Aspiración Micropipeta de células adheridas a sustratos para estimar la rigidez Celular

El objetivo del siguiente experimento es analizar las propiedades viscoelásticas celulares bajo diferentes condiciones fisiológicas y patológicas. Esto se logra aplicando una presión negativa a la membrana celular mediante una micropipeta aass conectada a un transductor de presión que ha sido construido a partir de capilares de vidrio utilizando un tirador de micropipetas. La micropipeta se monta en un micromanipulador fino colocado sobre la platina de un microscopio invertido, y la punta de la micropipeta se acerca mucho a una célula.

A continuación, se crea un sello entre la punta de la pipeta y la membrana celular; luego, se mide la deformación de la membrana hacia el interior de la pipeta en respuesta a un paso aplicado de presión negativa. Se obtienen resultados que muestran los efectos de diferentes tratamientos sobre las propiedades biomecánicas celulares, basados en el grado de deformación de la membrana en respuesta a una fuerza bien definida. El objetivo de nuestro laboratorio es investigar el impacto de la dislipidemia en las propiedades biofísicas y biomecánicas de las células endoteliales vasculares, y hoy les vamos a presentar un método denominado aspiración con micropipeta, que utilizamos para medir la rigidez celular.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la comprensión básica de la biomecánica celular en múltiples mecanismos, como la angiogénesis, la detección mecánica y la migración, entre otros. Aunque este método puede proporcionar información sobre la biomecánica celular, también puede aplicarse a otros sistemas, como membranas modelo, orgánulos intracelulares o tejidos. Para visualizar la membrana celular y observar la proyección de la membrana dentro de la pipeta, las membranas celulares endoteliales vasculares se tiñen con un colorante fluorescente lipofílico.

Para comenzar, diluya el colorante stock a una concentración de trabajo con una solución de PBS calentada y someta la mezcla a sonicación durante cinco minutos para descomponer los agregados D. Tras una centrifugación de cinco minutos en la microcentrífuga, retire el sobrenadante y lave las células endoteliales vasculares agregando 0,5 mililitros de PBS. Después de cinco minutos, aspire la solución y continúe con dos lavados adicionales.

Luego, agregue la solución de tinción a las células e incube durante 30 minutos en un incubador a 37 grados Celsius. Tras la incubación, lave las células nuevamente con PBS como antes. Los micropipetas se fabrican calentando un capilar de vidrio en el centro.

Cuando el vidrio comienza a fundirse, las dos mitades del capilar se separan para generar dos micropipetas. Las puntas de las pipetas utilizadas en estos experimentos suelen tener entre dos y seis micrones de diámetro. El diámetro externo, dependiendo del tamaño de la célula, debe tener una forma que se asemeje a un tubo cilíndrico para comenzar a insertar el capilar de vidrio en el extractor de pipetas.

En esta demostración, se utiliza el tirador de pipetas horizontal Suter P 97 con un programa optimizado. Este tirador ofrece múltiples opciones programables para variar la velocidad y otros parámetros del tirado. Proceda a activar el programa de tirado.

Después de preparar cada micropipeta, verifique la forma de la punta bajo el microscopio. Después de pulir la punta con llama, llene la micropipeta con una solución salina fisiológica, como PBS o medio de crecimiento no fluorescente. Es importante que la solución se suplemente con 30% de suero, lo que permitirá que la membrana celular entre suavemente en la pipeta. En esta demostración, se utiliza un microscopio invertido fluorescente con capacidades de desconvolución 3D, junto con una cámara de video conectada a una computadora, un transductor de presión, una plataforma libre de vibraciones y un micromanipulador, para comenzar a montar las células en una cámara de aspiración micrométrica elevando las células desde sus sustratos y transfiriéndolas mediante pipeta a una cámara longitudinal poco profunda que está montada sobre el microscopio invertido fluorescente.

La razón para utilizar una cámara longitudinal poco profunda consiste en permitir que una micropipeta se acerque a las células en un ángulo muy pequeño, lo más cercano a lo horizontal posible. Esto se realiza para permitir que la membrana aspirada dentro de la micropipeta sea visualizada en un único plano de enfoque. Coloque una micropipeta llena en un porta-pipetas conectado a un transductor de presión mediante un tubo flexible, cuyo diámetro esté ajustado al conector del porta-pipetas para lograr un ajuste firme.

Al comienzo de cada experimento, se equilibra la presión en la pipeta con la presión atmosférica; coloque la pipeta en un micromanipulador que permita un control fino de los movimientos de la pipeta en el rango de micrones. Posicione la pipeta con un ángulo poco pronunciado respecto al fondo de la cámara y acerque la punta de la pipeta al centro del campo visual. El vástago de la pipeta, que es la parte cilíndrica de la punta de la pipeta en la cual se aspira la membrana, debe alinearse horizontalmente con el plano focal.

Para lograr esta primera posición, coloque la pipeta con el ángulo más pequeño posible y luego flexione el vástago de la pipeta contra el fondo de la cámara. Debido a que el vástago es muy delgado, es lo suficientemente flexible como para deslizarse por el fondo de la cámara al aproximarse a una célula. Baje lentamente la micropipeta hacia el costado de una célula individual utilizando el manipulador grueso hasta que esté cerca del plano de enfoque de la célula.

Luego, utilizando el manipulador fino, mueva la micropipeta hacia el borde de la célula hasta que la punta de la pipeta toque suavemente la membrana. Tome una imagen para observar la posición de la pipeta. Se forman buenos sellos cuando toda la punta de la pipeta está en contacto completo con la superficie celular y el contacto es estable.

A continuación, aplique un paso de presión negativa utilizando el transductor y manténgala hasta que la proyección de la membrana se estabilice. La cantidad de presión necesaria para aspirar la membrana dentro de la pipeta varía según el tipo celular y las condiciones experimentales específicas. La deformación inicial se observa típicamente al aplicar una presión en el rango de menos dos a menos 15 milímetros de mercurio.

Cuando se aplica la presión, la membrana se deforma gradualmente dentro de la pipeta hasta que se estabiliza a una longitud determinada. Un proceso que normalmente tarda de dos a tres minutos, durante el cual se requieren imágenes de la deformación de la membrana cada 30 segundos para seguir la progresión de la membrana que se introduce en la pipeta. Finalmente, aumente la presión al siguiente nivel en incrementos de dos a cinco milímetros de mercurio.

Repita todo el procedimiento hasta que la proyección de la membrana se desprenda de la célula y se mueva hacia el interior de la pipeta, momento en el cual se detiene el experimento. Para cuantificar el grado de deformación de la membrana, se mide la longitud aspirada desde la punta de la pipeta hasta el vértice de la circunferencia de la proyección de la membrana. Una pipeta más grande aplicará una mayor fuerza sobre la membrana celular al mismo nivel de presión, para tener en cuenta la variabilidad entre los diámetros de las pipetas.

La longitud aspirada se normaliza según el diámetro de la pipeta medido en cada experimento para validar el uso de la técnica de aspiración microscópica en células adheridas al sustrato; se comprobó mediante la interrupción de la actina F, lo que resulta en una disminución de la rigidez celular de las células endoteliales aórticas bovinas según lo estimado por este método. Aquí se muestra una serie típica de imágenes fluorescentes de una membrana endotelial sometida a una deformación progresiva en respuesta a la presión negativa aplicada a través de una micropipeta, tal como se esperaba. La membrana se aspira gradualmente dentro de la pipeta y la longitud aspirada aumenta como función del tiempo de la presión aplicada. Los cursos temporales de la deformación muestran que la interrupción de la actina F aumenta significativamente las longitudes aspiradas de las proyecciones bajo todas las condiciones de presión.

Mediante este enfoque, se descubrió que la rigidez celular aumenta cuando las membranas celulares se agotan de colesterol, mientras que el enriquecimiento con colesterol no tuvo efecto. Aquí se muestran una célula enriquecida con colesterol, una célula control y una célula desprovista de colesterol tras alcanzar longitudes máximas de aspiración de menos 15 milímetros de mercurio. Las proyecciones generalmente comenzaron a desarrollarse a menos 10 milímetros de mercurio, y se pudieron medir los tiempos de deformación de la membrana para presiones negativas de 10, 15 y 20 milímetros de mercurio.

Aquí, las longitudes máximas aspiradas se representan como una función de la presión aplicada. La longitud máxima normalizada en células agotadas fue significativamente menor que la de las células de control para presiones de menos 15 milímetros de mercurio y menos 20 milímetros de mercurio. La aplicación de presiones negativas superiores a 25 milímetros de mercurio provocó la separación de la proyección aspirada, formando un sle independiente.

El nivel de presión que provocó la separación de la membrana fue similar bajo diferentes condiciones de colesterol y constituye una observación inesperada. Como muestran estudios previos, el aumento del colesterol en la membrana mejora la rigidez de las bicapas lipídicas. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en dos o tres horas si se lleva a cabo correctamente. Al intentar esta técnica, es importante recordar que este experimento se realiza en células individuales.

Por lo tanto, se deben analizar de tres a cinco células por condición y por experimento, para un total de tres experimentos.