Name: Uso de un medio artificial de esputo para probar la eficacia de antibióticos contra la Pseudomonas aeruginosa En condiciones más pertinentes a la fibrosis quística pulmonar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Aprende a evaluar la eficacia de antibióticos contra biofilms de Pseudomonas aeruginosa utilizando un medio artificial de esputo que simula condiciones pulmonares de fibrosis quística. Este método permite determinar la concentración inhibitoria mínima en condiciones fisiológicas realistas.

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Queremos agradecer el apoyo del Reino Unido, el Instituto Nacional de Investigación en Salud, el Dr. Hadwen Fideicomiso para la Investigación Humana, la principal de financiación médica del Reino Unido organización benéfica de investigación exclusivamente técnicas sin animales de investigación para sustituir los experimentos con animales, y el Wellcome Trust (089.215 de subvención). También agradecemos a Novartis Pharmaceuticals UK Ltd (beca educativa sin restricciones).

<ol><li>Andrews, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BSAC+standardized+disc+susceptibility+testing+method+%28version+8%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">BSAC standardized disc susceptibility testing method (version 8).</a> J. Antimicrob. Chemother. 64, 454-489 (2009).</li>
<li>Worlitzsch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+reduced+mucus+oxygen+concentration+in+airway+Pseudomonas+infections+of+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients.</a> J. Clin. Invest. 109, 317-325 (2002).</li>
<li>Smith, A. L., Fiel, S. B., Mayer-Hamblett, N., Ramsey, B., Burns, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibility+testing+of+Pseudomonas+aeruginosa+isolates+and+clinical+response+to+parenteral+antibiotic+administration%3A+lack+of+association+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Susceptibility testing of Pseudomonas aeruginosa isolates and clinical response to parenteral antibiotic administration: lack of association in cystic fibrosis.</a> Chest. 123, 1495-1502 (2003).</li>
<li>Sriramulu, D. D., Lunsdorf, H., Lam, J. S., Romling, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcolony+formation%3A+a+novel+biofilm+model+of+Pseudomonas+aeruginosa+for+the+cystic+fibrosis+lung%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microcolony formation: a novel biofilm model of Pseudomonas aeruginosa for the cystic fibrosis lung.</a> J. Med. Microbiol. 54, 667-676 (2005).</li>
<li>Garbe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+JG024%2C+a+pseudomonas+aeruginosa+PB1-like+broad+host+range+phage+under+simulated+infection+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of JG024, a pseudomonas aeruginosa PB1-like broad host range phage under simulated infection conditions.</a> BMC Microbiol. 10, 301(2010).</li>
<li>Naughton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+AES-1+exhibits+increased+virulence+gene+expression+during+chronic+infection+of+cystic+fibrosis+lung%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa AES-1 exhibits increased virulence gene expression during chronic infection of cystic fibrosis lung.</a> PLoS One. 6, e24526(2011).</li>
<li>Moskowitz, S. M., Foster, J. M., Emerson, J. C., Gibson, R. L., Burns, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Pseudomonas+biofilm+susceptibilities+to+assign+simulated+antibiotic+regimens+for+cystic+fibrosis+airway+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">Use of Pseudomonas biofilm susceptibilities to assign simulated antibiotic regimens for cystic fibrosis airway infection.</a> J. Antimicrob. Chemother. 56, 879-886 (2005).</li>
<li>Field, T. R., White, A., Elborn, J. S., Tunney, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+oxygen+limitation+on+the+in+vitro+antimicrobial+susceptibility+of+clinical+isolates+of+Pseudomonas+aeruginosa+grown+planktonically+and+as+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Clin.+Microbiol.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Effect of oxygen limitation on the in vitro antimicrobial susceptibility of clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa grown planktonically and as biofilms.</a> Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 24, 677-687 (2005).</li>
<li>Bjarnsholt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+in+the+respiratory+tract+of+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.+Pulmonol%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa biofilms in the respiratory tract of cystic fibrosis patients.</a> Pediatr. Pulmonol. 44, 547-558 (2009).</li>
<li>Hill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+susceptibilities+of+Pseudomonas+aeruginosa+isolates+derived+from+patients+with+cystic+fibrosis+under+aerobic%2C+anaerobic%2C+and+biofilm+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antibiotic susceptibilities of Pseudomonas aeruginosa isolates derived from patients with cystic fibrosis under aerobic, anaerobic, and biofilm conditions.</a> J. Clin. Microbiol. 43, 5085-5090 (2005).</li>
<li>Fung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+a+mucin-containing+synthetic+growth+medium+mimicking+cystic+fibrosis+lung+sputum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Gene expression of Pseudomonas aeruginosa in a mucin-containing synthetic growth medium mimicking cystic fibrosis lung sputum.</a> J. Med. Microbiol. 59, 1089-1100 (2010).</li>
<li>Andrews, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BSAC+standardized+disc+susceptibility+testing+method+%28version+8%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+antimicrobial+chemotherapy%22%5BJournal%5D)">BSAC standardized disc susceptibility testing method (version 8).</a> The Journal of antimicrobial chemotherapy. 64, 454-489 (2009).</li>
<li>Rybtke, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+implication+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+in+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm+Allergy+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">The implication of Pseudomonas aeruginosa biofilms in infections.</a> Inflamm Allergy Drug Targets. 10, 141-157 (2011).</li>
<li>Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+formation+in+the+cystic+fibrosis+airway%5BTitle%5D)+AND+%22Pulm.+Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway.</a> Pulm. Pharmacol. Ther. 21, 595-599 (2008).</li>
<li>Ahmed, S. A., Gogal, R. M., Walsh, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+rapid+and+simple+non-radioactive+assay+to+monitor+and+determine+the+proliferation+of+lymphocytes%3A+an+alternative+to+%5B3H%5Dthymidine+incorporation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A new rapid and simple non-radioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay.</a> J. Immunol. Methods. 170, 211-224 (1994).</li>
<li>Fothergill, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+antibiotic+treatment+on+bacteriophage+production+by+a+cystic+fibrosis+epidemic+strain+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Effect of antibiotic treatment on bacteriophage production by a cystic fibrosis epidemic strain of Pseudomonas aeruginosa.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 55, 426-428 (2011).</li>
<li>Singh, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quorum-sensing+signals+indicate+that+cystic+fibrosis+lungs+are+infected+with+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Quorum-sensing signals indicate that cystic fibrosis lungs are infected with bacterial biofilms.</a> Nature. 407, 762-764 (2000).</li>
<li>Mowat, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+Aeruginosa+Population+Diversity+and+Turnover+in+Cystic+Fibrosis+Chronic+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care.+Med%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas Aeruginosa Population Diversity and Turnover in Cystic Fibrosis Chronic Infections.</a> Am. J. Respir. Crit. Care. Med. , (2011).</li>
<li>Fothergill, J. L., Mowat, E., Ledson, M. J., Walshaw, M. J., Winstanley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+in+phenotypes+and+genotypes+within+populations+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+the+cystic+fibrosis+lung+during+pulmonary+exacerbations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fluctuations in phenotypes and genotypes within populations of Pseudomonas aeruginosa in the cystic fibrosis lung during pulmonary exacerbations.</a> J. Med. Microbiol. 59, 472-481 (2010).</li>
<li>Fouhy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusible+signal+factor-dependent+cell-cell+signaling+and+virulence+in+the+nosocomial+pathogen+Stenotrophomonas+maltophilia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Diffusible signal factor-dependent cell-cell signaling and virulence in the nosocomial pathogen Stenotrophomonas maltophilia.</a> J. Bacteriol. 189, 4964-4968 (2007).</li>
<li>Winstanley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+introduced+genomic+prophage+islands+are+critical+determinants+of+in+vivo+competitiveness+in+the+Liverpool+Epidemic+Strain+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Newly introduced genomic prophage islands are critical determinants of in vivo competitiveness in the Liverpool Epidemic Strain of Pseudomonas aeruginosa.</a> Genome Res. 19, 12-23 (2009).</li>
<li>Carter, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subtype+of+a+Pseudomonas+aeruginosa+cystic+fibrosis+epidemic+strain+exhibits+enhanced+virulence+in+a+murine+model+of+acute+respiratory+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">A subtype of a Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis epidemic strain exhibits enhanced virulence in a murine model of acute respiratory infection.</a> J. Infect. Dis. 202, 935-942 (2010).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

En este estudio se utilizó un novedoso modelo in vitro sobre la base de ASM para replicar P. condiciones aeruginosa biofilm en el pulmón de la FQ 4. El modelo se ha modificado correctamente a pequeña escala, de alto rendimiento de las pruebas de los agentes antimicrobianos. Los pasos críticos de este ensayo son: <ol><li> La preparación consistente de los medios de comunicación ASM y el mantenimiento de la esterilidad. Se ha dedicado largas horas para optimizar la forma en que se añade cada componente para obtener resultados reproducibles en todo momento. La filtración de la ASM es lento, pero es preferible a tratamiento en autoclave, lo cual puede dañar el componente de mucina. No recomendamos la adición de antibióticos, según lo sugerido por otros 11, porque esto puede imponer considerables presiones selectivas, las mutaciones de unidad, inducir la lisis profago 16 y altera significativamente la expresión de múltiples genes bacterianos. </li><li> El ensayo debe ser optimizado en función del volumen de Of ASM utilizado. Velocidades de agitación se aumentó para los pequeños volúmenes y un biofilm más corto ciclo de vida se observa. </li></ol> Una aplicación obvia del modelo de biofilm a pequeña escala ASM es la determinación más realista de las susceptibilidades a los antimicrobianos (biofilm BSMIC 90). Nichos anaeróbicos y microaerófilos están presentes en el pulmón CF y existe evidencia de que el oxígeno se limita profundamente dentro maduro biopelículas 2, 17. Aquí demostramos que el 10/14 P. clínica aeruginosa aisladas de pacientes con FQ presentan una considerable esputos (4 - ≥ 128 veces) disminución de la sensibilidad a la tobramicina en condiciones de microaerofilia en ASM. Los resultados de este estudio sugieren que los antibióticos, como la tobramicina, podría ser menos eficaz frente a P. infecciones aeruginosa en el pulmón con FQ que los indicados por los métodos convencionales de las pruebas de sensibilidad. Estos resultados reflejan los estudios previos sobre la susceptibilidad antimicrobiana de las biopelículas 10. Pequeñaescala de ensayos ASM por lo tanto ofrecer una plataforma sencilla de alto rendimiento para generar datos significativos de sensibilidad a los antibióticos para informar mejor a las decisiones terapéuticas. El ensayo se limita en la misma forma que las pruebas convencionales de susceptibilidad a los antibióticos en que las colonias individuales se recogen para la detección de que puede no ser representativa de toda la población. Sin embargo, creemos que un enfoque (i) que no se usen de la superficie del crecimiento del biofilm adjunto y (ii) aplicable a las condiciones de microaerofilia, representa una alternativa clara y una mejora potencial de los métodos existentes. Llegamos a la conclusión de que este ensayo es un modelo adecuado para estudiar P. poblaciones aeruginosa biofilm. La prueba adicional en el ámbito clínico que se dilucide si la susceptibilidad a antibióticos sobre la base de biofilm crecido P. aeruginosa podría dar lugar a diferentes opciones de antibióticos con potencial mejora de los resultados microbiológicos y clínicos. Investigaciones similares que utilizan los modelos clásicos de biofilm han demostrado que los valores BSMIC conducirdiferentes a las recomendaciones para el tratamiento con antibióticos 5,17. Además de las pruebas para la efectividad de los agentes anti-infecciosos, el sistema ASM representa una alternativa barata, simple y reproducible a los modelos animales para estudios tales como los destinados a la comprensión de la diversificación de la P. poblaciones aeruginosa. Hemos observado amplia heterogeneidad en las poblaciones naturales de P. aeruginosa recuperado de pacientes con CF esputos 18, 19. La diversificación fenotípica y genotípica similar se puede observar durante el crecimiento en ASM 4 (y nuestros datos no publicados), por lo que es un atractivo modelo in vitro de las enfermedades de los pulmones CF. La relativa simplicidad del modelo ASM facilita el diseño de experimentos a largo plazo de adaptación destinados, por ejemplo, en el seguimiento de los efectos de los antibióticos u otros estreses de la P. aeruginosa divergencia de la población. Además, otros patógenos bacterianos se puede cultivar enASM. Por ejemplo, Fouhy et al. 2007 han utilizado ASM para estudiar la formación del biofilm de S. maltophillia 20.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> ADN de esperma de pescado </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 74782 </td></tr><tr><td> La mucina del estómago porcino tipo II </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2378 </td></tr><tr><td> L-Alanina </td><td> Acros Organics </td><td> 102830250 </td></tr><tr><td> L-Arginina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5006 </td></tr><tr><td> L (+)-asparagina monohidrato </td><td> Acros Organics </td><td> 175271000 </td></tr><tr><td> L (+)-aspártico ácido </td><td> Acros Organics </td><td> 105041000 </td></tr><tr><td> L-cisteína </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 168149 </td></tr&gt; <tr><td> L (+)-ácido glutámico </td><td> Acros Organics </td><td> 156211000 </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G3126 </td></tr><tr><td> Glicina </td><td> Acros Organics </td><td> 220911000 </td></tr><tr><td> L-histidina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H8000 </td></tr><tr><td> L-isoleucina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I2752 </td></tr><tr><td> L-leucina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L8000 </td></tr><tr><td> L (+)-lisina monohidrocloruro </td><td> Acros Organics </td><td> 125222500 </td></tr><tr><td> L-Metionina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M9625 </td></tr><tr><td> L-fenilalanina </td><td> Acros Organics </td><td> 130310250 </td></tr><tr><td> L-prolina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0380 </td></tr><tr><td> L-serina </td><td> Acros Organics </td><td> 132660250 </td></tr><tr><td> L-treonina </td><td> Acros Organics </td><td> 138930250 </td></tr><tr><td> L (-)-triptófano </td><td> Acros Organics </td><td> 140590250 </td></tr><tr><td> L-Tirosina </td><td> Acros Organics </td><td> 140641000 </td></tr><tr><td> L-valina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> V0500 </td></tr><tr><td> Ácido dietilentriaminopentaacético </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 32318 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> S/3160/60 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> BDH </td><td> BDH0258 </td></tr><tr><td&gt; KOH </td><td> BDH </td><td> BDH0262 </td></tr><tr><td> La yema de huevo de emulsión </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 17148 </td></tr><tr><td> ME 2 bomba de vacío de diafragma </td><td> Vacuubrand </td><td> 696126 </td></tr><tr><td> Steritop filtros (tamaño de poro: 0,22 m, el tamaño del cuello: 45 mm) </td><td> Millipore </td><td> SCGPT10RE </td></tr><tr><td> Medio Luria-Bertani </td><td> Sigma </td><td> L2897 </td></tr><tr><td> Placas de 96 pocillos de microtitulación </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1581 </td></tr><tr><td> De 24 pocillos de cultivo de tejidos tratados con placas </td><td> Iwaki </td><td> 3820-024 </td></tr><tr><td> CampyGen paquetes de generación de gas </td><td> Oxoid </td><td> CN0025 </td></tr><tr><td> Cámara de microaerofílico </td><td> Oxoid </td><td> HP0011 </td></tr><tr><td> Tobramicina sulfato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T1783 </td></tr><tr><td> Celulasa, de Aspergillus niger </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 22178 </td></tr><tr><td> Resazurina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 199303 </td></tr><tr><td> Citrate.H 2 0 </td><td> BDH </td><td> BDH0288 </td></tr><tr><td> Fluostar omega lector de microplacas </td><td> BMG-Labtech </td><td> SPECTROstar Omega </td></tr></tbody></table>

uso de un medio artificial de esputo para probar la eficacia de antibióticos contra la<em&gt; pseudomonas aeruginosa</em&gt; en condiciones más pertinentes a la fibrosis quística pulmonar

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Existe una preocupación creciente acerca de la pertinencia de las pruebas in vitro sensibilidad a los antimicrobianos cuando se aplica a los aislamientos de P. aeruginosa en la fibrosis quística (FQ). Los métodos existentes se basan en una sola o unas pocas cepas cultivadas aeróbicamente y planktonically. Predeterminados valores de corte se utilizan para definir si las bacterias son sensibles o resistentes a cualquier antibiótico que se administra 1. Sin embargo, durante las infecciones crónicas de los pulmones en pacientes con FQ, P. poblaciones aeruginosa existen en biopelículas y existe evidencia de que el medio ambiente es en gran parte microaerofílico 2. La gran diferencia en las condiciones entre las bacterias en el pulmón y los que durante las pruebas de diagnóstico ha puesto en duda la pertinencia fiabilidad e incluso una de estas 3 pruebas. Medio artificial de esputo (ASM) es un medio de cultivo que contiene los componentes de esputo de pacientes con FQ, incluyendo aminoácidos y el ADN, la mucina libre. P. aeruginosa &lt;/ Em&gt; crecimiento en el crecimiento de imitadores ASM durante las infecciones CF, con la formación de estructuras de auto-agregación de biofilm y la divergencia de la población 4,5,6. El objetivo de este estudio fue desarrollar un ensayo de microtitulación de placa para estudiar la susceptibilidad antimicrobiana de P. aeruginosa basado en el crecimiento en ASM, que es aplicable a ambas condiciones microaerófilas y aeróbica. Un ensayo ASM se desarrolló en un formato de placa de microtitulación. P biopelículas aeruginosa se ​​dejaron desarrollar durante 3 días antes de la incubación con los agentes antimicrobianos a diferentes concentraciones durante 24 horas. Después de la interrupción del biofilm, la viabilidad celular se midió mediante la tinción con resazurina. Este ensayo se utilizó para determinar la concentración de células mínima inhibitoria sésiles (SMIC) de tobramicina por 15 diferentes P. aeruginosa bajo condiciones aeróbicas y microaerófilos y valores SMIC se compararon con los obtenidos con el crecimiento caldo estándar. Si bien no fuealguna evidencia de aumento de los valores de CIM para aislamientos cultivados en ASM, en comparación con sus homólogos planctónicas, las mayores diferencias se encontraron con las bacterias ensayadas en condiciones de microaerofilia, que mostraron una resistencia mucho mayor, hasta un&gt; 128 veces, hacia la tobramicina en el sistema de ASM, cuando en comparación con los ensayos llevados a cabo en condiciones aerobias. La falta de asociación entre los actuales métodos de ensayo de la susceptibilidad y la evolución clínica ha puesto en duda la validez de los métodos actuales 3. Varios modelos in vitro se han utilizado previamente para estudiar P. biopelículas aeruginosa 7, 8. Sin embargo, estos métodos se basan en las biopelículas superficie adjuntos, mientras que las biopelículas ASM se asemejan a los observados en el pulmón CF 9. Además, la concentración de oxígeno reducida en el moco se ha demostrado que altera el comportamiento de P. aeruginosa 2 y afectar a la susceptibilidad antibiótica 10. Por lo tanto using ASM en condiciones de microaerofilia puede proporcionar un entorno más realista en el que el estudio de susceptibilidad antimicrobiana.

Las pruebas de diagnóstico actual sensibilidad a los antimicrobianos se basa en el crecimiento de plancton de las cepas en condiciones de nutrientes ricos y aeróbicas. En este caso, contamos con un medio alternativo de esputo artificiales para estudiar la susceptibilidad antimicrobiana de las biopelículas de Pseudomonas aeruginosa, tanto en condiciones aeróbicas y microaerófilos más representativos de la fibrosis quística pulmonar.

Uso de un medio artificial de esputo para probar la eficacia de antibióticos contra la<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; En condiciones más pertinentes a la fibrosis quística pulmonar

Existe una creciente preocupación sobre la relevancia de las pruebas de susceptibilidad antimicrobial in vitro cuando se aplican a aislados de P. aeruginosa provenientes de quística...

El objetivo de este experimento es evaluar la eficacia de los antibióticos contra los biofilms de Pseudomonas aeruginosa en condiciones representativas de infecciones crónicas en el pulmón de pacientes con fibrosis quística, utilizando un medio de esputo artificial definido. Los biofilms bacterianos se cultivan en placas de microtitulación de 24 pocillos.A continuación, los biopelículas se exponen a antibióticos. Luego, los cultivos tratados con antibióticos se desintegran utilizando celulasa e incuban con un colorante metabólico srin, que es reducido de azul a rosa por células viables. Al medir la absorbancia de las pocilas, se puede determinar la concentración mínima inhibitoria de células de biopelícula B-S-M-I-C para cuantificar la susceptibilidad a antibióticos bajo condiciones cercanas a las fisiológicas.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la determinación de las concentraciones mínimas inhibitorias basadas en cultivos planctónicos, es que las bacterias crecen en un medio especializado que contiene todos los componentes del esputo, promoviendo así la formación de biopelículas. Estas biopelículas son mucho más resistentes a los antibióticos. Para preparar el medio, primero prepare dos frascos que contengan 250 mililitros de agua estéril en el primer frasco.Agregue gradualmente la agitación y luego añada cuatro gramos de esperma de pez, ADN, a 250 mililitros de agua estéril. Agite la solución a temperatura ambiente y permita que el ADN se disuelva en el segundo frasco. Añada gradualmente cinco gramos de mucina tipo dos procedente del estómago porcino y agite.Una vez que las soluciones de ADN y mucina estén listas, disuelva los aminoácidos en 100 mililitros de agua estéril, con la excepción de la L-tirosina y la L-cisteína, que deben disolverse en 25 mililitros de agua o en 25 mililitros de hidróxido de potasio 0,5 molar, respectivamente. A continuación, disuelva 5,9 miligramos de DTPA, cinco gramos de cloruro de sodio y 2,2 gramos de cloruro de potasio en 100 mililitros de agua. Combine todas las soluciones diferentes en un frasco de un litro, luego añada cinco mililitros de emulsión de yema de huevo y complete la mezcla hasta 850 mililitros con agua.Utilizando triss molar, ajuste el pH a 6,9 y complete el volumen final hasta un litro con agua. Para esterilizar el medio, filtre mediante una bomba de vacío marca ME dos con membrana de vacío y una unidad de filtro Millipore Stereo Top con cuello de 45 milímetros y tamaño de poro de 0,2 micrones. El proceso de filtración puede realizarse durante dos días. El medio A SM se puede almacenar a cuatro grados Celsius durante hasta un mes.Comience diluyendo cultivos de pseudomona arosa de cultivo nocturno en medio LB para obtener una DO de 0.05. Luego, diluya aún más las bacterias en una proporción de uno a 100 en una placa con medio SM, agregando 1,8 mililitros por pocillo de cultivo bacteriano diluido en 21 pocillos de una placa de cultivo celular de 24 pocillos; alícuote el mismo volumen de medio SM en los tres pocillos restantes, que servirán como controles negativos en blanco. Selle la placa de 24 pocillos con biofilm y, para permitir la formación de biofilms, colóquela bajo condiciones microaerófilas, las cuales pueden obtenerse utilizando paquetes generadores de gas CampyGen en frascos anaeróbicos grandes.Incubar el cultivo en un agitador ajustado a 75 RPM durante tres días a 37 grados Celsius. Después de tres días, las biopelículas aparecerán como una masa gelatinosa que contiene células bacterianas y no podrán ser interrumpidas mediante pipeteo. Una vez formadas las biopelículas, añadir 200 microlitros por pocillo de antibiótico en concentraciones diluidas seriamente. Asegúrese de preparar al menos cuatro réplicas para cada concentración del fármaco a probar y dejar cuatro pocillos con biopelículas sin tratar para que puedan utilizarse como controles negativos.Luego incubar las placas previamente durante 24 horas adicionales tras la incubación con antibióticos. Utilizar 100 microlitros por pocillo de celulasa diluida a 100 miligramos por mililitro en tampón citrato para descomponer los biopelículas, incubar las placas en un agitador ajustado a 150 RPM bajo condiciones aeróbicas a 37 grados Celsius durante una hora. Tras esta incubación, puede utilizarse pipeteo manual para desagregar aún más los biopelículas si se observan grumos de células en el medio.A continuación, agregue 100 microlitros de rezina por pocillo para cuantificar la viabilidad de las células liberadas de los biofilms e incube las células durante una a dos horas. A 37 grados Celsius, solo las células viables son capaces de metabolizar el colorante azul zarin a su forma fluorescente rosa. Tras la incubación, transfiera las muestras a una placa de 96 pocillos y mida la fluorescencia de los pocillos utilizando una longitud de onda de excitación de 540 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 590 nanómetros.Con el fin de cuantificar la viabilidad bacteriana y la susceptibilidad a fármacos, primero reste la fluorescencia de fondo del control en blanco de las demás pocillos. A continuación, calcule el porcentaje de inhibición dividiendo la fluorescencia media de cada concentración por la fluorescencia media de los controles no tratados y multiplicando por 100. La B-S-M-Y-C se define como la concentración de antibiótico que causa una inhibición del 90 % de la actividad metabólica, como se muestra en estas micrografías electrónicas: las células cultivadas en biopelículas difieren considerablemente de las bacterias cultivadas en cultivos planctónicos.En particular, grandes cantidades de matriz extracelular mostradas en amarillo rodean a las células en el biofilm en verde, pero no en colonias planctónicas. Además, las bacterias en biofilms suelen ser más resistentes a los antibióticos en este experimento. La concentración mínima inhibitoria de tobramicina para el cultivo planctónico de Pseudomonas aeruginosa en azul se determinó que era aproximadamente de cuatro microgramos por mililitro.En contraste, como se muestra en rojo, el 100 % de las bacterias en biopelículas sobrevivió hasta 512 microgramos por mililitro de antibiótico. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cultivar bacterias en un medio artificial definido de esputo. También debería ser capaz de realizar una prueba de susceptibilidad a antibióticos para determinar la concentración inhibitoria mínima necesaria para inhibir el crecimiento bacteriano en un entorno más realista del pulmón de pacientes con fibrosis quística.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Fuente: Vieira, J., et al. Diseño y desarrollo de un modelo para estudiar el efecto del oxígeno suplementario en el microbioma de las vías respiratorias de la fibrosis quística.  J. Vis. Exp. (2021).Este video demuestra la preparación de un medio de esputo artificial que imita la viscosidad, la composición de nutrientes y el pH del esputo pulmonar de fibrosis quística. El medio resultante proporciona una plataforma fisiológicamente relevante para estudios ex vivo.

Preparación de medio de esputo artificial para emular la fibrosis quística Esputo pulmonar ex vivo

Source: Jackson, L., et al. Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the in situ visualization of Pseudomonas aeruginosa within chemically cleared cystic fibrosis sputum using fluorescent labeling and confocal microscopy to reveal bacterial localization and biofilm structure.

Visualization of Pseudomonas aeruginosa in Sputum Samples from Cystic Fibrosis Patients

El moco enchufado vías respiratorias de la fibrosis quística (FQ) son un ambiente ideal para los patógenos microbianos para prosperar. El manuscrito describe un nuevo método para el estudio de la microbioma CF pulmón en un entorno que imita donde causan enfermedad y cómo alteraciones de condiciones químicas pueden conducir dinámica microbianas.

El modelo de WinCF - un microcosmos barato y tractable de un bronquio enchufado del moco para estudiar la microbiología de las infecciones pulmonares

Describimos un protocolo para un modelo de co-cultivo tridimensional de vías respiratorias infectadas, utilizando CFBE41o- células, macrófagos THP-1, y Pseudomonas aeruginosa, establecido en la interfaz aire-líquido. Este modelo proporciona una nueva plataforma para probar simultáneamente la eficacia de los antibióticos, la función de barrera epitelial y los marcadores inflamatorios.

P. aeruginosa Co-cultivo 3D infectado de células epiteliales bronquiales y macrófagos en la interfaz aire-líquido para la evaluación preclínica de los antiinfecciosos

Este protocolo proporciona métodos para la visualización de células bacterianas y polisacáridos del locus de síntesis de polisacáridos (Psl) dentro del esputo de pacientes con fibrosis quística.

Visualización de Pseudomonas aeruginosa en el esputo de pacientes con fibrosis quística

Este flujo de trabajo se puede utilizar para realizar pruebas de susceptibilidad a los antibióticos utilizando un modelo ex vivo establecido de biopelícula bacteriana en los pulmones de individuos con fibrosis quística. El uso de este modelo podría mejorar la validez clínica de los ensayos de MBEC (concentración mínima de erradicación de biopelículas).

Pruebas de Eficacia De Antibióticos En Un Modelo Ex vivo De Pseudomonas aeruginosa Y Biopelículas De Staphylococcus aureus En El Pulmón De Fibrosis Quística

El medio de esputo sintético para fibrosis quística (SCFM2) se puede utilizar en combinación con microscopía de barrido láser confocal y clasificación celular activada por fluorescencia para observar agregados bacterianos a alta resolución. Este documento detalla los métodos para evaluar las poblaciones agregadas durante el tratamiento antimicrobiano como plataforma para futuros estudios.

Herramientas para la evaluación en tiempo real de un modelo de infección por Pseudomonas aeruginosa

El objetivo de este protocolo es desarrollar un sistema modelo para el efecto de la hiperoxia en las comunidades microbianas de las vías respiratorias de la fibrosis quística.  El medio de esputo artificial emula la composición del esputo, y las condiciones de cultivo hiperóxico modelan los efectos del oxígeno suplementario en las comunidades microbianas pulmonares.

Diseño y desarrollo de un modelo para estudiar el efecto del oxígeno suplementario en el microbioma de las vías respiratorias de la fibrosis quística

Este protocolo describe un modelo de biopelícula polimicrobiana de cuatro especies relevante para los pulmones con fibrosis quística (FQ) que se puede utilizar para explorar el impacto de las interacciones bacterianas entre especies.

Cultivo de una biopelícula polimicrobiana relevante para la fibrosis quística para sondear los fenotipos de la comunidad

Esta metodología permite el establecimiento de un modelo de biofilm polimicrobiano en fibrosis quística para pruebas de sensibilidad antimicrobiana en laboratorios clínicos y de investigación. Este modelo proporciona resultados precisos y fiables en una amplia gama de salidas.

Desarrollo de un modelo de biofilm de colonias polimicrobianas para probar antimicrobianos en la fibrosis quística

Este estudio describe un marco para desarrollar un modelo de biopelícula polimicrobiana agregada y optimizar un protocolo de extracción de ARN para evaluar la expresión génica de Pseudomonas aeruginosa que refleja el entorno pulmonar de la fibrosis quística. Las aplicaciones incluyen la evaluación de los efectos antimicrobianos y el estudio de alternativas a los antibióticos en condiciones relevantes para la fibrosis quística.

Modelo de biopelícula agregada de fibrosis quística para estudiar la expresión génica relevante para la infección

Aprende a evaluar la eficacia de antibióticos contra biofilms de Pseudomonas aeruginosa utilizando un medio artificial de esputo que simula condiciones pulmonares de fibrosis quística. Este método permite determinar la concentración inhibitoria mínima en condiciones fisiológicas realistas.

Uso de un medio artificial de esputo para probar la eficacia de antibióticos contra la Pseudomonas aeruginosa En condiciones más pertinentes a la fibrosis quística pulmonar (Video) | JoVE Journal

Uso de un medio artificial de esputo para probar la eficacia de antibióticos contra la

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