Name: Inducidas Odorante-respuestas registradas de neuronas olfativas del receptor utilizando la técnica de aspiración con una pipeta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Aprende a registrar respuestas a odorantes en neuronas olfativas del receptor de ratón mediante la técnica de pipeta de succión. Este método permite capturar corrientes receptoras y potenciales de acción simultáneamente.

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Este trabajo fue apoyado por el NIH DC009613, el Programa de Fronteras Humanas Ciencias y Morley Care Fellowship (JR).

1. La configuración de grabación La cámara de registro está montado en un microscopio Nikon Eclipse TE2000U invertida con óptica de contraste de fase que está montado sobre una mesa neumática y eléctricamente blindado usando una jaula de Faraday. La cámara de grabación de Plexiglás consta de dos secciones separadas parcialmente por una barrera y pegado sobre un portaobjetos de vidrio silanizado. Una sección de la cámara se utiliza para liquidar las células, mientras que el otro se utiliza para el estímulo de la exposición durante la grabación para reducir al mínimo la exposición prematura de reiterada pero aún no utilizados a células odorante. La configuración de grabación consta de una pipeta de aspiración (ver más abajo) montado en un soporte de pipetas sedimentaron y un electrodo de tierra. La pipeta de succión se coloca utilizando un micromanipulador. Soluciones de estímulo se aplican usando un tubo de vidrio de triple cañón cuadrado, con cada tubo cuadrado siendo 0,7 mm x 0,7 mm. El cristal de triple cañón estaba conectado a un sistema de perfusión motorizado rápido a paso montado en un manipulador (Sutter SF-77B, Instrumentos Warner) y entró en la cámara de registro a un ángulo de ~ 45 °. El final de la copa barril triple fue biselado a un ángulo de 45 ° de nuevo tal que la cara final (abertura) del cristal de triple barril era vertical para permitir la colocación cerca de la pipeta. El electrodo de pipeta de succión llena con solución de Ringer de mamíferos estándar y el electrodo de tierra están conectados a la headstage GΩ 1 de un amplificador de patch clamp (PC-501A, Warner Instruments) en el modo de fijación de voltaje. La señal analógica procedente del amplificador (filtrada paso bajo a 5 kHz) se visualiza en un osciloscopio digital para monitorizar la señal en tiempo real y también conectado a un filtro de Bessel 8-polo (Krohn-Hite) donde la señal es filtrada en paso bajo a 50 Hz. Ambas señales (filtrado de paso bajo a 5 kHz Hz 50) se introducen en un convertidor A / D (Cambridge Electronic Design Micro mkII 1401) que está conectado a un PC para la adquisición de datos. Los datos se registran utilizando Signal 3 acquisition software (Cambridge Electronic Design) a una frecuencia de muestreo de 10 kHz. La señal se registra en las dos diferentes anchos de banda para grabar primero el receptor actual junto con los potenciales de acción superpuestas y, a continuación el receptor actual solo (véase la fig. 2). El sistema de perfusión se usa para cambiar rápidamente entre Ringer (control) y solución estímulos odorantes o cualquier solución de composición deseada y es controlado por el PC y la señal 3 software. Las soluciones están contenidos en 60 ml jeringas y la tasa de flujo es controlado por grado médico reguladores de flujo por vía intravenosa. Típicamente, el caudal se fija a 1 ml / min. La succión en la pipeta de grabación se controla de la siguiente manera: El puerto lateral del soporte de pipeta está conectado a una línea de aceite que a su vez está conectado a un depósito de aceite regulable en altura. Elevando o bajando el depósito asegura que la presión de pipeta y por lo tanto el flujo de Ringer a través de la punta de la pipette es mínimo y ligeramente positivo. De succión adicional o se puede aplicar presión a través de un tubo conectado al espacio aéreo del depósito con una boquilla en el otro extremo a chupar el cuerpo celular de una ORN aislado en la punta de la pipeta de grabación. Los experimentos se realizaron a 37 ° C con el fin de simular con frecuencia el estado nativo fisiológico de la célula. La temperatura se controla haciendo pasar las soluciones a través de una unidad de calentamiento a medida que consta de resistores de cerámica a través de tubos de acero inoxidable que contienen las soluciones se pasan 10. La temperatura se controla usando un termómetro de termopar (Fluke). 2. Soluciones La solución de Ringer de mamíferos (mM): 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl 2, 2 CaCl 2, 0,01 EDTA, 10 HEPES, 10 glucosa. El pH se ajustó a 7,5 con NaOH. Un 10% diluida de solución de Ringer se utilizó para medir la unión actual. Odorasoluciones nt: acetofenona y eugenol se prepararon diariamente en solución de Ringer de 20 mM de existencias de DMSO. 3. Haciendo Electrodos <ol><li> Coloque un vidrio borosilicato unfilamented capilar en un Sutter P-97 extractor de micropipeta y tirar de una micropipeta con un cono largo. </li><li> Transferir la pipeta en un soporte micropipeta a medida montada en un microscopio Nikon Eclipse E200, que es a su vez equipado con una retícula en el ocular y una cuchilla móvil diamante montado en el escenario. </li><li> Observe que la punta de la pipeta al objetivo de 20x y utilizando la retícula como guía; suavemente escriba la pipeta en un ángulo de 90 ° con la cuchilla de diamante a medida que la pipeta es de 10 micras de ancho (diámetro externo). </li><li> Mueva la cuchilla de diamante más hacia la punta y gradualmente aplique presión en la punta de la cuchilla de diamante. La punta de la pipeta debe romper limpiamente en el punto en que se describe. </li></ol> Alternativamente los pasos 3.1 a3,4 se pueden combinar y pipetas se puede tirar con dimensiones deseadas directamente sin tener que cortar la punta de la pipeta, aunque puede resultar más difícil tirar de forma fiable pipetas con una punta de diámetro grande y los bordes de corte limpio. <ol start="5"><li> Bajo un objetivo de 40x, disparar pulir la punta de la pipeta a un diámetro interior de 5 micras utilizando un filamento calentado eléctricamente. Una vez terminado, la micropipeta está listo para ser utilizado para corrientes de grabación desde ORNs ratón. La resistencia abierta pipeta debe estar alrededor de 1 MW cuando se llena de colores. </li></ol> 4. El aislamiento de las neuronas olfativas del receptor <ol><li> Sacrificar un ratón siguiendo las directrices institucionales y normativas. Retire la cabeza, retire la piel que recubre el cráneo y la cabeza medial bisecan a lo largo de la línea media. </li><li> Coloque los dos hemi-cabezas bajo un estereomicroscopio de disección, quitar el tabique nasal y eliminar los cornetes olfativos. Colocar todo el tejido en una placa de Petri con c glucosaontaining solución Ringer mamíferos. </li><li> Pelar el epitelio olfativo del cartílago subyacente a partir de dos cornetes y transferir el tejido en un tubo Eppendorf que contiene 250 l de Ringer. Utilizamos tejidos de 2 cornetes para conseguir la densidad adecuada de las células para el tamaño de nuestra cámara de grabación. Almacenar el tejido restante a 4 º C para su uso posterior. </li><li> Vortex el tubo Eppendorf que contiene el epitelio olfativo brevemente dos veces durante 1 seg a velocidad media. Esta etapa conduce a la disociación mecánica de los ORNs del epitelio. </li><li> Colocar la solución de Ringer que contenía los ORNs disociadas en la cámara de registro. Eliminar piezas grandes de tejido también presentes en la suspensión utilizando unas pinzas finas. </li><li> Deje que los ORNs conformarse con 20 minutos antes de comenzar superfusión continuo con Ringer y proceder a las grabaciones. </li></ol> 5. Grabaciones <ol><li> Bajar el electrodo de succión conectado a la línea de aceite en la cámara de registro y regulcomió la altura del depósito de aceite para establecer presión ligeramente positiva en la punta de la pipeta. Esto se puede hacer mediante la observación de los restos celulares por ejemplo, alejándose de (presión positiva) o hacia (presión negativa) de la pipeta. Trate de no contaminar la punta de la pipeta con restos celulares. </li><li> Escanear la cámara de registro para una ORN aislado que puede ser reconocido por su morfología bipolar típica usando una magnificación de 20-40x. Mueva el electrodo de registro en la proximidad del cuerpo celular ORN. Empiezan a chupar suavemente de modo que el cuerpo de la célula entra en la punta de la pipeta. Cuidadosa y lentamente continuar para aplicar succión hasta que el cuerpo de la célula entera se introduce en la punta de la pipeta de aspiración, dejando la dendrita y los cilios expuesto a la solución del baño. Para imágenes de ORNs aspirado y formas de pipeta ver 7,11. Asegúrese de que una vez que no se aplica la succión, la ORN no se mueve dentro o fuera de la pipeta. Si es así, ajustar la altura del depósito de aceite en consecuencia. </li><li> Uso de lamicromanipuladores, mover la pipeta de aspiración de la sección que contiene las ORNs asentadas a la sección de grabación de la cámara. Colocar con cuidado la pipeta de aspiración en la parte delantera de tubo 3-cañón para el intercambio de solución. La pipeta de succión debe estar colocado lo suficientemente cerca de la abertura del tubo 3-cañón de manera que el ORN se expone a un flujo laminar evitando así la turbulencia de mezcla y para lograr el intercambio de solución rápida. La solución de intercambio se consigue mediante la intensificación de la interfaz entre corrientes paralelas de solución que fluye a través de la punta de la pipeta de aspiración. El curso temporal de la bolsa de solución es típicamente alrededor de 20 ms, medida a partir de la corriente evocada por unión intensificando la celda entre las soluciones de composición iónica diferente (véase la fig. 2). Soluciones se suministran por gravedad. </li></ol> &lt;clase span = "pdflinebreak"&gt; 6. Los resultados representativos <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3862/3862fig1.jpg"> Figura 1. A) neuronas bipolares del receptor en el bulbo olfatorio. B) transducción de señales en los cilios en última instancia conduce a la excitatorios afluencia actual. La despolarización resultante desencadena la generación del potencial de acción en el cuerpo de la célula. <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3862/3862fig2.jpg"> La Figura 2 muestra la velocidad y la fiabilidad de cambio de solución. Una pipeta se salió de lo normal en 10% Ringer diluida para 100 ms y la corriente resultante de la unión de la concentración de iones de diferente fue registrada. Negro traza es el averabia de 5 intentos, rojo rastrear su SD. El pequeño cambio en SD durante el intercambio solución demuestra la fiabilidad de intercambio solución de ensayo a ensayo y la falta de exceso de ruido en la corriente de solución. <img alt="Figura 3." src="/files/ftp_upload/3862/3862fig3.jpg"> La Figura 3 muestra una respuesta eugenol inducida de un ORN utilizando la técnica de pipeta de succión. La ORN fue expuesto a 100 mM eugenol durante 1 segundo como se indica por la barra por encima de la grabación. En la fig. 3A (negro rastro) la corriente del receptor se filtró en un ancho de banda 0 - 50 Hz para mostrar sólo el receptor de la figura actual.. 3B muestra la misma grabación, ahora filtra en el ancho de banda amplio de 0 - 5000 Hz (curva roja) para visualizar también los potenciales de acción (AP, indicado por flechas). El recuadro muestra la misma traza en una escala de tiempo ampliado para visualizar los puntos de acceso más claramente en la aparición de la respuesta. <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/3862/3862fig4.jpg" files> Dosis Figura 4. Respuesta de la familia de un ORN-eugenol sensible (A). El eugenol se utilizó a concentraciones que variaban de 0,3 mM a 100 mM, la duración del estímulo fue de 1 s y trazas se filtró a 0 - 50 Hz. Un incremento progresivo en la concentración de odorante condujo a una respuesta más grande y más rápido, que también se termina una vez más lentamente exposición odorante se terminó. ORNs puede mostrar un patrón de respuesta oscilatoria durante estimulaciones largas en concentraciones odorantes intermedios (Fig. 4B). Aquí un acetephenone (3 M) ORN sensible fue estimulado durante 8 segundos. Después de un pico de respuesta rápida y transitoria en el inicio de la estimulación de una serie de pequeñas respuestas recurrentes se observan. El ancho de banda de grabación fue de 0 - 50 Hz.

<ol><li>Reisert, J., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on%3A+Information+and+coding+in+mammalian+sensory+physiology%3A+Response+kinetics+of+olfactory+receptor+neurons+and+the+implications+in+olfactory+coding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Perspectives on: Information and coding in mammalian sensory physiology: Response kinetics of olfactory receptor neurons and the implications in olfactory coding.</a> J. Gen. Physiol. 138, 303-310 (2011).</li>
<li>Kaupp, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+signalling+in+vertebrates+and+insects%3A+differences+and+commonalities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Olfactory signalling in vertebrates and insects: differences and commonalities.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 188-200 (2010).</li>
<li>Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+pheromones+to+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">From pheromones to behavior.</a> Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).</li>
<li>Kleene, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electrochemical+basis+of+odor+transduction+in+vertebrate+olfactory+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Senses%22%5BJournal%5D)">The electrochemical basis of odor transduction in vertebrate olfactory cilia.</a> Chem. Senses. 33, 839-859 (2008).</li>
<li>Baylor, D. A., Lamb, T. D., Yau, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+retinal+rods+to+single+photons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Responses of retinal rods to single photons.</a> J. Physiol. 288, 613-634 (1979).</li>
<li>Wang, J., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+Suction+Recordings+from+Mouse+Cone+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors.</a> J. Vis. Exp. (35), e1681(2010).</li>
<li>Lowe, G., Gold, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spatial+distributions+of+odorant+sensitivity+and+odorant-induced+currents+in+salamander+olfactory+receptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The spatial distributions of odorant sensitivity and odorant-induced currents in salamander olfactory receptor cells.</a> J. Physiol. 442, 147-168 (1991).</li>
<li>Reisert, J., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2B-dependent+Ca2%2B+extrusion+governs+response+recovery+in+frog+olfactory+receptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Na+-dependent Ca2+ extrusion governs response recovery in frog olfactory receptor cells.</a> J. Gen. Physiol. 112, 529-535 (1998).</li>
<li>Reisert, J., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+the+odour-induced+response+in+frog+olfactory+receptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Adaptation of the odour-induced response in frog olfactory receptor cells.</a> J. Physiol. 519, 801-813 (1999).</li>
<li>Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+compact+modular+flow+heater+for+the+superfusion+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A compact modular flow heater for the superfusion of mammalian cells.</a> J. Physiol. 518P, 13(1999).</li>
<li>Reisert, J., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+recording+of+receptor+current+and+intraciliary+Ca2%2B+concentration+in+salamander+olfactory+receptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous recording of receptor current and intraciliary Ca2+ concentration in salamander olfactory receptor cells.</a> J. Physiol. 535, 637-645 (2001).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

<p class="jove_content"&gt; La técnica de pipeta de succión es un método electrofisiológico que se utiliza para registrar la corriente inducida por el receptor de olor lento y los potenciales de acción rápida bifásicos de un ORN simultáneamente. Puesto que la membrana plasmática de la célula no se rompe, este método deja el medio intracelular no perturbado asegurar que las respuestas de olor no se alteren debido a los cambios de las concentraciones iónicas citoplasmáticas o dilución de factores intracelulares. Las células se pueden grabar desde...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del material </td><td> Tipo </td><td> Empresa </td><td> Catálogo / Número de modelo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Air tabla </td><td> equipo </td><td> Newport </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bomba de aire </td><td> equipo </td><td> Newport </td><td> ACGP </td><td></td></tr><tr><td> Pipetear Puller </td><td> equipo </td><td> Sutter </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Vidrio borosilicato </td><td> equipo </td><td> WPI </td><td> 1B150-4 </td><td></td></tr><tr><td> Nikon Eclipse microscopio invertido </td><td> equipo </td><td> Nikon </td><td> TE2000U </td><td> Equipada con lámpara de Hg, filtro de GFP y objetivos de 20X y 5X al menos </td></tr><tr><td> Amplificador de PC-501A </td><td> equipo </td><td> Warner </td><td> 64-0008 </td><td> Headstage 1 GΩ </td></tr><tr><td> Diamond cuchillo </td><td> Equipo </td><td> Por encargo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Digitalizador Mikro1401 A / D </td><td> equipo </td><td> Cambridge Electronic Design </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Filtrar unidad 3382 </td><td> equipo </td><td> Krohn Hite corporación </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Señal </td><td> software </td><td> Cambridge Electronic Design </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Moldeado de Ag / AgCl Pellet </td><td> equipo </td><td> WPI </td><td> 64-1297 </td><td></td></tr><tr><td> Pipetear titular </td><td> equipo </td><td> Warner </td><td> 64-0997 </td><td> Custom modificado para ajustarse headstage </td></tr><tr><td> Grabación de cámara </td><td> Equipo </td><td> Por encargo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulador MP85-1028 </td><td> equipo </td><td> Sutter Instrument </td><td> Micromanipulador MP85-1028 </td> &lt;td&gt; </td></tr><tr><td> Aceite mineral </td><td> Solución </td><td> Sigma </td><td> 330779-1L </td><td></td></tr><tr><td> Osciloscopio TDS 1001 </td><td> equipo </td><td> Tektronix </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tres de cañón tubo de vidrio cuadrado </td><td> Equipo </td><td> Warner </td><td> 64-0119 </td><td> 0,6 mm ID, 5 cm de largo </td></tr><tr><td> Válvula </td><td> equipo </td><td> La Compañía Lee </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ValveLink 8,2 </td><td> equipo </td><td> Automatizar Científico </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SF-77B perfusión rápido paso </td><td> equipo </td><td> Warner </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

inducidas odorante-respuestas registradas de neuronas olfativas del receptor utilizando la técnica de aspiración con una pipeta

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Animales muestras del medio ambiente oloroso alrededor a través de los sistemas quimiosensoriales situados en la cavidad nasal. Señales Quimiosensoriales afectar los comportamientos complejos, como la elección de alimentos, depredador, conespecíficos y reconocimiento mate y otras señales de relevancia social. Neuronas olfativas del receptor (ORNs) se encuentra en la parte dorsal de la cavidad nasal incrustado en el epitelio olfativo. Estas neuronas bipolares enviar un axón hasta el bulbo olfatorio (ver fig. 1, Reisert y Zhao 1, originalmente publicado en la revista Journal of General Physiology) y extender una sola dendrita epitelial de la frontera desde donde irradian los cilios en el moco que recubre el olfato epitelio. Los cilios contienen la maquinaria de transducción de señales que en última instancia conduce a excitatorios afluencia corriente a través de los canales de transducción ciliar, un nucleótido cíclico-gated canal (CNG) y un Ca 2 +-activado Cl - canal (Fig. 1). El siguiente depolarización desencadena la generación del potencial de acción en el cuerpo de la célula 2-4. En este video se describe el uso de la &quot;técnica de succión pipeta&quot; para grabar olor inducida por las respuestas de ORNs. Este método fue desarrollado originalmente para grabar desde fotorreceptores de los bastones 5 y una variante de este método se puede encontrar en jove.com modificado para grabar desde fotorreceptores de los conos de ratón 6. La técnica de la pipeta de aspiración fue adaptado más adelante para grabar también de ORNs 7,8. Brevemente, tras la disociación del epitelio olfatorio y aislamiento de células, el cuerpo de la célula entera de una ORN es aspirado en la punta de una pipeta de grabación. La dendrita y los cilios del permanecer expuesto a la solución del baño y por lo tanto accesibles a la solución cambia para permitir por ejemplo odorante o aplicación bloqueador farmacológico. En esta configuración, no hay acceso al medio intracelular se gana (sin fijación de voltaje de células enteras) y la tensión intracelular es libre de variar. Todo estoDebe A la grabación simultánea de la corriente del receptor lento que se origina en los cilios y los potenciales de acción rápida disparados por el cuerpo celular 9. La diferencia en la cinética entre estas dos señales que les permite ser separados utilizando diferentes configuraciones de filtro. Esta técnica se puede utilizar en cualquier tipo salvaje o el ratón knockout o de grabación selectiva de ORNs que también expresan GFP para etiquetar subconjuntos específicos de ORNs, por ejemplo, que expresa un receptor determinado olor o canal de iones.

Neuronas olfativas del receptor (ORNs) convertir señales de olor primero en un receptor de corriente que a su vez desencadena los potenciales de acción que se transmiten a las neuronas de segundo orden en el bulbo olfatorio. Aquí se describe la técnica de pipeta de succión de grabar simultáneamente el receptor de odorizantes de la corriente inducida y los potenciales de acción de ORNs ratón.

Inducidas Odorante-respuestas registradas de neuronas olfativas del receptor utilizando la técnica de aspiración con una pipeta

Los animales muestrean el entorno odorífero que los rodea a través de los sistemas quimiosensoriales situados en la cavidad nasal. Las señales quimiosensoriales afectan procesos complejos...

El objetivo general de este procedimiento es registrar las respuestas inducidas por odorantes en neuronas receptoras olfativas de ratón. Esto se logra primero mediante la disección del epitelio olfativo y el aislamiento de las neuronas receptoras olfativas de ratón. El segundo paso consiste en colocar las neuronas receptoras olfativas aisladas en una cámara de registro montada sobre un microscopio invertido.Los micromanipuladores sostienen el electrodo de registro y un cambiador de solución. A continuación, aspire una neurona receptora olfativa identificada hacia la punta de un electrodo de pipeta de succión. El paso final consiste en colocar la pipeta con la célula aspirada en su punta frente a un cambiador de solución para exponer la neurona a odorantes.En última instancia, el método de registro con pipeta de succión se utiliza para investigar la función de las neuronas receptoras olfativas. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como la técnica de bloqueo del voltaje en toda la célula, es que permite largas duraciones de registro con cambios rápidos y precisos de la solución. La demostración visual de este método es fundamental, ya que la forma de la pipeta de registro es importante, y resulta difícil aprender a colocar de manera estable las células del receptáculo en la punta de la pipeta.Comience este procedimiento tirando de una micropipeta con un capilar de vidrio borosilicatado con filamento UNFI en un tirador de micropipetas con una pendiente larga. Luego, transfiera la pipeta a un porta-micropipetas hecho a medida montado en un microscopio invertido. El microscopio tiene un retículo en el ocular y una cuchilla de diamante móvil montada en la platina.A continuación, observe la punta de la pipeta bajo el objetivo de 20 x. Utilice el redle como guía. Trace suavemente la pipeta en un ángulo de 90 grados utilizando el cuchillo de diamante personalizado en el diámetro externo de la pipeta de 10 micrómetros.Mueva el cuchillo de diamante más hacia la punta. Aplique presión gradualmente. La punta de la pipeta debe romperse limpiamente en el punto donde fue marcada.Luego, bajo un objetivo de 40 x, pulir el extremo de la pipeta hasta un diámetro interno de cinco micrómetros utilizando un filamento calentado eléctricamente. Una vez finalizado, la micropipeta está lista para usarse en el registro de corrientes de las ORN del ratón. En el siguiente paso, sacrificar un ratón y extraerle la cabeza.Luego retire la piel que recubre el cráneo y, posteriormente, divida la cabeza a lo largo de la línea media. A continuación, transfiera las dos mitades de la cabeza a un microscopio estereoscópico de disección. Retire el tabique nasal y extraiga las conchas nasales nasales.Coloque el tejido en una placa de Petri con solución de Ringer para mamíferos que contenga glucosa. A continuación, desprenda el epitelio olfativo del cartílago subyacente de dos cornetes. Transfiera el tejido a un tubo einor que contenga 250 microlitros de solución de Ringer.Luego, almacene el tejido restante a cuatro grados Celsius para su uso posterior. Vortexee brevemente dos veces durante un segundo el tubo EOR que contiene el epitelio olfatorio a velocidad media. Este paso provoca la disociación mecánica de las NS del epitelio.A continuación, coloque la solución de Ringer que contiene las ORN disociadas en la cámara de registro montada sobre el microscopio y retire los fragmentos grandes de tejido en la suspensión utilizando un par de pinzas finas. Deje que la ORN sedimente durante 20 minutos antes de iniciar la perfusión continua con solución de Ringer y proceder a las grabaciones; en este procedimiento, llene la pipeta con solución de Ringer. Coloque la pipeta en el porta-pipetas y fije el porta-pipetas al cabezal del amplificador del parche de voltaje.A continuación, conecte la línea de aceite al puerto lateral del porta-pipetas. Luego, introduzca la pipeta en la cámara de registro. Regule la altura del depósito de aceite para establecer una presión ligeramente positiva en la punta de la pipeta.Esto puede hacerse observando cómo los restos celulares se mueven alejándose o acercándose a la pipeta. Procure no contaminar la punta de la pipeta con restos celulares. A continuación, examine la cámara de grabación en busca de una ORN aislada, que puede reconocerse por su morfología bipolar típica utilizando un aumento de 20 a 40 x.Luego mueva el electrodo de registro a una proximidad cercana al cuerpo celular de la neurona olfativa. Aspire suavemente a través del tubo conectado al depósito de aceite para que el cuerpo celular entre en la punta de la pipeta. Continúe aplicando succión con cuidado y lentamente hasta que todo el cuerpo celular sea introducido en la punta de la pipeta de succión, dejando la dendrita y los cilios expuestos a la solución del baño.Mueva la pipeta de succión desde la sección que contiene las ORN sedimentadas hasta la sección de registro de la cámara. Coloque cuidadosamente la pipeta de succión frente al tubo de tres conductos destinado al intercambio de solución. La pipeta de succión debe colocarse lo suficientemente cerca de la abertura del tubo de tres conductos para que la ORN quede expuesta a un flujo laminar, evitando así turbulencias por mezcla. Para lograr el intercambio de solución, mueva el límite entre los flujos paralelos de solución provenientes del tubo de tres cámaras del cambiador de solución, atravesando la punta de la pipeta de succión, con el fin de monitorear la calidad y fiabilidad del intercambio de solución.Puede medirse la corriente de unión provocada al mover la célula entre soluciones de diferente composición iónica. El curso temporal del intercambio de solución es típicamente de alrededor de 20 milisegundos. Cuando la neurona receptora olfativa se expone a una solución de odorante, puede elicitarse aquí una respuesta provocada por el odorante.Se expuso una ORN a eugenol de cien micromolares durante un segundo, como indica la barra sobre la grabación. En el panel superior, la corriente receptora se filtró con un ancho de banda de cero a 50 hercios para mostrar únicamente la corriente receptora. El panel inferior muestra la misma grabación filtrada con un ancho de banda amplio de cero a 5.000 hercios para mostrar también los potenciales de acción. A continuación se muestran las respuestas a la dosis de una ORN sensible al eugenol. Se utilizó eugenol en concentraciones que variaron desde 0,3 micromolar hasta cien micromolares.La duración del estímulo fue de un segundo, y las trazas se filtraron de cero a 50 hercios. Un aumento progresivo en la concentración del odorante produjo una respuesta con ascenso más grande y más rápido, que también finalizó más lentamente. Una vez finalizada la exposición al odorante, las neuronas olfativas receptoras pueden mostrar un patrón de respuesta oscilatorio durante estimulaciones prolongadas a concentraciones intermedias de odorante.Aquí, una neurona olfativa receptora (NOR) sensible a la acetofenona fue estimulada durante ocho segundos. Tras un pico de respuesta rápido y transitorio al inicio de la estimulación, se observa una serie de respuestas recurrentes más pequeñas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar manipular con cuidado las neuronas olfativas receptoras y ser muy paciente.Gracias por ver este video y mucha suerte con sus experimentos.

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Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

El electroolfactogram (EOG) de grabación es una manera informativa, fácil de realizar, y fiable para evaluar la función olfatoria a nivel del epitelio olfativo. Este protocolo describe un sistema de grabación, preparación de los tejidos del ratón, la recopilación de datos y análisis de datos básicos.

Las respuestas de los análisis de las neuronas sensoriales olfativas ratón Utilizando la grabación Electroolfactogram Aire fase

Este video muestra el registro electrofisiológico de las neuronas sensoriales olfativas (OSN) en ratones utilizando una técnica de patch-clamp perforada. El epitelio olfativo, que contiene OSN con receptores de olor marcados con fluoróforos, se aísla de un ratón y se asegura en una cámara de registro. Una pipeta de registro se sujeta a la perilla dendrítica de un OSN, y la nistatina dentro de la pipeta perfora la membrana para formar una conectividad eléctrica con la célula. Por último, se...

Registro de neuronas sensoriales olfativas en ratones

El video del protocolo describe el establecimiento de una pinza de parche de célula completa para el registro electrofisiológico de las neuronas sensoriales del órgano vomeronasal (VNO) en ratones. Un corte coronal de VNO con neuronas sensoriales marcadas con fluorescencia se coloca en una configuración de grabación. Una neurona marcada se conecta con una pipeta de registro en una configuración de celda completa para el registro electrofisiológico en respuesta a estímulos químicos.

Establecimiento de una pinza de parche de celda completa para el registro electrofisiológico de las neuronas sensoriales vomeronasiales

En este video, una mosca Drosophila viva está montada en un tubo para estudios electrofisiológicos. Los electrodos se colocan en la base del sensillum para registrar respuestas neuronales específicas a las feromonas con las neuronas receptoras olfativas de la mosca.

Registros electrofisiológicos de Drosophila sensilla en respuesta a odorantes volátiles

Demostramos variaciones de la técnica de grabación extracelular de múltiples unidades para caracterizar el mal olor respuestas evocadas en las tres primeras etapas de la vía olfativa invertebrado. Estas técnicas se pueden adaptar fácilmente para examinar la actividad conjunto en otros sistemas neurales también.

Varias unidades Métodos de grabación para caracterizar la actividad neuronal en el Locust (<em&gt; Schistocerca americana</em&gt;) Circuitos olfativas

El análisis de las propiedades fisiológicas de las neuronas sensoriales olfativas aún enfrenta limitaciones técnicas. Aquí los registramos a través de una pinza de parche perforada en una preparación intacta del epitelio olfativo en ratones dirigidos a genes. Esta técnica permite la caracterización de las propiedades de la membrana y las respuestas a ligandos específicos de neuronas que expresan receptores olfativos definidos.

Perforado grabación de patch-clamp de ratón neuronas sensoriales olfativas en neuroepitelio Intacto: Análisis funcional de las neuronas que expresan un odorante del receptor Identificado

Las chinches dependen de las neuronas receptoras olfativas alojadas en su sensibilidad olfativa antenal para detectar semioquímicos en el medio ambiente. Utilizando el registro de un solo sensillum, demostramos un método para evaluar la respuesta de las chinches a los semioquímicos y exploramos el proceso de codificación involucrado.

Uso Individual sensillum grabación para detectar respuestas olfativo neurona de chinches de cama a Semioquímicos

Caracterizar la función de receptores odorantes sirve una parte indispensable en el proceso de deorphanization. Se describe un método para medir la activación de receptores odorantes en tiempo real utilizando un ensayo de campo.

Células vivas medición de olor del Receptor activación utilizando un ensayo de campo en tiempo real

El objetivo general de este protocolo es demostrar cómo presentar olorosos de baja volatilidad para el registro de un solo sensor de Drosophila neuronas receptoras olfativas que responden a la cadena larga de feromonas cuticulares.

Registro electrofisiológico de<em&gt; Drosophila</em&gt; Tricoide Sensilla en Respuesta a Odorantes de Baja Volatilidad

Fisiológicamente, los receptores odorantes son activados por moléculas odorantes inhaladas en la fase de vapor. Sin embargo, más sistemas in vitro utilizan la estimulación olfativa de fase líquida. Aquí, presentamos un método que permite en tiempo real monitoreo in vitro de la activación del receptor odorante al estímulo odorante en fase de vapor.

En tiempo real en el seguimiento de Vitro de la activación del Receptor odorante por un olor en la fase de Vapor

El registro extracelular multi-unidad del nervio olfativo es un método sensible, robusto y reproducible para evaluar la sensibilidad olfativa en peces marinos. Registra la entrada sensorial primaria y es independiente de la salinidad externa.

Grabación extracelular multiinsular del nervio olfativo de los teleosts

Aprende a registrar respuestas a odorantes en neuronas olfativas del receptor de ratón mediante la técnica de pipeta de succión. Este método permite capturar corrientes receptoras y potenciales de acción simultáneamente.

Inducidas Odorante-respuestas registradas de neuronas olfativas del receptor utilizando la técnica de aspiración con una pipeta

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