Name: Avidez detección basada en la interacción extracelular (AVEXIS) para la detección escalable de extracelular de baja afinidad interacciones ligando-receptor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: Aprende a detectar interacciones ligando-receptor extracelulares de baja afinidad con AVEXIS. Este método de alto rendimiento utiliza bibliotecas de proteínas recombinantes para identificar interacciones débiles entre receptores de membrana.

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Este trabajo fue financiado por el Wellcome Trust, el número de subvención [077108] otorgado a GJW.

1. Compilación de una biblioteca de cebo y presa vectores plásmidos de expresión <ol><li> Compile una lista de receptores de superficie celular y las proteínas secretadas de interés para ser seleccionados para las interacciones y recuperar sus secuencias de una base de datos de secuencias de proteínas adecuada. La mayoría de las proteínas que contienen un péptido secretor N-terminal de señal son adecuados (que incluyen el tipo I, GPI-enlazadas y las proteínas secretadas). Típicamente, una familia de proteínas (por ejemplo superfamilia de inmunoglobulinas o todos los receptores restringidas a un tipo específico de células tales como los eritrocitos) serían seleccionados. </li><li> Determinar la extensión de las regiones extracelulares mediante la identificación de la ubicación del péptido señal y la región transmembrana utilizando la función de la proteína software de predicción. Por lo general utilizan v3.0 SignalP 5 y 6 TMHMM v2.0. </li><li> Conjuntos de diseño de la cartilla que amplifican el fragmento ectodominio entero para cada receptor. Tenemos un paquete de cebo y vectores de presa que son adecuados para este fin que son unaisponible de Addgene ( <a href="http://www.addgene.org/">http://www.addgene.org/~~V</a> ). Diseñar el primer sentido alrededor del inicio metionina para incluir un sitio de enzima de restricción NotI y una secuencia de Kozak óptima, que es seguido por 25 pares de bases de coincidencia exacta de genes específicos de secuencia (Fig. 2A). </li><li> Diseñar el cebador antisentido para truncar tipo I proteínas receptoras justo antes de la región de transmembrana predicha para expresar el ectodominio entero como una proteína recombinante soluble. Incluir un sitio de restricción AscI en este cebador que luego deberá traducirse en el marco de una rata C-terminal Cd4d3 4 etiqueta proteína 7 (fig. 2A). </li><li> Amplificar los fragmentos de ectodominio de todos los genes con estos cebadores y clonarlos en el cebo o el vector de la presa. A veces resulta útil a la primera a clonar en vectores lanzadera antes de subclonación en un vector de expresión de mamíferos apropiada, se utiliza un derivado del vector pTT3 3,4. Tanto el cebo y los vectores de la presa conten C-terminal de la proteína etiquetas como sigue (Fig. 2B). <ol><li> Los cebos: Una etiqueta que contiene dominios 3 y 4 de los CD4 de rata (Cd4d3 +4) de proteínas seguido por una secuencia peptídica que es un sustrato para la enzima de E. coli BirA y por lo tanto se puede monobiotinylated en un residuo de lisina específico (Fig. 2B) . El Cd4d3 4 etiqueta es reconocida por el anticuerpo monoclonal OX68 y se utiliza para cuantificar la expresión de las proteínas de cebo por ELISA. Las proteínas son, por tanto cebo monomérica y monobiotinylated. Otros vectores de la proteína cebo, donde se sustituye el péptido biotinylatable por una etiqueta 6-su para la purificación están disponibles. </li><li> Presas: Las presas también contienen una rata Cd4d3 4 etiqueta seguido por una secuencia de péptido de la proteína de rata cartílago matriz oligomérica (COMP) y una enzima C-terminal de β-lactamasa. El péptido COMP asegura que las formas de presas pentámeros expresó una vez (Fig. 2B). </li></ol></li></ol> 2. Presa y Bait-expresión de la proteína Usamosun práctico sistema de alto nivel de expresión mediante el cultivo de la suspensión de la línea celular HEK293E 4 para producir nuestras bibliotecas de proteínas, pero cualquier sistema de expresión de mamíferos debe ser adecuado. Una alternativa disponible en el mercado es el sistema de Freestyle. Las células se cultivaron rutinariamente en una plataforma de agitación (125 rpm) a 37 ° C, 5% de CO 2 a 70% de humedad relativa. Proteínas de control tanto positivos como negativos también debe ser expresado. La rata Cd4d3 cuatro etiquetas de sólo fragmento está disponible como un cebo y la presa y son adecuadas para los controles negativos. Del mismo modo, los vectores de cebo y presa que codifican un control positivo se encuentran disponibles (Addgene), que suelen utilizar la rata-CD200 CD200R la interacción 8. <ol><li> Semillas de las células HEK293E el día antes de la transfección a una densidad de 2,5 x 10 5 células ml -1. En forma rutinaria cultivo de las células en volúmenes de 50 ml en Freestyle293 medios de comunicación tras las recomendaciones del fabricante. Para garantizar la biotinilación eficiente, completar tél medio de cultivo celular utilizada para producir proteínas de cebo con D-biotina a una concentración final de 100 mM. Medio utilizado para expresar las proteínas presa no necesita ser suplementado con D-biotina adicional. </li><li> El día siguiente, las células usando un reactivo de transfección de las transfecciones adecuado (por ejemplo 293fectin). Utilizar 25 g del cebo o presa construcciones de plásmidos para transfectar un cultivo de 50 ml. Para producir los cebos biotinilados, co-transfectar el plásmido que codifica el cebo construir con un plásmido que codifica una forma secretada de la proteína de E. coli-biotina-ligasa ( BirA) que está disponible de Addgene. Co-transfección de plásmidos de cebo en una proporción de 10:1 (2,5 g) del plásmido que codifica la proteína secretada Bira. </li><li> Cultivos de cosecha cinco días después de la transfección por primera granulación de las células por centrifugación a 3000 x g durante 20 minutos, seguido por filtración del sobrenadante a través de un filtro de 0,22 mM. </li></ol> Consejo [: cebo y presa de proteínass deben ser almacenados sin diluir a 4 ° C y, como norma general se debe utilizar dentro de un año. Añadir bacteriostáticos tales como 50 mg / ml de polimixina B sulfato o 10 mM de NaN 3 para evitar la contaminación bacteriana de los sobrenadantes.] 3. La normalización de la carnada y las muestras de presas Una de las características clave del ensayo AVEXIS es que debido a las proteínas recombinantes son secretados pueden ser diluida o concentrada (normalizado) dentro de las actividades de umbral establecidos antes de ser utilizado en el ensayo. Hemos encontrado que los niveles en los que las proteínas recombinantes se expresan abarcan una amplia gama - hasta 4 órdenes de magnitud - y por lo que el paso de normalización reduce significativamente el número de falsos positivos durante las pantallas. 3.1 Cebo de normalización Nota: no conjugado de D-biotina debe ser retirado de los medios (típicamente por diálisis), ya que competirá con la biotina bait proteína para unirse a la estreptavidina sitios de unión. <ol><li> Traslado sobrenadantes de cebo en tubos de diálisis, la etiqueta, enganchada de manera segura y dializa extensamente frente a un tampón adecuado tal como PBS para eliminar la biotina libre. </li></ol> [Consejo: Se ha encontrado que la diálisis se logra normalmente suficiente para 6 x 50 mL sobrenadantes de cebo contra un volumen de 4,5 l de PBS con 4 cambios durante un período de 24 horas. Diálisis insuficiente puede ser observado por una inhibición de la proteína de unión a diluciones bajas durante la etapa de normalización cebo (fig. 3A). <ol start="2"><li> Realizar un ELISA para determinar los niveles relativos a la que las proteínas se expresan de cebo. Preparar una serie de dilución de las proteínas biotiniladas cebo y la captura de ellos en una placa de microtitulación revestidos con estreptavidina. Use la rata Cd4d3 cuatro etiqueta para detectar y cuantificar las proteínas cebo capturados utilizando un anticuerpo monoclonal (OX68). Concentrar o diluir las proteínas cebo a la cantidad mínima necesaria para saturar todo el bioten sitios de unión en el pocillo de una placa de estreptavidina-revestido. </li><li> Bloque los pocillos de una placa de estreptavidina-revestido con tampón fosfato saline/0.1% de Tween-20 (PBST) / 2% de seroalbúmina bovina (BSA) durante 15 minutos. </li><li> En una placa separada, hacer una serie de dilución (cuatro diluciones 1:3 son generalmente suficientes) de las proteínas de cebo en PBST BSA / 2% y la transferencia a los pocillos de una placa de estreptavidina-revestido. Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Lave 3 veces en PBST. Añadir 100 l de 2 mg / ml de ratón anti-rata Cd4d3 4 IgG (OX68) incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Lave 3 veces en PBST. Añadir 100 l de anti-ratón de fosfatasa alcalina en dilución 1:5000 en PBST / 2% de BSA y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Lavar 3x en PBST y realizar un lavado final en PBS para eliminar cualquier detergente residual. Añadir 100 l de 1 mg / ml de sustrato 104 en tampón de dietanolamina (10% de dietanolamina (v / v), 0,5 mM MgCl 2, 10 mM de NaN 3, pH9.8, se almacena protegido de la luz a 4° C). </li><li> Después de una hora, la absorbancia medida a 405 nm. Representativos resultados normalización de cebo se muestran en la Figura 3A. </li><li> Cebo proteínas que se expresan en niveles que son insuficientes para saturar todos los sitios de unión de biotina-estreptavidina una placa recubierta, cuando se utiliza sin diluir, se debe concentró usando concentradores Vivaspin (Vivascience, 10kDa MWCO). Como una guía, estimamos que ~ 5 g de una proteína cebo típico (~ 80 kDa) es suficiente para saturar una placa de 96 pocillos. <ol><li> Proteínas cebo expresadas a niveles altos puede ser diluida en BSA PBST / 2% a una concentración suficiente para saturar la placa de estreptavidina-revestido. La actividad de los cebos, deberá comprobarse después de la dilución o concentración para garantizar que se saturará todos los sitios de unión de biotina en la placa de estreptavidina-revestido. </li></ol></li></ol> 3.2 Presa de normalización <ol><li> Cuantificar los niveles relativos a la que las proteínas de la presa se expresan utilizando el β-lactamasala actividad enzimática. </li><li> En primer lugar, hacer una serie de diluciones del sobrenadante que contiene las proteínas de presa en PBST / 2% de tampón BSA. Entonces se añaden 20 l de las diluciones de 60 l de unos 242 micras (0,125 mg / ml) de solución de nitrocefina (Calbiochem). </li><li> Inmediatamente transferir la placa a un lector de placas de microtitulación que toma una medida de absorbancia a 485 nm por minuto durante 20 minutos a temperatura ambiente. Representativos resultados normalización presa se muestran en la Figura 3B. </li><li> Concentrar las muestras utilizando concentradores centrífugos o diluirlas en PBST / BSA al 2% para llegar a un umbral de actividad de ~ 2 nmol min -1 volumen de negocios de nitrocefina. Prácticamente, esto se logra si toda la nitrocefina se hidroliza dentro ~ 7 minutos. </li></ol> 4. AVEXIS procedimiento de detección <ol><li> Lave una placa revestida con estreptavidina en PBST. </li><li> Añadir 100 l de PBST / 2% de BSA a cada pocillo y se incuba durante 30 minutos para bloquear los sitios de proteínas espurios de unión dentro de cada pocillo. </li&gt; </ol> [Consejo: para eliminar el tampón de lavado después de las etapas de lavado, la placa se golpea ligeramente - con fuerza - en toallas de papel] <ol start="3"><li> Retire la solución de bloqueo con un movimiento inteligente de la placa sobre una pileta y añadir 100 ml normalizado cebo monomérico con biotina a los pocillos apropiados y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Retirar las muestras de cebo de la placa por volviendo hacia arriba de la placa y elegantemente agitando sobre un lavabo, y lavar 3 veces con PBST. </li><li> Añadir 100 l de la presa normalizada pentamerized construir a cada pocillo y se incuba a temperatura ambiente durante 1 hora, lavar como en el paso 4,4 y realizar un lavado final con PBS solo. </li><li> Añadir 60 l de 242 mM solución de nitrocefina (disolver 5 mg de nitrocefina en 500 l de DMSO, mezclar bien y diluir aún más la nitrocefina en 40 ml de PBS y se pasan a través de un filtro de 0,22 antes de añadir a los platos) y se incuban a temperatura ambiente . Las interacciones positivas se pueden observarpor el ojo desde la nitrocefina amarillo se hidroliza a un color rojo. Cuantificar mediante la lectura de la absorbancia a 485 nm utilizando un lector de placas. Un plato típico y la cuantificación se muestra en la fig. 4. </li></ol> [Consejo: Las interacciones positivas se observan generalmente dentro de 2 horas a temperatura ambiente aunque las placas deben colocarse a 4 ° C durante 16 horas para asegurar que todas las interacciones potenciales se detectan. También hemos encontrado que nitrocefina precipitado y las imperfecciones en el plástico de la placa de microtitulación como arañazos o huellas dactilares en ocasiones puede dar lugar a falsos positivos artefactuales a 485 nm a pesar de no hidrólisis nitrocefina manifiesta. Por tanto, es recomendable tomar fotografías de las placas para grabar visualmente el volumen de negocios nitrocefina en los pozos.] 5. Los resultados representativos Un ejemplo de una placa de detección representante AVEXIS se muestra en la Figura 4. Uno debe observar la hidrólisis (de amarillo a rojo) del sustrato nitrocefina en elpositiva pocillos de control (tanto la mediada por anticuerpos de control de captura de presas y también la interacción control positivo) dentro de unos diez minutos. Algunas interacciones dentro de la pantalla también se observan dentro de esta escala de tiempo, pero otros pueden tardar más tiempo (algunas horas) en aparecer. Típicamente, un golpe de tasa de alrededor de 0,4-0,6% (una interacción positiva por cada 150-250 interacciones siendo examinados) es típica, dependiendo de las bibliotecas de proteínas siendo examinados. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3881/3881fig1.jpg" /> Figura 1. La identificación de las interacciones ligando-receptor que median procesos celulares de reconocimiento utilizando AVEXIS. El esquema muestra dos células interactúan entre sí (A y B) el intercambio de información a través de las interacciones realizadas entre las proteínas del receptor de membrana integradas. AVEXIS es un ensayo de proteínas interacción escalable específicamente diseñado para identificar nuevos pares ligando-receptor que se caracterizan por fuerzas de interacción muy débiles. Recombinante paraluble bibliotecas de proteínas que representan a la totalidad de la ectodominio repertorio de células del receptor de la superficie de las células, se compilan ya sea como pentaméricas presas β-lactamasa de etiquetado (tipo de célula A) o monómeros de cebos biotina-etiquetados (para el tipo de células B). El pentamerisation de la presa aumenta la concentración local de los ectodominios para efectuar una ganancia avidez general por lo que las interacciones incluso muy transitorios pueden ser detectados. La biblioteca de cebo se vistió de streptavidina revestida de placas y sistemáticamente investigado por las interacciones con las proteínas de la presa. Después de un breve lavado, las presas capturadas son detectados gracias a la actividad β-lactamasa asociado a la presa. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3881/3881fig2.jpg" /> Figura 2. El cebo y el diseño de construcción de la presa. (A) La rata CD200 proteína del receptor se proporciona como un ejemplo de cómo los ectodominios enteras de proteínas de las células receptoras de la superficie se determinan y cebadores están diseñados para hacer tanto ceboy construcciones de presas de expresión. La secuencia de la proteína traducida cDNA y se muestran a partir del péptido señal N-terminal a la membrana que abarca la región transmembrana de rata CD200. Un primer sentido está diseñado para incluir un 5 &#39;de restricción NotI sitio de la enzima y la secuencia de Kozak óptimo seguido de 25 bases de la secuencia coincidencia exacta con la secuencia de cDNA CD200. El cebador antisentido contiene un sitio AscI y 25 bases de secuencia coincidencia exacta situado inmediatamente aguas arriba del residuo ectodominio truncamiento seleccionado. Para mantener el ectodominio en marco con la rata Cd4d3 4 etiqueta, el sitio AscI debe traducir como Gly-Ala-Pro. (B) representaciones esquemáticas de la carnada y las construcciones de presas de expresión. Cada uno contiene ectodominios receptores flanqueados por sitios NotI y ascos y una etiqueta Cd4d3 4. Los cebos contienen una secuencia de péptido C-terminal que puede ser específicamente monobiotinylated por cotransfección con un plásmido que expresa una enzima secretada Bira. Las presas son seguidos por la secuencia pentamerisationa partir de la proteína matriz del cartílago oligomérica (COMP) y la enzima β-lactamasa. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3881/3881fig3.jpg" /> Figura 3. La normalización de la carnada y las proteínas de presa. (A) los ejemplos representativos de la normalización de cebo. Una serie de dilución de cuatro diferentes sobrenadantes dializados cebo se detectaron por ELISA utilizando un anticuerpo anti-CD4 etiqueta monoclonales. Los cuatro cebos se expresan en diferentes niveles 1&gt; 2&gt; 3&gt; 4. Los cebos deben ser normalizados a un nivel de umbral que satura los sitios de unión de biotina en cada pocillo. Cebos altamente expresadas se puede diluir a conservar la proteína (por ejemplo cebo 1 podría ser diluido ~ 1:100), y se concentró cebos pobremente expresadas. Lecturas disminuyó a bajas diluciones a veces se observan en algunos cebos (cebo por ejemplo 2) que es atribuible a la presencia de D-biotina no conjugado debido a diálisis incompleta. (B) Los niveles en los que se aprovechan de las proteínas son exprensada se cuantifica mediante la velocidad de hidrólisis de un sustrato β-lactamasa, nitrocefina. En el ejemplo mostrado, las tres presas se expresan en niveles diferentes: 1 presa&gt; 2&gt; 3. Presas debe ser normalizado a una actividad de ~ 2 -1 nmol min, lo que corresponde para completar la hidrólisis de 14,5 nmol nitrocefina en ~ 7 minutos (por ejemplo, presas 1). Las otras presas en este ejemplo debe concentrarse antes de su uso en el cribado. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3881/3881fig4.jpg" /> Figura 4. Representante AVEXIS resultados de la prueba. (A) Una fotografía de una placa representativa de detección AVEXIS. Una presa de proteínas se probaron contra 41 diferentes cebos y una interacción positiva se detecta en E2 también. Los controles utilizados en las placas de evaluación incluyen: un biotina anticuerpo anti-CD4 para capturar toda la presa de proteína añadido al pozo (G6), la interacción de control: la rata CD200 (cebo)-CD200R (presa), con la presa CD200R utilizado en la dilución del umbral (H3), 1:10 (H4) y 1:100 (H5). Los controles negativos fueron: a Cd4d3 4 de cebo determinada con la presa de proteínas que están siendo revisadas (H1) y la presa CD200R (H2). (B) Cuantificación de los valores de absorbancia de la misma pantalla que realizaron por triplicado. Los puntos de datos son la media ± desviación estándar.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Cuando las células vivas se observan en vivo, sus membranas plasmáticas presentan comportamientos muy dinámicos: la ampliación y procesos de retracción de la membrana como se ponen en contacto y comunicarse con sus 2 vecinos. Las interacciones físicas entre las proteínas receptoras incrustados membrana que median muchos de estos contactos han evolucionado para ser extremadamente débil para permitir este comportamiento muy móviles. Se ha estimado que las fortalezas de monómeros de interacción tan débiles como 50 micras, podría ser suficiente para impulsar las interacciones espontáneas en las densidades de los receptores fisiológicos 9 lo que hace que la detección de nuevas interacciones extremadamente difíciles 2,10. El método descrito aquí AVEXIS proporciona un método sensible para la detección de la proteína extracelular transitoria: las interacciones de proteínas que pueden ser implementadas de una manera escalable con una baja tasa de falsos positivos. Mientras que otros métodos escalables se han desarrollado para detectar las interacciones extracelulares 11-15,Una ventaja de AVEXIS es que los parámetros experimentales, como el cebo y las actividades de las presas han sido cuantificados para detectar hasta el más débil de las interacciones (t 1/2 ≤ 0,1 s), manteniendo una baja tasa de falsos positivos 3. Además, los procedimientos simplificados y la muestra sólida preparación han permitido que este ensayo se realizará a una escala mucho más grande que otros ensayos y se ha descrito recientemente una pantalla de interacción sistemática total de más de 16.500 interacciones potenciales del ~ 16. El ensayo puede realizarse en cualquier proteína de las que es posible expresar un fragmento soluble de proteína recombinante. Esto incluye tanto las proteínas que contienen un péptido señal N-terminal como el tipo I, IPM-enlazadas y proteínas secretadas. Recientemente, hemos diseñado un conjunto de vectores que ahora nos permiten expresar proteínas de tipo II como cebos 17. El ensayo no es generalmente adecuado para las proteínas de membrana multipaso como transportador de ioness o bombas, ya que es probable que se correctamente plegada fuera del contexto de una membrana plasmática. Hemos aplicado este a una variedad de sistemas diferentes y han expresado con éxito proteínas extracelulares de pez cebra 3,16,18, humano, ratón y P. falciparum para las pantallas de interacción. En términos de los recursos necesarios para configurar una pantalla AVEXIS, hemos encontrado que un cuello de botella importante es la selección, la construcción, y la secuenciación completa de los plásmidos de expresión. Este aspecto del método puede tomar hasta un año para hacer ~ 100 cebo y construcciones de presas, sin embargo, con el costo de la disminución de la síntesis de genes, que ahora están a favor comercialmente la externalización de este aspecto del proyecto. El sistema de expresión de mamíferos, junto con una gran agitación incubadora de cultivo de tejido (se utiliza una célula Multitron Infors HT) permite que un solo investigador de expresar y normalizar hasta ~ 100 proteínas cebo y presa de un mes. Una vez que las proteínas se producen y se normalizaron, screening para interacciones es rápido con hasta doce placas 96-y siendo convenientemente procesados ​​por día. El único equipo a medida que hemos desarrollado para facilitar la producción de un número tan grande de las proteínas es un aire comprimido impulsado pistón que se utiliza para pasar hasta cinco sobrenadantes a través de un filtro de 0.22μm en paralelo. La clase principal de las interacciones que pueden perderse si se compara con las interacciones que se esperan de la literatura (falsos negativos) son las interacciones homophilic, aunque algunas de estas interacciones pueden ser detectadas 3. En los casos en que las interacciones esperadas no son detectados, creemos que esto se debe a la formación de las interacciones de las proteínas homophilic presa (presa de &quot;enmascaramiento&quot; efecto) lo que impide que las interacciones con otras proteínas cebo inmovilizados. La frecuencia a la cual se detectan las interacciones depende del contenido de la biblioteca de proteína siendo examinados. Como una guía para el lector, una pantalla de&gt; 30, 000 interacciones dentro de la superfamilia de las inmunoglobulinas pez cebra como resultado 188 positivos - una frecuencia de 0,6% 3,16,18. Una comprobación muy rápido que se puede realizar para verificar cualquier jugado positivos es determinar si la interacción puede ser detectada en ambas presas cebo-orientaciones; es decir, la interacción puede ser detectada misma independientemente de si las proteínas de unión están presentes ya sea como un cebo o una presa. Siempre hemos observado este comportamiento alternativo, la unión ha sido posteriormente demostró ser específico mediante la demostración de la unión directa saturable de proteínas purificadas mediante resonancia de plasmón superficial. Cabe destacar que debido a que aumenta la avidez de unión artificialmente pentamerising las proteínas de la presa, no consideramos adecuado para el análisis cuantitativo comparando fuerzas de interacción. Para obtener los parámetros biofísicos de unión de las interacciones que utilizamos proteínas monoméricas y la resonancia de plasmones de superficie. Finalmente, una vez una interacción ha sido identificado, el hila naturaleza rendimiento gh de la prueba hace que sea relativamente fácil de adaptar el ensayo para la detección de los reactivos, como los anticuerpos o pequeñas moléculas que bloquean la interacción.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de reactivo </td><td> Empresa </td><td> Cat. Número </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Freestyle medios </td><td> Invitrogen </td><td> 12338018 </td><td></td></tr><tr><td> Nitrocefina </td><td> Calbiochem </td><td> 484400 </td><td></td></tr><tr><td> SA recubiertos con placas de microtitulación </td><td> Nunc </td><td> 734-1284 </td><td></td></tr><tr><td> OX68 anticuerpos </td><td> AbDSerotec </td><td> MCA1022R </td><td></td></tr><tr><td> Diálisis tubo </td><td> Atravesar </td><td> PN68100 </td><td></td></tr><tr><td> Polimixina B </td><td> Sigma </td><td> P4932 </td><td></td></tr><tr><td> D-biotina </td><td> Sigma </td><td> B4639-5G </td><td></td></tr><tr><td> Sustrato-104 </td><td> Sigma </td><td> 1040-506 </td><td></td></tr><tr><td> Vivaspin-20 concentradores centrífugos </td><td> Sartorio </td><td> VS2002 </td><td></td></tr><tr><td> Filtros de 0,22 micras </td><td> Nalgene </td><td> 190-2520 </td><td></td></tr></tbody></table>

avidez detección basada en la interacción extracelular (avexis) para la detección escalable de extracelular de baja afinidad interacciones ligando-receptor

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Extracelular de la proteína: proteína interacciones entre las proteínas secretadas o de membrana atados son fundamentales para la cohesión de iniciar la comunicación intercelular y la garantía dentro de los organismos multicelulares. Las proteínas predicho para formar interacciones extracelulares son codificadas por aproximadamente una cuarta parte de los genes humanos 1, pero a pesar de su importancia y la abundancia, la mayoría de estas proteínas han documentado ninguna pareja de unión. Principalmente, esto es debido a su insolubilidad bioquímicos: proteínas de membrana incrustados son difíciles de solubilizar en su conformación nativa y contienen modificaciones post-estructuralmente importantes. Además, las afinidades de interacción entre las proteínas de los receptores se caracterizan a menudo por fuerzas de interacción extremadamente bajas (vida media de &lt;1 segundo) que impiden su detección con muchos de uso común los métodos de alto rendimiento 2. A continuación, describimos un ensayo, AVEXIS (avidez basada extracelularlar la interacción de la pantalla) que supera estos retos técnicos que permitan la detección de interacciones proteína muy débiles (t 1/2 ≤ 0,1 segundos) con una baja tasa de falsos positivos 3. El ensayo se implementa normalmente en un formato de alto rendimiento para permitir la detección sistemática de muchos miles de interacciones en un formato de placa de microtitulación conveniente (Fig. 1). Se basa en la producción de solubles bibliotecas de proteínas recombinantes que contienen los fragmentos ectodominio de receptores de la superficie celular o proteínas secretadas dentro del cual la pantalla para interacciones, por lo tanto, este enfoque es adecuado para el tipo I, tipo II, IPM-enlazadas receptores de la superficie de células y secretada proteínas, pero no para las proteínas de membrana multipaso como los canales iónicos o transportadores. Las bibliotecas de proteínas recombinantes se producen mediante un sistema de expresión de mamíferos cómoda y de alto nivel-4, para asegurar que las importantes modificaciones postraduccionales como glycosylabonos ción y el disulfuro se añaden. Proteínas recombinantes expresadas son secretadas en el medio y se produce en dos formas: un cebo con biotina que se puede capturar en una fase sólida recubiertas de estreptavidina adecuado para el cribado, y una enzima-etiquetado pentamerised presa (β-lactamasa). El cebo y proteínas presa se presentan entre sí en una forma binaria para detectar la interacción directa entre ellos, de forma similar a un ELISA convencional (fig. 1). El pentamerisation de las proteínas en la presa se logra a través de una secuencia de péptido de la proteína matriz oligomérica de cartílago (COMP) y aumenta la concentración local de los ectodominios proporcionando así beneficios significativos avidez para permitir interacciones incluso muy transitorios para ser detectado. Por la normalización de las actividades tanto de la carnada y la presa a niveles predeterminados anteriores a la selección, hemos demostrado que las interacciones que tienen monoméricas una vida media de 0,1 segundos se pueden detectar con bajas tasas de falsos positivos 3.

AVEXIS es una proteína de alto rendimiento ensayo de la interacción desarrollada para detectar sistemáticamente nuevos ligando extracelular del receptor de los pares que intervienen en los procesos de reconocimiento celular. Se ha diseñado específicamente para detectar las interacciones proteína transitorios que son difíciles de identificar el uso de otros métodos de alto rendimiento.

Avidez detección basada en la interacción extracelular (AVEXIS) para la detección escalable de extracelular de baja afinidad interacciones ligando-receptor

Las interacciones proteína-proteína extracelulares entre proteínas secretadas o ancladas a la membrana son fundamentales tanto para iniciar la comunicación intercelular como para...

El objetivo general de este procedimiento es descubrir nuevas interacciones proteicas extracelulares implicadas en procesos de reconocimiento celular, en particular proteínas receptoras integradas en la membrana. El enfoque AveXis está diseñado para sortear las afinidades de interacción muy débiles que caracterizan a esta clase de interacciones proteicas y el hecho de que las proteínas de membrana son difíciles de manipular bioquímicamente. Esto se logra primero mediante la compilación de una biblioteca de proteínas recombinantes de las regiones extracelulares de los receptores de superficie celular.Esto se logra diseñando plásmidos de expresión para producir las regiones del dominio ecto de los receptores como fragmentos solubles, tanto como cebos monoméricos biotinilados como cebos pentaméricos marcados con enzimas. El segundo paso consiste en expresar y normalizar las proteínas para que estén listas para la detección de interacciones. Todas las proteínas se producen en células mamíferas para asegurar que se agreguen modificaciones postraduccionales como enlaces disulfuro, puentes de sulfuro y glicosilación.Un paso crucial en el protocolo consiste en asegurar que las proteínas cebo y presa dentro de la biblioteca se normalicen todas a niveles umbral. Luego viene la parte emocionante: la detección de nuevas interacciones. Los Bates se distribuyen en pozos individuales de una placa de microplaca y luego se analizan en busca de interacciones utilizando el elogio.Luego se realiza un paso de lavado. El paso final consiste en añadir el sustrato para la enzima con el fin de detectar cualquier captura de presa en las matrices de proteínas cebo. En última instancia, los resultados de una pantalla VEX pueden mostrar qué receptores de superficie celular son capaces de formar parejas de unión y, por lo tanto, podrían estar involucrados en los procesos de reconocimiento y comunicación entre células.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos populares de extracción de proteínas, como el sistema de dos híbridos en levadura o las purificaciones bioquímicas, es que está diseñada específicamente para detectar interacciones extracelulares entre proteínas. Es especialmente adecuada para descubrir nuevas interacciones entre proteínas receptoras ancladas a la membrana. Estas interacciones son difíciles de detectar mediante otras técnicas porque las proteínas de membrana son bioquímicamente difíciles de manipular y, por lo general, sus interacciones con los receptores complementarios son extremadamente débiles.Este método puede ayudar a responder preguntas clave relacionadas con cómo las células se reconocen y se comunican entre sí. A nivel molecular, puede utilizarse para responder preguntas relacionadas con procesos biológicos básicos, como qué proteínas receptoras presentes en la superficie de los óvulos y espermatozoides se combinan entre sí, o qué interacciones entre receptores y ligandos son responsables de comportamientos celulares como la fusión de miocitos o la formación de la cresta neural. El principal desafío de este enfoque consiste en compilar las bibliotecas de proteínas de cebo y presa dentro de las cuales se realizará la búsqueda de interacciones.También es muy importante asegurarse de que las proteínas cebo y presa estén normalizadas dentro de los niveles umbral requeridos para el ensayo. Esto reduce la frecuencia de falsos negativos y falsos positivos. Tuve la idea inicial de este método durante mi doctorado, cuando intentaba identificar un compañero de unión para la proteína de superficie celular CD 200.Esencialmente, estaba planteando la pregunta: ¿cuál es el patrón de unión para este receptor particular de la superficie celular? Incluso hoy en día, esta sigue siendo una pregunta técnicamente difícil de responder. En aquel momento, sin embargo, el genoma humano estaba próximo a completarse y me di cuenta de que, dado que ahora contábamos con una lista completa de todos los receptores de la superficie celular en el genoma, podíamos preguntar ahora dentro de este conjunto de proteínas receptoras cuáles pueden interactuar técnicamente.Esta es una pregunta mucho más sencilla de responder, y AveXis fue el método que desarrollamos para responderla. Una vez que se ha establecido una biblioteca de vectores de expresión de cebo y de presa, prepárese para transfectarlos en células HEC 293E: comience sembrando las células el día anterior a la transfección a una densidad de 250.000 células por mililitro en 50 mililitros de medio freestyle 293 para asegurar una biotinilación eficiente. Suplemente el medio utilizado para producir las proteínas de cebo, no las proteínas de presa, con D-biotina. Con todas las placas preparadas, incube las células durante la noche en condiciones estándar.Dado que la biotina tiene baja solubilidad y una disolución precisa, preferimos pesar la biotina adicional y luego añadirla al medio agitando vigorosamente al día siguiente. Transfecte 50 mililitros de células en cultivo con 25 microgramos del plásmido cebo o presa utilizando un reactivo de transfección adecuado para producir cebos biotinilados; realice una cotransfección del constructo cebo en una proporción de 10 a 1 junto con plásmidos que codifiquen una forma secretada de la proteína ELI, ligasa de biotina, por cada cosecha.Los cultivos, cinco días posteriores a la transfección, se clarifican primero mediante centrifugación a 3000 veces la gravedad durante 20 minutos y segundo mediante filtración del sobrenadante S a través de un filtro de 0.22 micrones. Una de las características clave de AveXis es que, dado que las proteínas recombinantes son secretadas, pueden diluirse o concentrarse hasta alcanzar actividades dentro del umbral. Descubrimos que las proteínas recombinantes presentan una expresión variable hasta en cuatro órdenes de magnitud, por lo que el paso de normalización reduce la aparición de falsos positivos durante las etapas de cribado.Para comenzar la normalización del cebo, es necesario eliminar la desbiotina no conjugada del medio mediante diálisis, ya que competirá con la proteína de cebo biotinilada por los sitios de unión a la estreptavidina. Comience asegurando el cebo dentro de un tubo de diálisis. Para garantizar una diálisis eficaz de las proteínas recombinantes, hemos encontrado que es importante proporcionar un área de superficie excesiva al tubo de diálisis. Normalmente, proporcionamos dos o tres veces más tubo del estrictamente necesario para el volumen que se va a dializar.En un período de 24 horas, dialice extensamente el cebo contra un tampón adecuado, como PBS, tras realizar la diálisis. Comience un ELIZA bloqueando los pocillos de una microplaca codificada con estreptavidina con PBST que contiene BSA durante 15 minutos. Mientras tanto, en una placa limpia, realice una serie de cuatro diluciones uno a tres del cebo proteico en PBST con BSA al 2%.Después de la incubación de 15 minutos, transfiera la dilución a la placa que codifica strep TTR e incube la placa durante una hora a temperatura ambiente. Pasada una hora, lave los pocillos y luego agregue a cada uno 100 microlitros de OX 68 a dos microgramos por mililitro. Incube la placa a temperatura ambiente durante otra hora. Después de la segunda incubación, realice otra serie de lavados y cargue la placa con anti-US fosfatasa alcalina.Incube la placa durante una tercera hora a temperatura ambiente. Ahora lave la placa tres veces con PBST y realice un lavado final con PBS. Para eliminar cualquier resto de detergente, agregue 100 microlitros de sustrato de un miligramo por mililitro 1 0 4 en tampón de dietanolamina después de una hora.A temperatura ambiente, mida la absorbancia a 405 nanómetros. Una serie de dilución de cuatro sobrenadantes de cebo dializados diferentes fue detectada por ELISA utilizando un anticuerpo monoclonal antietiqueta CD4. Si las proteínas de cebo expresadas sin diluir no son suficientes para saturar todos los sitios de unión a biotina de una placa recubierta con estreptavidina, entonces concentre la proteína utilizando un concentrador Viva spin. De lo contrario, use la proteína de cebo a una concentración diluida en PBST con 2 % de BSA.Esto es suficiente para saturar el sitio de unión a biotina del ensayo. Cuantifique los niveles relativos de expresión de las preproteínas utilizando la actividad de la enzima beta-lactamasa. Comience preparando una serie de diluciones del sobrenadante que contiene las paraproteínas en tampón PBST con 2 % de BSA.Luego, agregue 20 microlitros de la dilución a 60 microlitros de una solución de nitroso estepina cargada en una placa. Transfiera inmediatamente la placa a un lector de placas y mida la absorbancia a 485 nanómetros una vez por minuto durante los siguientes 20 minutos utilizando concentradores centrífugos o dilución de PBST con 2 % de BSA. Ajuste la concentración final de las muestras para hidrolizar todos los nitrosos en el ensayo en aproximadamente siete minutos, lo que equivale a unas dos conversiones de nitrosos por minuto.Comience la prueba AveXis lavando una placa recubierta con TAVR ENC de strep en PBST y sacudiendo la placa seca contra una toalla de papel. A continuación, agregue PBST con BSA a cada pocillo e incube la placa durante 30 minutos. Esto bloquea sitios espurios de unión a proteínas.En cada uno, eliminaremos la solución bloqueante con un movimiento rápido del plato sobre el fregadero y añadiremos 100 microlitros de cebo biotinilado monomérico normalizado a los pozos correspondientes. Incube el plato durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, retire las muestras de cebo del plato con otro movimiento rápido y lávelas tres veces con PBST.Luego, séquelo dando toques tras el tercer lavado. Ahora agregue 100 microlitros del constructo de presa pentamérico normalizado a cada pocillo e incube la placa a temperatura ambiente durante una hora. Después de una hora, realice tres lavados más con PBST y un lavado final solo con PBS.Finalmente, agregue 60 microlitros de solución de nitrato siete a cada pocillo e incube la placa a temperatura ambiente durante dos horas, o preferiblemente incube las placas durante 16 horas a cuatro grados SIU. Al día siguiente, las interacciones positivas habrán adquirido un color rojo. Tome una fotografía de la placa como registro visual y luego cuantifique las reacciones a una absorbancia de 485 nanómetros utilizando un lector de placas.Alrededor de 10 minutos después del inicio de la reacción de cribado de AveXis, se observaron cambios de color de amarillo a rojo tanto en el control de captura de presas mediado por anticuerpos como en la interacción del control positivo. Este cambio de color indica la hidrólisis de los nitritos en el sustrato. Algunas interacciones positivas son observables en esta escala de tiempo, pero la mayoría tardaron algunas horas en aparecer.Normalmente, se ha observado una tasa de aciertos de alrededor de 0,4 a 0,6 %positivos. Una vez que se preparan las bibliotecas de proteínas, la parte de cribado de esta técnica puede realizarse rápidamente. Es bastante posible cribar hasta 12 placas en un día tras identificar una interacción.El siguiente paso más importante consiste primero en demostrar que la interacción puede repetirse utilizando preparaciones frescas e independientes de las proteínas. En segundo lugar, siempre determinamos si la interacción es independiente de la orientación entre el reclamo y el presa, es decir, si puede ser reciproca. Esto implica clonar los dominios del vector reclamo en el vector presa y viceversa.Las interacciones que pueden repetirse y recíprocarse se consideran de alta confianza y siempre se han demostrado que son positivas. Utilizando otras técnicas como la resonancia de plasmón superficial, nos gusta usar la resonancia de plasmón superficial para validar adicionalmente cualquier interacción que volvamos a identificar. Es importante destacar que esto proporciona una demostración de que los dos componentes purificados pueden interactuar directamente y también puede utilizarse para mostrar que la unión es saturable y, por lo tanto, específica.

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Avidez detección basada en la interacción extracelular (AVEXIS) para la detección escalable de extracelular de baja afinidad interacciones ligando-receptor (Video) | JoVE Journal

Avidez detección basada en la interacción extracelular (AVEXIS) para la detección escalable de extracelular de baja afinidad interacciones ligando-receptor

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