Avidez detección basada en la interacción extracelular (AVEXIS) para la detección escalable de extracelular de baja afinidad interacciones ligando-receptor

El objetivo general de este procedimiento es descubrir nuevas interacciones de proteínas extracelulares involucradas en los procesos de reconocimiento celular, en particular proteínas receptoras integradas en la membrana. El enfoque de AveXis está diseñado para eludir las afinidades de interacción muy débiles que tipifican esta clase de interacciones de proteínas y el hecho de que las proteínas de membrana son difíciles de manipular bioquímicamente. Esto se logra compilando primero una biblioteca de proteínas recombinantes de las regiones extracelulares de los receptores de la superficie celular.

Esto se logra mediante el diseño de plásmidos de expresión para producir las regiones de dominio ecto de los receptores como fragmentos solubles como cebos biotinilados monoméricos y elogios marcados con enzimas pentámeras. El segundo paso es expresar y normalizar las proteínas para que estén listas para el cribado de interacción. Todas las proteínas se producen en células de mamíferos para asegurar que se agreguen modificaciones postraduccionales como diss, sulfuro, enlaces y glicosilación.

Un paso crucial en el protocolo es garantizar que las proteínas de cebo y presa dentro de la biblioteca estén normalizadas dentro de los niveles umbral. Luego viene la parte emocionante, la búsqueda de interacciones novedosas. Los Bates se colocan en pozos individuales de una placa de microt y luego se sondean para las interacciones utilizando el elogio.

A continuación, se realiza un paso de lavado. El paso final es agregar el sustrato para que la enzima detecte cualquier elogio capturado en las matrices de proteínas de cebo. En última instancia, los resultados de una prueba de detección VEX pueden mostrar qué receptores de las células son capaces de formar socios de unión y, por lo tanto, pueden estar involucrados en los procesos de reconocimiento y comunicación entre las células.

La principal ventaja de esta técnica de métodos populares de extracción de proteínas, como el híbrido de levadura o las purificaciones bioquímicas, es que está diseñada específicamente para detectar interacciones extracelulares entre proteínas y proteínas. Es especialmente adecuado para descubrir nuevas interacciones entre proteínas receptoras ancladas a la membrana. Estas interacciones son difíciles de detectar con otras técnicas porque las proteínas de membrana son bioquímicamente difíciles de manipular y, por lo general, sus interacciones contrarias a los receptores son extremadamente débiles.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave relacionadas con la forma en que las células se reconocen y se comunican entre sí. A nivel molecular, se puede utilizar para responder a preguntas relacionadas con procesos biológicos básicos, como qué proteínas receptoras que se muestran en la superficie de los óvulos y los espermatozoides se combinaron entre sí, o qué interacciones de ligandos receptores son responsables de comportamientos celulares como la fusión de miocitos o la formación de crestas neuronales. El principal desafío con este enfoque es compilar las bibliotecas de proteínas de cebo y oración dentro de las cuales se pueden detectar las interacciones.

También es muy importante asegurarse de que las proteínas del cebo y de la presa estén normalizadas dentro de los niveles umbral requeridos para el ensayo. Esto reduce la frecuencia de falsos negativos y falsos positivos. La primera vez que tuve la idea de este método fue durante mi doctorado, cuando estaba tratando de identificar un socio de unión para la proteína de la superficie celular CD 200.

Esencialmente, estaba haciendo la pregunta, ¿cuál es el patrón de unión para este receptor de superficie celular en particular? ¿Incluso hoy? Esta sigue siendo una pregunta técnicamente difícil de responder en ese momento, sin embargo, el genoma humano estaba casi terminado y me di cuenta de que debido a que ahora teníamos una lista completa de todos los receptores de la superficie celular en el genoma, ahora podíamos preguntar dentro de este conjunto de proteínas receptoras que pueden interactuar técnicamente.

Esta es una pregunta mucho más fácil de responder, y AveXis fue el método que desarrollamos para responderla. Una vez que se haya establecido una biblioteca de vectores de cebo y preexpresión, prepárese para transfectarlos en células HEC 2 9 3 E, comience sembrando las células el día anterior a la transfección a una densidad de 250.000 células por mililitro en 50 mililitros de medios de estilo libre 2 9 3 para garantizar una evocación eficiente de la biotina. Complemente el medio utilizado para producir proteínas de cebo, no proteínas de presa con d biotina con todas las placas preparadas, incube las células durante la noche en condiciones estándar.

Debido a que la biotina tiene una solubilidad baja y una solución precisa, preferimos pesar la biotina adicional y luego agregarla al medio y agitar vigorosamente al día siguiente. Transfectar 50 mililitros de células cultivadas con 25 microgramos del plásmido de cebo o presa utilizando un reactivo de transfección adecuado para producir cebos biotinilados transfect de cuna. El cebo se construye en una proporción de 10 a uno con plásmidos que codifican una forma secretada de la proteína ELI biotina ligasa por cosecha.

Los cultivos se realizan cinco días después de la transfección, primero palideciendo las células por centrifugación a 3000 veces la gravedad durante 20 minutos y filtrando el sobrenadante S a través de un filtro de 0,22 micras. Una de las características clave de AveXis es que, debido a que se secretan proteínas recombinantes, se pueden diluir o concentrar dentro de las actividades umbral. Descubrimos que las proteínas recombinantes tienen una expresión variable de hasta cuatro órdenes de magnitud, por lo que el paso de normalización reduce la aparición de falsos positivos durante los pasos de cribado.

Para comenzar la normalización del cebo, la biotina no conjugada debe eliminarse del medio mediante diálisis, ya que competirá por la proteína del cebo biotinilada para unirse al estreptococo en los sitios de unión, comenzando por asegurar el cebo en un tubo de diálisis. Para garantizar una diálisis eficaz de las proteínas recombinantes, hemos descubierto que es importante proporcionar un área de superficie excesiva al tubo de diálisis. Por lo general, proporcionamos de dos a tres veces más tubos de los que realmente se requieren para el volumen que se está dializando.

Durante un período de 24 horas, se dializó el cebo de forma extensiva contra un tampón adecuado, como el PBS, después de la diálisis. Un ELIZA comienza bloqueando los pocillos de una placa microt codificada por estreptococos con PBST que contiene BSA durante 15 minutos. Mientras tanto, en un plato limpio, haga una serie de cuatro diluciones de una a tres de las proteínas del cebo en PBST con 2% de BSA.

Después de los 15 minutos de incubación, transfiera la dilución a la placa codificada con estreptococo TTR e incube la placa durante una hora a temperatura ambiente después de una hora, lave los pocillos y luego a cada uno, agregue 100 microlitros de dos microgramos por mililitro OX 68. Incuba la placa a temperatura ambiente durante una hora más. Después de la segunda incubación, realice otra serie de lavado y cargue la placa con fosfatasa alcalina anti-EE. UU.

Incubar la placa durante una tercera hora a temperatura ambiente. Ahora lave la placa tres veces en PBST y dele un lavado final PBS. Para eliminar cualquier detergente residual, agregue 100 microlitros de un miligramo por mililitro de sustrato 1 0 4 en tampón de etanol amina después de una hora.

A temperatura ambiente, mida la absorbancia de 4 0 5 nanómetros, Eliza detectó una serie de dilución de cuatro supinatos de cebo dializados diferentes utilizando un anticuerpo monoclonal anti CD de cuatro marcas. Si las proteínas de cebo exprés sin diluir son insuficientes para saturar todos los sitios de unión a la biotina de una placa recubierta de estreptococos ávidos de ENC, concentre la proteína utilizando un concentrador de espín Viva. De lo contrario, use la proteína de cebo a una concentración diluida en PBST con 2% de BSA.

Eso es suficiente para saturar el sitio de unión a la biotina del ensayo. Cuantificar los niveles relativos en los que se expresan las preproteínas utilizando la actividad de la enzima beta lactamasa. Comience haciendo una serie de diluciones del supinato que contiene las paraproteínas en el tampón PBST 2%BSA.

Luego agregue 20 microlitros de la dilución a 60 microlitros de una solución escalonada nitrosa cargada en una placa. Transfiera inmediatamente la placa a un lector de placas y mida la absorbancia de 4 85 nanómetros una vez por minuto durante los próximos 20 minutos utilizando concentradores centrífugos o PBST de dilución con 2% de BSA. Establezca la concentración final de las muestras para hidrolizar todos los nitros en el ensayo en aproximadamente siete minutos, lo que equivale a una rotación de aproximadamente dos nitros por minuto.

Comience la prueba de detección de AveXis lavando una placa recubierta de estreptococo TAVR ENC en PBST y golpeando la placa para secarla contra una toalla de papel. A continuación, agregue PBST con BSA a cada pocillo e incube la placa durante 30 minutos. Esto bloquea los sitios de unión a proteínas espurias.

Dentro de cada uno, retire la solución de bloqueo con un movimiento inteligente del plato sobre un fregadero y agregue 100 microlitros de cebo monomérico biotinilado normalizado a los pocillos apropiados. Incubar la placa durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, retire las muestras de cebo del plato con otro movimiento y lávelo tres veces con PBST.

A continuación, seque con grifos después del tercer lavado. Ahora agregue 100 microlitros de la construcción de presa pentámera normalizada a cada pocillo e incube la placa a temperatura ambiente durante una hora. Después de una hora, dale a la placa tres lavados más con PBST y un lavado final con PBS solamente.

Finalmente, agregue 60 microlitros de solución nitrosa siete a cada pocillo e incube la placa a temperatura ambiente durante dos horas, o preferiblemente incube las placas durante 16 horas a cuatro grados SIU. Al día siguiente, las interacciones positivas se habrán vuelto rojas. Tome una fotografía de la placa para un registro visual y luego cuantifique las reacciones a una absorbancia de 4 85 nanómetros utilizando un lector de placas.

Después de aproximadamente 10 minutos desde el comienzo de la reacción de detección de AveXis, se observaron cambios de color amarillo a rojo tanto en el control de captura de presas mediado por anticuerpos como en la interacción de control positivo. Este cambio de color indica hidrólisis del nitroso en el sustrato. Se pueden observar algunas interacciones positivas en esta escala de tiempo, pero la mayoría tardó unas horas en aparecer.

Por lo general, se ha observado una tasa de aciertos de alrededor del 0,4 al 0,6% de positivos. Una vez que las bibliotecas de proteínas están preparadas, la parte de cribado de esta técnica se puede realizar rápidamente. Es muy posible examinar hasta 12 placas en un día después de identificar una interacción.

El siguiente paso más importante es, en primer lugar, demostrar que la interacción puede repetirse utilizando preparaciones de proteínas frescas e independientes. En segundo lugar, siempre determinamos si la interacción es independiente de la orientación de la presa del cebo, es decir, ¿puede ser recíproca? Esto implica clonar los dominios del vector de cebo en el vector de presa y viceversa.

Las interacciones que pueden ser repetidas y recíprocas se consideran de alta confianza y siempre se ha demostrado que son positivas. Utilizando otras técnicas, como la resonancia de plasma de superficie, nos gusta utilizar plasma de superficie en resonancia para validar adicionalmente cualquier interacción que reidentifiquemos. Es importante destacar que esto proporciona una demostración de que los dos componentes purificados pueden interactuar directamente y también se puede usar para mostrar que la unión está saturada y, por lo tanto, es específica.