Aspiración Micropipeta de células adheridas a sustratos para estimar la rigidez Celular

El objetivo del siguiente experimento es analizar las propiedades viscoelásticas celulares bajo diferentes condiciones fisiológicas y patológicas. Esto se logra aplicando presión negativa a la membrana celular a través de una micropipeta aass conectada a un transductor de presión que se ha construido a partir de capilares de vidrio utilizando un extractor de micropipetas. La pipeta se monta en un micromanipulador fino colocado en una platina de un microscopio invertido, y la punta de la pipeta se acerca mucho a una célula.

A continuación, se crea un sello entre la punta de la pipeta y se mide la deformación de la membrana celular en la pipeta en respuesta a un paso aplicado de presión negativa. Se obtienen resultados que muestran los efectos de diferentes tratamientos sobre las propiedades biomecánicas celulares en función del grado de deformación de la membrana en respuesta a una fuerza bien definida. El impacto de nuestro laboratorio es investigar el impacto de la dislipidemia en las propiedades biofísicas y biomecánicas de las células endoteliales vasculares, y hoy os vamos a hablar de un método que se llama aspiración con micropipetas que utilizamos para medir la rigidez celular.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la comprensión básica de la biomecánica celular en múltiples mecanismos como la angiogénesis, la detección mecánica y la migración, entre otros. Aunque este método puede proporcionar información sobre la biomecánica celular, también se puede aplicar a otros sistemas, como membranas modelo, orgánulos intracelulares o tejidos. Para visualizar la membrana celular y observar la proyección de la membrana en la pipeta, las membranas celulares endoteliales vasculares se tiñen con un tinte fluorescente lipofílico.

Para comenzar, diluya el tinte original hasta una concentración de trabajo con una solución de PBS calentada, sonique la mezcla durante cinco minutos para descomponer los agregados D. Después de un centrifugado de cinco minutos en la microcentrífuga, retire las células endoteliales vasculares de lavado supinado agregando 0,5 mililitros de PBS. Pasados cinco minutos, aspirar la solución y proceder a lavar dos veces más.

Luego agregue la solución de dados a las celdas e incube durante 30 minutos y una incubadora a 37 grados centígrados. Después de la incubación, vuelva a lavar las células con PBS como antes. Las micropipetas se extraen calentando un capilar de vidrio en el medio.

Cuando el vidrio comienza a derretirse, las dos mitades del capilar se separan para generar dos micropipetas. Las puntas de las pipetas utilizadas en estos experimentos suelen oscilar entre dos y seis micras. El diámetro externo, dependiendo del tamaño de la célula, la forma de la punta debe aproximarse a un tubo cilíndrico para comenzar a insertar el capilar de vidrio en el extractor de pipetas.

En esta demostración, se utiliza el tirador de pipeta horizontal Suter P 97 con un programa optimizado. Este tirador ofrece múltiples opciones programables para variar la velocidad y otros parámetros del tirón. Proceda a activar el programa de extracción.

Después de tirar de cada micropipeta, verifique la forma de la punta bajo el microscopio Después de pulir la punta al fuego, llene la micropipeta con una solución salina fisiológica como PBS o medios de crecimiento no fluorescentes. Es importante destacar que la solución debe complementarse con un 30% de suero que permitirá que la membrana celular se mueva suavemente hacia la pipeta. En esta demostración, se utiliza un microscopio fluorescente invertido con capacidades de deconvolución 3D con una cámara de video conectada a una computadora, un transductor de presión, una estación libre de vibraciones y un micromanipulador para comenzar a montar células en una cámara de microaspiración levantando las células de sus sustratos y pipeteándolas en una cámara longitudinal poco profunda que está montada en el microscopio fluorescente invertido.

La razón para usar una cámara longitudinal poco profunda es permitir que una micropipeta se acerque a las celdas en un ángulo muy poco profundo lo más cerca posible de la horizontal. Esto se hace para permitir que la membrana introducida en la micropipeta se visualice en un solo plano de enfoque. Coloque una micropipeta llena en un soporte de pipeta conectado a un transductor de potencia mediante un tubo flexible, con un diámetro ajustado al conector del soporte de pipeta para un ajuste perfecto.

Al comienzo de cada experimento, la presión en la pipeta se equilibra con la presión atmosférica, monte la pipeta en un micromanipulador que permite un control preciso de los movimientos de la pipeta en el rango de micras. Coloque la pipeta en un ángulo poco profundo con respecto al fondo de la cámara y lleve la punta de la pipeta al centro del campo visual. El vástago de la pipeta, que es una parte cilíndrica de la punta de la pipeta en la que se aspira la membrana, debe estar alineado horizontalmente con el plano focal.

Para lograr esta primera posición, coloque la pipeta en el ángulo más profundo posible y, a continuación, flexione el vástago de la pipeta contra el fondo de la cámara. Debido a que el vástago es muy delgado, es lo suficientemente flexible como para deslizarse en el fondo de la cámara mientras se acerca a una celda. Baje lentamente la micropipeta hacia el lado de una sola célula utilizando el manipulador de curso hasta cerca del plano de enfoque de la célula.

A continuación, con el manipulador fino, mueva la micropipeta hasta el borde de la célula hasta que la punta de la pipeta toque suavemente la membrana. Tome una imagen para observar la posición de la pipeta. Se crean buenos sellos cuando toda la punta de la pipeta está en pleno contacto con la superficie de la célula y el contacto es estable.

A continuación, aplique un paso de presión negativa con el transductor y manténgalo hasta que se estabilice la proyección de la membrana. La cantidad de presión necesaria para aspirar la membrana en la pipeta varía según el tipo de célula y las condiciones experimentales específicas. La deformación inicial se observa típicamente cuando se aplica una presión en el rango de menos dos a menos 15 milímetros de mercurio.

Cuando se aplica la presión, la membrana se deforma gradualmente en la pipeta hasta que se estabiliza a una cierta longitud. Un proceso que normalmente tarda de dos a tres minutos durante este tiempo, se requieren imágenes de la deformación de la membrana cada 30 segundos para rastrear la progresión de la membrana que se introduce en la pipeta. Finalmente, aumente la presión al siguiente nivel en pasos de dos a cinco milímetros de mercurio.

Repita todo el procedimiento hasta que la proyección de la membrana se desprenda de la célula y pase a la pipeta, momento en el que se detiene el experimento. Para cuantificar el grado de deformación de la membrana, se mide la longitud aspirada desde la punta de la pipeta hasta el vértice de la circunferencia de la proyección de la membrana. Una pipeta más grande aplicará más fuerza sobre la membrana celular al mismo nivel de presión para tener en cuenta la variabilidad entre los diámetros de las pipetas.

La longitud aspirada se normaliza para el diámetro de la pipeta medido para cada experimento para validar el uso de la técnica de microaspiración para células adheridas al sustrato, se probó con una disrupción de la actina F que da como resultado una disminución en la rigidez celular de las células endoteliales aórticas bovinas según lo estimado por este enfoque. Aquí, se muestra una serie típica de imágenes fluorescentes de una membrana endotelial que sufre una deformación progresiva en respuesta a la presión negativa aplicada a través de una micropipeta, como se esperaba. La membrana se aspira gradualmente en la pipeta y la longitud aspirada aumenta en función de la presión aplicada, los cursos de tiempo de la deformación muestran que la interrupción de la acción aumenta significativamente las longitudes aspiradas de las proyecciones en todas las condiciones de presión.

Usando este enfoque, se descubrió que la rigidez celular aumenta cuando las membranas celulares se agotan de colesterol, mientras que el enriquecimiento del colesterol no tuvo ningún efecto. Aquí. Se muestra una célula enriquecida con colesterol, una célula de control y una célula sin colesterol después de alcanzar longitudes máximas de aspiración de menos 15 milímetros de mercurio. Por lo general, las proyecciones comenzaban a desarrollarse a menos 10 milímetros de mercurio, y las causas temporales de la deformación de la membrana podían medirse para las presiones negativas de 10, 15 y 20 milímetros de mercurio.

Aquí, las longitudes máximas aspiradas se trazan en función de la presión aplicada. La longitud máxima normalizada en las células agotadas fue significativamente menor que la de las células de control para presiones de menos 15 milímetros de mercurio y menos 20 milímetros de mercurio. La aplicación de presiones negativas por encima de 25 milímetros de mercurio dio lugar al desprendimiento de la proyección aspirada formando un sle separado.

El nivel de presión que resultó en el desprendimiento de la membrana fue similar en diferentes condiciones de colesterol y en observaciones inesperadas. Como muestran estudios anteriores, el aumento del colesterol de membrana mejora la rigidez de las bicapas lipídicas de membrana. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos o tres horas si se realiza correctamente. Al intentar esta técnica, es importante recordar que este experimento se realiza en células individuales.

Por lo tanto, se deben analizar de tres a cinco células por condición, por experimento para un total de tres experimentos en total.