Name: Activación de los macrófagos alveolares murinos recolección y evaluación de celular inducida por nanopartículas polianhidrido (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Aprende a evaluar la activación de macrófagos alveolares murinos mediante nanopartículas polianhidrido. Este protocolo utiliza lavado broncoalveolar y citometría de flujo para analizar marcadores de superficie celular.

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Los autores desean agradecer a Ejército de los EE.UU. de Investigación Médica y Material de comandos (números de concesión W81XWH-09-1-0386 y W81XWH-10-1-0806) para el apoyo financiero y el Dr. Shawn Rigby del Fondo Estatal de Iowa Citometría de flujo para la Universidad su experto en asistencia técnica.

1. La recolección macrófagos alveolares (AMɸ) del ratón usando lavado pulmonar <ol><li> Use equipos de protección personal (EPP), como una bata de laboratorio, guantes desechables y protección ocular adecuada. </li><li> Preparar completa AMɸ (cAMɸ) medio antes del inicio de la cosecha. Añadir 2,5 ml de penicilina / estreptomicina (penicilina / estreptomicina) solución, 250 l de β-mercaptoetanol (2-mercaptoetanol), y 25 ml de inactivado por calor suero fetal bovino (SFB) a 222,25 ml de medio modificado Dulbelcco de Eagle (DMEM). Filtro de esterilizar a medio cAMɸ con un 0,2 micras de tamaño de poro botella de filtro superior al vacío. </li><li> La eutanasia de un ratón sano por asfixia de CO 2 en una cámara de la eutanasia. Aunque un ratón C57BL / 6 (6-8 semanas de edad) se utilizó para los fines de este proyecto, esta técnica lavado pulmonar se puede realizar en cualquier cepa de ratón. El uso de un cilindro de gas comprimido, permitir el flujo de gas en la cámara durante 1 min antes de colocar el ratón en el CHámbar para asegurar que la cámara está completamente cargada con CO 2. Coloque el ratón en la cámara por lo menos durante un minuto para eutanasia el ratón. Además, exsanguinate cada ratón a través de punción cardíaca como un método físico para confirmar la muerte del ratón como se describe en 1,4. </li><li> Coloque el cursor sobre la espalda (dorso), rocíe con etanol al 70%, localizar el esternón y, en un ángulo de 30 grados desde el abdomen, inserta una aguja de calibre 23 (unida a una jeringa de 1 ml) de unos 50 mm en la cavidad torácica . Con la colocación correcta de la aguja, debería ser posible recoger entre 0,4 a 1 ml de sangre en función del tamaño del ratón. Examinar el animal para el cese de los signos vitales. </li><li> Coloque el ratón sobre el banco de laboratorio por lo que está acostado sobre su abdomen (parte ventral). Aerosol ratón con etanol al 70% para esterilizar el medio ambiente de trabajo. Pellizque la piel a mitad de la columna vertebral del ratón. Con una tijera de disección que han sido esterilizadas con etanol al 70%, hará una pequeña incisión a través de la piel. &lt;/ Li&gt; <li> Agarra la piel en ambos lados de la incisión y tirar de la piel en direcciones opuestas a lo largo del eje cráneo-caudal del ratón. Cuando se hace correctamente, la piel se separan del cuerpo subyacente. </li><li> El cuello del ratón ahora debe mostrar los músculos expuestos y las glándulas. Corte con cuidado de que el tejido y tire de ella hacia la parte anterior del mouse el uso de fórceps, con lo que la exposición de la laringe, la tráquea y el esófago del ratón. Evite cortar la vena yugular o la arteria carótida. </li><li> La tráquea es ahora visible y se puede identificar como el tejido con anillos cartilaginosos que la rodean. Delicadamente mantenga la tráquea con fórceps y suavemente levantar y separar la tráquea desde el esófago, que está situado en el lado dorsal. </li><li> Haga una pequeña incisión anterior, donde se sostiene la tráquea, pero por detrás de la laringe. La incisión debe hacerse aproximadamente a un ángulo de 45 ° grado. Además, no completamente seccionar la tráquea, ya que esto evitará que se retraiga enla cavidad del cuerpo. </li><li> Llenar una jeringa de 1 cc equipado con un catéter gato Tom con PBS estéril en preparación para insertar el catéter en el lumen de la traquea. Mantenga la tráquea con unas pinzas y con la mano sujetando el catéter cerca de la punta para aumentar el control y suavemente insértelo en el sitio de la incisión traqueal. Suavemente insertar catéter en la tráquea alrededor de 20 mm. Sujetar la tráquea que es alrededor del tubo de catéter, liberando la otra mano. </li><li> Con una jeringa de 1 ml equipado con el catéter, fundan suavemente con 0,75 ml de la temperatura ambiente, PBS estéril en los pulmones y luego suavemente la parte posterior aspiración de PBS en la jeringa. Repita este proceso tres veces, mientras que el exterior de masaje en el pecho. Desconectar la jeringa del catéter y dispensar el líquido de lavado en un tubo de centrífuga de 15 ml. Después de llenar la jeringa con 0,75 ml de PBS fresco y volver a conectar la jeringa al catéter, repetir los pasos 1,9 y 1,10 veces para cada ratón. La recuperación del fluido puede ser parcial, obteniendo menos de la VOlume infundido. Si la recolección de células procedentes de más de un ratón, colocar el tubo de 15 ml con las células recolectadas en hielo hasta que todos los lavados pulmonares se han realizado. </li></ol> 2. El tratamiento de lavado pulmonar AMɸ Cosecha <ol><li> Centrifugar el líquido de lavado pulmonar a 250 x g durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Utilizando una técnica estéril, el sobrenadante se decanta en un recipiente apropiado para desechos dentro de un gabinete de bioseguridad. Resuspender el botón celular rastrillando suavemente el tubo de centrífuga a través de la parte superior de un bastidor de tubo de ensayo. Añadir 1 ml de medio de cAMɸ para volver a suspender las células. </li><li> Enumerar las células utilizando un Partículas Coulter Counter Z1 pipeteando 20 l de células en 10 ml de Isoton II diluyente en vial contador Coulter. Agregue 3 a 4 gotas de Zap-oglobin reactivo II lítico en el vial, los tiempos de invertir suavemente 3 a 4 y luego cargar la cubeta de análisis sobre el mostrador para obtener una concentración celular. Asegúrese de programar el contador con un factor de dilución de 2 x 10 4 para mostrar lapila de concentración como el número de células por ml. </li><li> Diluir las células de 2,5 x 10 5 por ml usando medio cAMɸ. </li><li> Dispensar 2 ml de 2,5 x 10 5 células / ml en cada pocillo de una placa de tejido 6-pocillos. </li><li> Para enriquecer para AMɸ, las placas de cultivo se incuban dentro de un 37 ° C incubadora humidificada con un 5% de CO 2 ambiente durante 6 horas para permitir que las células se adhieran a la parte inferior del pozo. Aspire con cuidado el sobrenadante y no perturbar las células adherentes. </li><li> Lavar los pocillos con PBS estéril (libre de calcio y magnesio) para eliminar las células no adherentes y escombros. Añadir 2 ml de medio de cAMɸ a cada pocillo. </li><li> Se incuban las células durante la noche dentro de un 37 ° C incubadora humidificada con un 5% de CO 2 ambiente antes de la adición de estimulantes. Después de esta etapa de enriquecimiento, aproximadamente el 87% de las células son positivos para el macrófago marcadores CD11b y F4/80 (figura 2c). </li></ol> 3. La adición de PolyanhydridLas nanopartículas y tratamientos electrónicos de control <ol><li> Fabricar las nanopartículas a través de polianhidrido antidisolvente nanoencapsulación 15. En este proceso, el polímero se disuelve en cloruro de metileno (4 ° C a una concentración de 25 mg / ml) y se precipitó en pentano (-20 ° C en un cloruro de metileno relación 1:200: pentano). </li><li> Pesar utilizando nanopartículas polianhídrido esterilizada peso del papel en el equilibrio que se puede medir con precisión las cantidades de microgramos. Añadir partículas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Volver a suspender las nanopartículas en el hielo frío cAMɸ. Los cálculos se realizan de tal manera que no más de 0,3 ml de medio se añade a cada pocillo para obtener la concentración deseada de nanopartículas. Mantener las partículas resuspendidas en hielo hasta que las nanopartículas se añade al cultivo así. </li><li> Antes de la adición de las nanopartículas a los cultivos AMɸ, sonicar partículas usando un sonicador parte superior del banco con una micropunta. Esterilizar micropunta por pulverización con 70% de etanol y wiping con una Kimwipe estéril antes de sonicación. Someter a ultrasonidos a 10-20 julios de 30 a 45 s mientras se mantiene el tubo en hielo. Observar macroscópicamente suspensión de nanopartículas. Si las partículas no están lo suficientemente dispersa, permitir la suspensión para ajustar en hielo durante 1 a 2 minutos para asegurar que las nanopartículas están por debajo de la temperatura de transición vítrea del polímero antes de sonicación de nuevo durante 30 a 45 segundos. La intención de este paso es sonicación para dispersar adecuadamente las nanopartículas, como la CPTEG 50:50: nanopartículas CPH tienden a agregarse cuando se expone a un ambiente acuoso. Sin embargo, algunos pequeños agregados de nanopartículas todavía pueden permanecer en la suspensión. </li><li> Suspensión de nanopartículas (dispersa adecuadamente) debe mantenerse en hielo y se utiliza de inmediato para evitar la erosión superficial prematura o agregación. </li><li> Retire las placas de cultivo que contienen la AMɸ de la incubadora y el lugar en el gabinete de seguridad de la biotecnología. Placa de inclinación en un ángulo de 45 grados y la pipeta de la cantidad de medicinaum que se añade a la suspensión de nanopartículas (no debe exceder de 0,3 ml). No molestar a las células adherentes al quitar del medio. </li><li> Vórtice de la suspensión de nanopartículas polianhidrido brevemente antes de añadir a los pocillos correspondientes. Pipetear la cantidad de suspensión de nanopartículas (no más de 0,3 ml) en el pozo (s) específico, sin embargo, no pipetear arriba y hacia abajo para mezclar. Esta acción podría separar el adherente AMɸ del pozo. Las partículas se depositan en el fondo del pozo y en contacto con las células. Para los estudios indicados en este informe, la concentración final de nanopartículas de co-cultivadas con la AMɸ fue de 125 mg / ml. Proceda con los pozos posteriores y deseadas grupos de tratamiento. Incluir a los grupos de control positivas y negativas, como único medio y 200 ng / ml de lipopolisacárido (LPS) a los pozos designados. </li><li> Volver las placas de cultivo a los 37 ° C incubadora humidificada con un 5% de CO2 la atmósfera durante 48 h. Los estudios cinéticos en nuestro laboratory han demostrado ser de 48 horas para el período de cultivo óptimo para evaluar tanto la superficie celular marcador expresión y secreción de citoquinas, ya que permite un tiempo adecuado para la transcripción y la síntesis de proteínas que se produzca. A pesar de mayores niveles de citocinas se acumulan durante un período de cultivo prolongado (es decir, 72 horas), la evaluación de la superficie celular expresión de los marcadores en este punto en el tiempo puede ser confundida por la contribución de los niveles elevados de citoquinas. Los cambios en la expresión de superficie marcador de observarse no pueden ser directamente atribuibles a la estimulación con las mismas nanopartículas. </li></ol> 4. La evaluación de la activación AMɸ mediante citometría de flujo <ol><li> Preparar activado por fluorescencia de células de clasificación (FACS) tampón (0,1% de azida sódica y 0,1% de albúmina sérica bovina (BSA)) en 0,1 M tampón fosfato salino (pH 7,4) antes de la cosecha de los macrófagos chapados que han sido co-cultivadas con nanopartículas or estimulantes. </li><li> Preparar las soluciones de trabajo de la memoria intermedia de bloqueo y los anticuerpos monoclonales. Para preparar el tampón bloque, diluir IgG de rata (Sigma) y anti-CD16/32 (eBioscience) a 1 mg / ml y 10 mg / ml, respectivamente, en tampón FACS. Diluir marcador superficie del panel de anticuerpos en tampón FACS ya sea a la concentración fabricante recomienda o la concentración de usuario optimizada. Por los resultados presentados en este trabajo, el panel de marcadores de superficie se compone de anticuerpos contra MHC II, CD86, CD40 y CIRE (CD209). Anti-ratón anticuerpos contra los marcadores F4/80 macrófagos y CD11b también están incluidos en el panel para identificar positivamente el fenotipo de macrófagos durante el análisis de datos. Se debe tener cuidado al seleccionar anticuerpos contra moléculas MHC II, como puras cepas de ratón a menudo difieren en sus haplotipos MHC II. Los anticuerpos seleccionados deben reaccionar con los aloantígenos específicos MHC expresadas por su cepa de ratón de interés. </li><li> Después de 48 h de incubación con nanopartículas y / oestimulantes, coloque los platos de cultivo de células en hielo durante 20 minutos. Para eliminar los macrófagos adherentes de las placas, raspe suavemente pozos con un rascador de células de 24 cm. </li><li> Utilizando una pipeta serológica de 5 ml, suavemente aspirar las células y el medio arriba y hacia abajo cinco veces para generar una suspensión de células individuales. Pipetear el contenido de los pocillos individuales en diferentes tubos de 5 ml de poliestireno para que no se mezclan las células de diferentes tratamientos experimentales. </li><li> Añadir 2 ml de tampón FACS a cada tubo. </li><li> Centrifugar los tubos de células a 250 x g a 4 ° C durante 10 min. </li><li> Se decanta el sobrenadante y resuspender el pellet de células suavemente en el líquido residual con un rastrillo de los tubos en la parte superior de un bastidor de tubo de ensayo. </li><li> Con el fin de prevenir no específicos de unión de los anticuerpos monoclonales, añadir 10 l de tampón de bloqueo (preparado en el 4,2) a cada tubo de células. Tubos Vortex e incubar en hielo durante 30 minutos. </li><li> Añadir un volumen apropiado de anticuerpos monoclonales diluidos a cada tubo y incubComimos en la oscuridad en hielo durante 15 minutos. Los tubos que contienen las muestras a analizar deben recibir la combinación de anticuerpos del panel polycromatic (optimización anterior de la combinación de anticuerpos debe ser realizado por laboratorios individuales). Otros grupos de control se deben incluir para configurar correctamente los parámetros de adquisición en el citómetro de flujo, incluyendo un tubo de células que no fueron etiquetados, y los tubos de compensación que corresponden a las células marcadas con cada uno de un solo color por separado. Para configurar correctamente las puertas para el análisis de citometría de flujo, la fluorescencia Minus One (FMO) los controles deben ser incluidos durante la adquisición. Controles FMO son células marcadas con todos los anticuerpos conjugados con fluorocromo que se utilizan en el panel excepto uno que se sustituye por su isotipo de control respectivo. Poblaciones positivos y negativos (es decir, partes alícuotas separadas de las células tratadas con un control positivo y estimulante medio solo) también deben ser incluidos en FMO y tubos de compensación de control. </li><li&gt; Añadir 2 ml de tampón FACS a cada tubo, vórtice y se centrifuga a 250 x g a 4 ° C durante 10 min. </li><li> Se decanta el sobrenadante y resuspender el pellet de células en el líquido residual con un rastrillo de los tubos en la parte superior de un bastidor de tubo de ensayo. </li><li> Si el panel de anticuerpos consta de un anticuerpo no conjugado directamente a un fluorocromo sino que es conjugado con biotina, un fluorocromo estreptavidina conjugada es necesaria para visualizar el marcador de superficie. En este paso, añadir un volumen apropiado de la solución diluida fluorocromo conjugado estreptavidina y se incuba en la oscuridad durante 15 minutos en hielo. Como en 4,2, la estreptavidina se diluye a una concentración recomendada por el fabricante o para una optimizada por el usuario. Este paso sólo es necesario para los paneles que contienen biotina anticuerpos primarios. </li><li> Realizar una etapa de lavado como se describe en 4,10. </li><li> Diluir un volumen apropiado de BD estabilizar 01:03 fijador en agua desionizada. Añadir 100 ml de fijador diluido a cada tubo mientras que suavemente vortexing para evitar la aglutinación de las células. Células marcadas y fijadas pueden ser establemente almacenada en la oscuridad a 4 ° C durante aproximadamente una semana antes de la adquisición en un citómetro de flujo. </li></ol> 5. Los datos representativos Las nanopartículas fabricadas en el paso 3,1 tenía un diámetro medio de 163 ± 24 nm y una morfología consistente con la obtenida en estudios previos 5,16. Nanopartículas en solución antes y después de la sonicación se muestra en la Figura 1 para demostrar la necesidad de sonicación para asegurar la dispersión adecuada de las partículas. El análisis de citometría de flujo de AMɸs cosechadas obtenidos mediante lavado pulmonar se muestra en la Figura 2. Etiquetado células con una combinación de CD11b anti-ratón y anti-ratón F4/80 anticuerpos, así como los correspondientes controles FMO permite establecer el etiquetado de fondo, identificando AMɸs y gating para su posterior análisis. El tratamiento de los macrófagos alveolares con polianhídridonanopartículas mejora de activación tal como se muestra por la mayor intensidad de fluorescencia media del MHC II, CD40, CD86, y CIRE (Figura 3). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3883/3883fig1.jpg" /> . Figura 1 50:50 CPTEG: CPH nanopartículas antes de (A) y después (B) 30 s de sonicación. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3883/3883fig2.jpg" /> Figura 2. Análisis de citometría de flujo de cosechados los macrófagos alveolares marcados con (A) Alexa Fluor 700 anti-CD11b y el control de PE-Cy7 FMO, (B) Alexa Fluor 700 FMO de control y el anti-F4/80 PE-Cy7 y (C ) Alexa Fluor 700 y anti-CD11b anti-F4/80 PE-Cy7. El número en la esquina superior derecha representa el porcentaje de células doble positivas. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3883/3883fig3.jpg" /> Figura 3. Histogramas demostrando un aumento de la intensidad de la fluorescenciadad para la expresión de superficie de MHC II (A), CD40 (B), CD86 (C) y CIRE (D) después de co-cultivo de macrófagos alveolares con CPTEG 50:50: polianhidrido CPH nanopartículas durante 48 horas. Los histogramas representan los resultados de AMɸ etiquetados como controles (FMO <img alt="Gráfico de la Línea 1" src="/files/ftp_upload/3883/3883line1.jpg" /> ), No se trata AMɸ marcadas con anticuerpos contra todos los marcadores de la superficie celular ( <img alt="Gráfico de la Línea 3" src="/files/ftp_upload/3883/3883line3.jpg" /> ) Y AMɸ cultivadas con nanopartículas y marcadas con anticuerpos contra todos los marcadores de la superficie celular ( <img alt="Gráfico de la Línea 2" src="/files/ftp_upload/3883/3883line2.jpg" /> ).

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No hay conflictos de interés declarado.

Polianhidrido plataformas de la vacuna de nanopartículas han demostrado su eficacia cuando se administra por vía intranasal en los regímenes de dosis única 5. Medición de la activación de las poblaciones de células fagocíticas residentes en los pulmones inducidas por esta plataforma de administración de vacunas permite la evaluación de su capacidad potencial para promover en última instancia la respuesta inmune adaptativa. En concreto, la cosecha macrófagos alveolares a partir del...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> AMPc medios de comunicación </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 15 a 013 CV </td><td></td></tr><tr><td> 50 mM de 2-mercaptoetanol </td><td> Sigma </td><td> M3148-25ML </td><td></td></tr><tr><td> La penicilina / estreptomicina 10.000 mg / ml de la Solución </td><td> Cellgro </td><td> 30 a 002-CI </td><td></td></tr><tr><td> Suero Bovino Fetal </td><td> Atlanta Productos Biológicos </td><td> S11150 </td><td></td></tr><tr><td> Tampón FACS </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cloruro de sodio </td><td> Fisher Scientific </td><td> S671-500 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato sódico </td><td> Fisher Scientific </td><td> MK7868500 </td><td></td></tr><tr><td> El cloruro de potasio </td><td> Fisher Scientific </td><td> P217500 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato de potasio </td><td> Fisher Scientific </td><td> P288-200 </td><td></td></tr><tr><td> BSA (albúmina de suero bovino) </td><td> Sigma </td><td> A7888 </td><td></td></tr><tr><td> Azida sódica </td><td> Sigma </td><td> S2002 </td><td></td></tr><tr><td> Anticuerpos </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> IgG de rata </td><td> Sigma </td><td> I4341 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Sra. CD16/32 </td><td> eBioscience </td><td> 16-0161 </td><td></td></tr><tr><td> Lucha contra el haplotipo MHC II Sra. IA / IE, el clon M5/114.15.2, conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) </td><td> EBIOSa ciencia </td><td> 11-5321 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD86 de ratón, clon GL-1, conjugado con aloficocianina (APC)-Cy7 </td><td> BioLegend </td><td> 105030 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD40 de ratón, clon 1C10, conjugado con APC </td><td> eBioscience </td><td> 17-0401 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-ratón, clon CD209 5H10, conjugado con biotina </td><td> eBioscience </td><td> 13-2091 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-ratón CD11b, el clon M1/70, conjugado con Alexa Fluor 700 </td><td> eBioscience </td><td> 56-0112 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-ratón F4/80, clon BM8, conjugado con ficoeritrina (PE)-Cy7 </td><td> eBioscience </td><td> 25-4801 </td><td></td></tr><tr><td> PE-rojo de Texas conjugado estreptavidina </td><td> BD Biosciences </td><td> 551487 </td><td></td></tr><tr><td> Otros suministros y reactivos </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A405-20 </td><td> Se utiliza como 70% (v / v) </td></tr><tr><td> Comprimido de CO 2 </td><td> Linweld </td><td> 16000060 </td><td></td></tr><tr><td> 1 ml de jeringa </td><td> BD Biosciences </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> Soberano de 3 ½ &quot;Padre Tom Catcatheter </td><td> Kendall </td><td> 703021 </td><td></td></tr><tr><td> Seguridad de la Biotecnología del Gabinete </td><td> Nuaire </td><td> Serie 22 </td><td></td></tr><tr><td> Tijeras de disección </td><td> Pescador </td><td> 138082 </td><td></td></tr><tr><td> Fórceps </td><td> Roboz </td><td> RS-8254 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, 1X sin calcio y magnesio </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-CM </td><td></td></tr><tr><td> Tubos de centrífuga de 15 ml con tapón de rosca </td><td> VWR International </td><td> 21008-216 </td><td></td></tr><tr><td> Seis de cultivo de tejidos tratados placas </td><td> Costar </td><td> 3516 </td><td></td></tr><tr><td> Bastidores de tubo de plástico </td><td> Nalgene </td><td> 5970 </td><td></td></tr><tr><td> Rascador de células de 24 cm </td><td> TPP </td><td> 99002 </td><td></td></tr><tr><td> 5 de poliestireno ml de fondo redondo del tubo </td><td> Halcón </td><td> 352008 </td><td></td></tr><tr><td> Pipetear auxilios XL </td><td> Drummond </td><td> 4-000-105 </td><td></td></tr><tr><td> 10, 5, y 2 mL Pipetas </td><td> Pescador </td><td> 13-675 </td><td></td></tr><tr><td> 200 y 10 Micropipetas de l </td><td> Gilson Pipetman </td><td> F123601 </td><td></td></tr><tr><td> 200 y 10 puntas de pipeta l </td><td> Pescador </td><td> 02-707 </td><td></td></tr><tr><td> La estabilización de BDFijador </td><td> BD Biosciences </td><td> 338036 </td><td></td></tr><tr><td> Isoton II diluyente </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 8546719 </td><td></td></tr><tr><td> Zap-oglobin II reactivo lítico </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 7546138 </td><td></td></tr><tr><td> Coulter viales de poliestireno Contador </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 14310-684 </td><td></td></tr><tr><td> Tubos de ensayo, </td><td> BD Biosciences </td><td> 352008 </td><td></td></tr><tr><td> Equipo </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Centrífuga Refrigerada </td><td> Labnet </td><td> 50075040 </td><td></td></tr><tr><td> Humidificado incubadora de CO 2 </td><td> Nuaire </td><td> Modelo Autoflow 8500 </td><td></td></tr><tr><td> FACSCanto citómetro de flujo </td><td> BD Biosciences </td><td> 338960 </td><td></td></tr><tr><td> Contador de partículas Coulter Z1 </td><td> Beckman-Coulter </td><td> WS-Z1DUALPC </td><td></td></tr><tr><td> Equipos de procesamiento de líquidos Sonicator con micropunta </td><td> Misonix </td><td> Modelo N º S-4000 </td><td></td></tr></tbody></table>

activación de los macrófagos alveolares murinos recolección y evaluación de celular inducida por nanopartículas polianhidrido

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Nanopartículas biodegradables se han convertido en una plataforma versátil para el diseño e implementación de nuevas vacunas intranasales contra enfermedades infecciosas respiratorias. Específicamente, polianhídrido nanopartículas compuesto del ácido alifático sebácico (SA), la aromático 1,6-bis (p-carboxifenoxi) hexano (LPA), o la anfifílico 1,8-bis (p-carboxifenoxi) -3,6-dioxaoctano (CPTEG) muestran granel único y cinética de la superficie de erosión 1,2 y puede ser explotado para liberar lentamente biomoléculas funcionales (por ejemplo, antígenos proteicos, inmunoglobulinas, etc) in vivo 3,4,5. Estas nanopartículas tienen también actividad adyuvante intrínseca, por lo que una excelente elección para una plataforma de administración de la vacuna 6,7,8. Con el fin de dilucidar los mecanismos que regulan la activación de la inmunidad innata la mucosa nasal después de la vacunación, se debe evaluar las respuestas moleculares y celulares del antígeno pcélulas resentidos (APC), responsables de iniciar la respuesta inmune. Las células dendríticas son las CPA principales que se encuentran en la realización de las vías respiratorias, mientras que los macrófagos alveolares (AMɸ) predominan en el parénquima pulmonar 9,10,11. AMɸ son altamente eficientes en la limpieza de los pulmones de los microbios patógenos y los residuos celulares 12,13. Además, este tipo de células juega un papel importante en el transporte de antígenos microbianos a los ganglios linfáticos de drenaje, que es un primer paso importante en la iniciación de una respuesta inmune adaptativa 9. AMɸ también expresan niveles elevados de reconocimiento de patrones innatos y los receptores scavenger, los mediadores pro-inflamatorios secretan, y las células T vírgenes 12,14. Una población relativamente pura de AMɸ (por ejemplo, superior al 80%) se puede obtener fácilmente a través de lavado pulmonar para su estudio en el laboratorio. Residente AMɸ recogerá a partir de animales inmunes competentes faciliten un fenotipo representante de los macrófagos que encounter la vacuna basada en partículas in vivo. Aquí se describen los protocolos utilizados para la cosecha y la cultura AMɸ de ratones y examinar el fenotipo de la activación de los macrófagos después del tratamiento con nanopartículas polianhídrido in vitro.

Aquí se describen los protocolos para la recogida de los macrófagos alveolares murinos, que residan las células inmunes en el pulmón, y el examen de su activación en respuesta a la co-cultivo con nanopartículas polianhídrido.

Activación de los macrófagos alveolares murinos recolección y evaluación de celular inducida por nanopartículas polianhidrido

Las nanopartículas biodegradables han surgido como una plataforma versátil para el diseño e implementación de nuevas vacunas intranasales contra enfermedades respiratorias...

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la capacidad de las nanopartículas de polianhídrido para activar macrófagos alveolares purificados. Primero, se expone quirúrgicamente la tráquea del ratón y se realiza una lavado broncoalveolar para recolectar células del tracto respiratorio. Luego, los macrófagos alveolares se centrifugan para aislarse y se cultivan durante la noche.Se prepara entonces una suspensión de nanopartículas de polianhídrido y se añade a los macrófagos alveolares. Los macrófagos se incuban para permitir su activación tras 48 horas. La expresión de marcadores de superficie celular se analiza mediante citometría de flujo.El análisis de los datos permite la identificación de formulaciones de nanopartículas de policrótido anhídrido capaces de activar macrófagos alveolares espejo. Este material puede ayudar a responder preguntas en los campos de los biomateriales y la inmunología. Específicamente, podemos identificar biomateriales con actividad adyuvante intrínseca, evidenciada por su capacidad para activar las células presentadoras de antígenos, incluidos los macrófagos alveolares.Tuvimos por primera vez la idea de utilizar este método en nuestra investigación cuando descubrimos que una plataforma de nano vacuna de anhídrido polimérico contra patógenos respiratorios proporcionaba protección completa contra la neumonía bacteriana. En este trabajo actual, buscamos investigar las interacciones específicas de la plataforma de vacuna con las células inmunitarias respiratorias. Comience este procedimiento colocando un ratón sacrificado sobre su espalda.Rocíe al ratón con etanol al 70 %; aunque aquí se utiliza un ratón C57BL/6 de seis a ocho semanas de edad, esta técnica puede realizarse en cualquier cepa de ratón. Localice el esternón e inserte una aguja de calibre 23 con una jeringa de un mililitro a un ángulo de 30 grados respecto al abdomen. A unos 50 milímetros dentro de la cavidad torácica, recoja de 0,4 a un mililitro de sangre, generalmente en las ruedas.Realizar este procedimiento tendrá dificultades para obtener una muestra adecuada para sus experimentos. Por eso es muy importante realizarlo con cuidado, tal como se demuestra aquí. Para realizar la lavado, gire el ratón sobre su abdomen y rocíelo con etanol al 70 %.Luego, pellizque la piel aproximadamente a la mitad de la columna vertebral utilizando tijeras de disección que hayan sido esterilizadas con etanol al 70%. Haga una pequeña incisión a través de la piel. Sujete la piel en ambos lados de la incisión y tire en direcciones opuestas a lo largo del eje craneocaudal del ratón.Una vez expuestos los músculos y glándulas del cuello, corte cuidadosamente el tejido muscular. Luego, usando pinzas, tire del tejido hacia la parte anterior del ratón para exponer la laringe, la tráquea y el esófago.Evite cortar la vena yugular o la arteria carótida. La tráquea se identifica como el tejido con anillos cartilaginosos alrededor. Con la pinza, sujete delicadamente la tráquea y levántela con suavidad, separándola del esófago, que se encuentra en la cara dorsal.Llene una jeringa de un cc, equipada con un catéter tomcat, con PBS estéril. A continuación, en un ángulo de 45 grados, haga una pequeña incisión en la tráquea anterior a las pinzas, pero posterior a la laringe.Evite seccionar completamente la tráquea, lo que impediría que esta se retraiga dentro de la cavidad corporal. Con pinzas, sostenga la tráquea e inserte suavemente el catéter aproximadamente 20 milímetros dentro del sitio de incisión traqueal. Luego, sujete la tráquea que rodea el tubo del catéter para liberar la otra mano mientras realiza un masaje externo del tórax.Utilice una jeringa de un mililitro equipada con el catéter para infundir suavemente 0,75 mililitros de PBS estéril a temperatura ambiente en los pulmones. Luego aspire suavemente el PBS de regreso a la jeringa. Repita este proceso tres veces.Desconecte la jeringa del catéter y vierta el líquido de lavado en un tubo cónico de centrífuga de 15 mililitros. Llene la jeringa con 0,75 mililitros de PBS fresco, reconéctela al catéter y repita el lavado. La recuperación del líquido puede ser parcial, por lo que el volumen obtenido puede ser menor que el volumen infundido.Si se van a recolectar células de más de un ratón, coloque el tubo de 15 mililitros con las células recolectadas en hielo hasta que se hayan realizado todos los lavados pulmonares. Para enriquecer la población de macrófagos alveolares en las células recolectadas, centrifugue el líquido de lavado pulmonar a 250 ×g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius.Utilizando técnica estéril, vierta el sobrenadante en un recipiente adecuado para desechos dentro de una cabina de seguridad biológica. Resuspenda el botón celular agitando suavemente el tubo de centrífuga sobre la parte superior de un porta-tubos. Añada un mililitro de medio completo para macrófagos alveolares para resuspender las células y enumerarlas.Pipetee 20 microlitros de células en 10 mililitros de diluyente isotónico dos en un vial contador de cultivo. Añada tres a cuatro gotas de zog globina, reactivo lítico dos al vial e invierta suavemente tres a cuatro veces. A continuación, cargue el vial de muestra en un contador de partículas Colter Z uno contador.Asegúrese de programar el contador con un factor de dilución de dos por 10 a la cuarta para que muestre la concentración celular como número de células por mililitro. Una vez determinada la concentración celular, diluya las células a 2,5 por 10 a la quinta por mililitro con medio completo para macrófagos alveolares en un tubo de 15 mililitros. Luego, distribuya dos mililitros de la solución en cada pocillo de una placa de cultivo celular de seis pocillos.Para enriquecer los macrófagos alveolares, incube las placas de cultivo en un incubador humedecido a 37 grados Celsius con una atmósfera de 5%CO2 durante seis horas. Durante la incubación, los macrófagos se adherirán al fondo de la placa; tras la incubación, aspire suavemente el sobrenadante teniendo cuidado de no perturbar las células adheridas. Luego, enjuague los pocillos utilizando PBS estéril libre de calcio y magnesio.Para eliminar las células no adherentes y los restos celulares, añada dos mililitros de medio completo para macrófagos alveolares a cada uno. A continuación, incube las células a 37 grados Celsius durante la noche. Tras este paso de enriquecimiento, aproximadamente el 87 % de las células serán positivas para el marcador de macrófagos CD11b y F4/80.Una vez que se ha enriquecido la población de macrófagos alveolares, el siguiente paso del procedimiento consiste en agregar nanopartículas de polianhídrido fabricadas previamente mediante nanoencapsulación por antisolvente de polianhídrido. En este proceso, el polímero se disuelve en cloruro de metileno y se precipita en pentano. Pese la cantidad adecuada de nanopartículas de polianhídrido utilizando papel de filtro esterilizado.Aquí, se añaden 125 microgramos de partículas por cada mililitro de cultivo. Añada las partículas a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros, resuspenda los nanopartículas en la cantidad adecuada de medio completo para macrófagos alveolares frío con hielo y colóquelo en hielo. A continuación, esterilice la micropunta de un sonicador de banco.Rocíe con etanol al 70 % y limpie con una toallita estéril mientras mantiene el tubo en hielo. Someta a sonicación entre 10 y 20 julios durante 30 a 45 segundos. Observe macroscópicamente la suspensión de nanopartículas si las partículas no están suficientemente dispersas.Coloque la suspensión en hielo durante uno o dos minutos para asegurarse de que las nanopartículas estén por debajo de la temperatura de transición vítrea del polímero. Luego, someta nuevamente a sonicación durante 30 a 45 segundos. El objetivo del paso de sonicación es dispersar adecuadamente las nanopartículas como la etiqueta CCP 50 50.Las nanopartículas de CPH tienden a agregarse cuando se exponen a un entorno acuoso. Sin embargo, algunos agregados pequeños de nanopartículas pueden seguir presentes en la suspensión. La suspensión de nanopartículas debe mantenerse sobre hielo y utilizarse inmediatamente para evitar la erosión prematura de la superficie o la agregación.Retire las placas de cultivo que contienen los macrófagos alveolares del incubador y colóquelas en la cabina de seguridad biológica. Incline la placa teniendo cuidado de no perturbar las células adherentes A y aspire con pipeta la cantidad de medio que se añadirá a la suspensión de nanopartículas Vortex. Vortexe brevemente la suspensión de nanopartículas de polianhídrido y luego pipetee hasta 0,3 mililitros de la suspensión de nanopartículas en los pozos adecuados.Nuevamente, teniendo cuidado de no perturbar las células adheridas. Las partículas se depositarán en el fondo del pocillo y entrarán en contacto con las células. Continúe con los pocillos siguientes y los grupos de tratamiento deseados.Incluya grupos de control positivo y negativo, como medio únicamente y lipopolisacárido a 200 nanogramos por mililitro, en los pocillos designados, luego incube a 37 grados Celsius durante 48 horas. Tras la incubación, la activación alveolar puede evaluarse mediante citometría de flujo, como se describe en el documento adjunto.Los macrófagos alveolares se obtuvieron de ratones C 57 BL six y se enriquecieron según se describe en el artículo en video para evaluar la activación celular. Se añadieron 125 microgramos por mililitro de nanopartículas de polianhídrido 50 50 CPT CPH a cinco veces 10 a la quinta células por mililitro de macrófagos alveolares enriquecidos durante 48 horas. Luego se evaluó la expresión de los marcadores de macrófagos alveolares, MHC dos, CD 40, CD 86 y sire, mediante tinción con anticuerpos y citometría de flujo, como se puede observar en este histograma.Los macrófagos alveolares incubados con nanopartículas, indicados por la línea azul sólida, aumentaron la expresión en la superficie de MHC dos, una molécula necesaria para la presentación del antígeno a las células T CD cuatro, en comparación con aquellos no tratados con nanopartículas, como se esperaba. Se observaron niveles más bajos de tinción en los controles de fluorescencia menos uno (FMO), lo que indica que la señal observada no se debe a autofluorescencia. Los macrófagos alveolares incubados con nanopartículas, indicados por la línea azul sólida, potenciaron la expresión de CD 40, una molécula coestimuladora necesaria para la activación adecuada de las células T en comparación con las células no tratadas.La expresión de otra molécula coestimuladora de células T, CD86, también aumentó tras el tratamiento con nanopartículas de polianhídrido durante 48 horas. La expresión del receptor tipo lectina CYaC, que se une a motivos de carbohidratos presentes en la superficie de los patógenos, se ve altamente potenciada en macrófagos alveolares tras el tratamiento con nanopartículas de polianhídrido. Tras ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo realizar un lavado broncoalveolar con el fin de obtener macrófagos alveolares, cómo cultivar estas células y también cómo estimularlas para medir o evaluar la activación celular de dichas células mediante nanopartículas de polihidro.Al realizar este procedimiento, es importante utilizar técnicas de laboratorio estériles para evitar la contaminación de las células primarias que se están recolectando y para prevenir la introducción de contaminantes en los tratamientos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Un método para evaluar la capacidad de los macrófagos alveolares aislados de ratón para controlar el crecimiento de esporas de Aspergillus fagocitados por microscopía confocal.

La evaluación de la actividad anti-fúngica de aislados macrófagos alveolares por microscopía confocal

Las células de médula ósea cultivadas con factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) generan un cultivo heterogéneo que contiene macrófagos y células dendríticas (CD). Este método destaca el uso de la unión de MHCII e hialuronano (HA) para diferenciar los macrófagos de los DC en el cultivo de GM-CSF. Los macrófagos de este cultivo tienen muchas similitudes con los macrófagos alveolares.

Generación e identificación de GM-CSF Derivado alveolares-como los macrófagos y las células dendríticas A partir de médula ósea de ratones

Aquí describimos el modelo y el enfoque para estudiar las funciones de los macrófagos alveolares pulmonares en la metástasis del cáncer. Para demostrar el papel de estas células en la metástasis, se utilizó el modelo singénico (4T1) de cáncer de mama junto con la depleción de macrófagos alveolares con liposomas de clodronato.

El estudio de la función de los macrófagos alveolares en cáncer de mama metástasis

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Lavado broncoalveolar de los pulmones murinos para analizar infiltración de células inflamatorias

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Procesamiento de líquido de lavado broncoalveolar y sangre emparejada para macrófago alveolar y CD4+ inmunofenotipado de células T y evaluación del embalse de VIH

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Activación de los macrófagos alveolares murinos recolección y evaluación de celular inducida por nanopartículas polianhidrido

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