Uso de un medio artificial de esputo para probar la eficacia de antibióticos contra la

El objetivo de este experimento es evaluar la eficacia de los antibióticos contra los biofilms de Pseudomonas aeruginosa en condiciones representativas de infecciones crónicas en el pulmón de pacientes con fibrosis quística, utilizando un medio de esputo artificial definido. Los biofilms bacterianos se cultivan en placas de microtitulación de 24 pocillos.

A continuación, los biopelículas se exponen a antibióticos. Luego, los cultivos tratados con antibióticos se desintegran utilizando celulasa e incuban con un colorante metabólico srin, que es reducido de azul a rosa por células viables. Al medir la absorbancia de las pocilas, se puede determinar la concentración mínima inhibitoria de células de biopelícula B-S-M-I-C para cuantificar la susceptibilidad a antibióticos bajo condiciones cercanas a las fisiológicas.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la determinación de las concentraciones mínimas inhibitorias basadas en cultivos planctónicos, es que las bacterias crecen en un medio especializado que contiene todos los componentes del esputo, promoviendo así la formación de biopelículas. Estas biopelículas son mucho más resistentes a los antibióticos. Para preparar el medio, primero prepare dos frascos que contengan 250 mililitros de agua estéril en el primer frasco.

Agregue gradualmente la agitación y luego añada cuatro gramos de esperma de pez, ADN, a 250 mililitros de agua estéril. Agite la solución a temperatura ambiente y permita que el ADN se disuelva en el segundo frasco. Añada gradualmente cinco gramos de mucina tipo dos procedente del estómago porcino y agite.

Una vez que las soluciones de ADN y mucina estén listas, disuelva los aminoácidos en 100 mililitros de agua estéril, con la excepción de la L-tirosina y la L-cisteína, que deben disolverse en 25 mililitros de agua o en 25 mililitros de hidróxido de potasio 0,5 molar, respectivamente. A continuación, disuelva 5,9 miligramos de DTPA, cinco gramos de cloruro de sodio y 2,2 gramos de cloruro de potasio en 100 mililitros de agua. Combine todas las soluciones diferentes en un frasco de un litro, luego añada cinco mililitros de emulsión de yema de huevo y complete la mezcla hasta 850 mililitros con agua.

Utilizando triss molar, ajuste el pH a 6,9 y complete el volumen final hasta un litro con agua. Para esterilizar el medio, filtre mediante una bomba de vacío marca ME dos con membrana de vacío y una unidad de filtro Millipore Stereo Top con cuello de 45 milímetros y tamaño de poro de 0,2 micrones. El proceso de filtración puede realizarse durante dos días. El medio A SM se puede almacenar a cuatro grados Celsius durante hasta un mes.

Comience diluyendo cultivos de pseudomona arosa de cultivo nocturno en medio LB para obtener una DO de 0.05. Luego, diluya aún más las bacterias en una proporción de uno a 100 en una placa con medio SM, agregando 1,8 mililitros por pocillo de cultivo bacteriano diluido en 21 pocillos de una placa de cultivo celular de 24 pocillos; alícuote el mismo volumen de medio SM en los tres pocillos restantes, que servirán como controles negativos en blanco. Selle la placa de 24 pocillos con biofilm y, para permitir la formación de biofilms, colóquela bajo condiciones microaerófilas, las cuales pueden obtenerse utilizando paquetes generadores de gas CampyGen en frascos anaeróbicos grandes.

Incubar el cultivo en un agitador ajustado a 75 RPM durante tres días a 37 grados Celsius. Después de tres días, las biopelículas aparecerán como una masa gelatinosa que contiene células bacterianas y no podrán ser interrumpidas mediante pipeteo. Una vez formadas las biopelículas, añadir 200 microlitros por pocillo de antibiótico en concentraciones diluidas seriamente. Asegúrese de preparar al menos cuatro réplicas para cada concentración del fármaco a probar y dejar cuatro pocillos con biopelículas sin tratar para que puedan utilizarse como controles negativos.

Luego incubar las placas previamente durante 24 horas adicionales tras la incubación con antibióticos. Utilizar 100 microlitros por pocillo de celulasa diluida a 100 miligramos por mililitro en tampón citrato para descomponer los biopelículas, incubar las placas en un agitador ajustado a 150 RPM bajo condiciones aeróbicas a 37 grados Celsius durante una hora. Tras esta incubación, puede utilizarse pipeteo manual para desagregar aún más los biopelículas si se observan grumos de células en el medio.

A continuación, agregue 100 microlitros de rezina por pocillo para cuantificar la viabilidad de las células liberadas de los biofilms e incube las células durante una a dos horas. A 37 grados Celsius, solo las células viables son capaces de metabolizar el colorante azul zarin a su forma fluorescente rosa. Tras la incubación, transfiera las muestras a una placa de 96 pocillos y mida la fluorescencia de los pocillos utilizando una longitud de onda de excitación de 540 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 590 nanómetros.

Con el fin de cuantificar la viabilidad bacteriana y la susceptibilidad a fármacos, primero reste la fluorescencia de fondo del control en blanco de las demás pocillos. A continuación, calcule el porcentaje de inhibición dividiendo la fluorescencia media de cada concentración por la fluorescencia media de los controles no tratados y multiplicando por 100. La B-S-M-Y-C se define como la concentración de antibiótico que causa una inhibición del 90 % de la actividad metabólica, como se muestra en estas micrografías electrónicas: las células cultivadas en biopelículas difieren considerablemente de las bacterias cultivadas en cultivos planctónicos.

En particular, grandes cantidades de matriz extracelular mostradas en amarillo rodean a las células en el biofilm en verde, pero no en colonias planctónicas. Además, las bacterias en biofilms suelen ser más resistentes a los antibióticos en este experimento. La concentración mínima inhibitoria de tobramicina para el cultivo planctónico de Pseudomonas aeruginosa en azul se determinó que era aproximadamente de cuatro microgramos por mililitro.

En contraste, como se muestra en rojo, el 100 % de las bacterias en biopelículas sobrevivió hasta 512 microgramos por mililitro de antibiótico. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cultivar bacterias en un medio artificial definido de esputo. También debería ser capaz de realizar una prueba de susceptibilidad a antibióticos para determinar la concentración inhibitoria mínima necesaria para inhibir el crecimiento bacteriano en un entorno más realista del pulmón de pacientes con fibrosis quística.