradar completamente la heparina de bajo peso molecular y la heparina no fraccionada, pero nuestro interés particular aquí radica en la heparina de bajo peso molecular, degradándola hasta la inactividad y obteniendo un valor del tiempo de coagulación en ausencia de cualquier influencia de heparina. Lo que estamos ilustrando aquí es el curso temporal de la degradación de la heparina de bajo peso molecular, en este caso la enoxaparina, por acción de la heparinasa. Los datos se representan como un porcentaje del tiempo de corte basal, por lo que lo que observamos aquí es que la enoxaparina añadida a una anti 10.Una unidad internacional por ml provoca aproximadamente una extensión del 50 % en el tiempo de coagulación de la sangre. Luego, tras períodos variables de incubación con heparinasa a 37 grados centígrados, observamos el tiempo necesario para la recuperación de los tiempos de coagulación basales. En otras palabras, la degradación completa de la enoxaparina hasta su inactividad.En cuanto al efecto anticoagulante, observamos que ya a los minuto y medio existe esencialmente una recuperación del 100 % del tiempo de coagulación basal. Tras examinar este curso temporal, decidimos utilizar cinco minutos de incubación como nuestro período estándar de preincubación de la sangre antes de medir el tiempo de coagulación.Los tubos de ensayo para este ensayo de atención primaria han sido ligeramente modificados respecto a cómo los recibimos del fabricante. Estos tubos originalmente contenían caolín activador, que está presente para la medición del tiempo de coagulación activado. Hemos encontrado que cuando utilizamos el tubo sin el activador, su sensibilidad aumenta considerablemente.Hemos denominado este nuestro ensayo mínimamente activado porque consideramos que la única fuente posible de activación sería ahora la superficie de vidrio del tubo y quizás el imán. El imán es la parte esencial del ensayo automatizado. Estos tubos giran en los pozos del tubo y cuando el imán queda atrapado por un coágulo de densidad que provoca la pérdida de su movimiento, esto se detecta y señala la finalización de la coagulación.También estudiamos el ensayo utilizando el cartucho de tiempo de tromboplastina parcial activado con ómicron. El ensayo se realiza de la misma manera. En este sistema hay una activación ligeramente mayor.Nuestro primer paso consiste en reconstituir la heparinasa de lirio, ya que la recibimos en su vial. Añadimos 0,25 ml de solución salina al vial y luego dejamos aproximadamente 20 segundos para que se disuelva completamente. A continuación, aspiramos todo el contenido del vial en una jeringa tuberculínica, recuperando normalmente unos 0,2 ml en este siguiente paso.Los aditivos para la preincubación se añaden a muestras de sangre recién extraída que contienen enoxaparina en tubos vacutainer de tres ml. La primera adición corresponde a la heparinasa, que se mezcla en este momento. A continuación, se realiza la adición de 0,2 ml de solución salina al tubo que contiene enoxaparina pero sin heparinasa, para obtener un volumen total comparable al VO.Utilizamos el temporizador integrado del instrumento para contar los 300 segundos. Eso equivale a cinco minutos de preincubación. Los tubos vacu se retiran cuando finaliza la preincubación.El paso final consiste en transferir dos ml de las muestras preincubadas a nuestros tubos de ensayo mínimamente activados. Estos tubos están previamente llenos con cien microlitros de cloruro de calcio 0,25 molar para iniciar la coagulación. Este primer tubo es el que se preincubó con heparinasa.La segunda muestra es la que contiene enoxaparina pero no heparinasa. Los temporizadores indican el tiempo transcurrido desde la adición de cloruro de calcio, y ahora podemos observar que la primera muestra ha finalizado. Es decir, el frasco superior requirió 200 segundos para completar la coagulación.La muestra que no contenía heparinasa tardó más y ya ha finalizado. Esta es una simulación de nuestro resultado típico con sangre enriquecida con 0,4 unidades internacionales de enoxaparina por ml. Esto equivale a un acortamiento de aproximadamente 45 segundos en el tiempo de coagulación a esta concentración de enoxaparina, o a una disminución del 18% en el tiempo de coagulación.Como puede observarse, la detección de coagulación es automática y los tiempos se conservan en el instrumento hasta que la inspección finaliza. Debemos mencionar que en realidad hemos probado este ensayo con una concentración tan baja como 0,1 unidades internacionales de enoxaparina por ml. Como señalamos en la introducción, esta es la concentración que podría estar presente 12 horas después de una dosis terapéutica típica de enoxaparina.Hemos podido detectar de forma confiable también a esta concentración.

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