Name: Una técnica de microscopía TIRF en tiempo real, imágenes simultáneas de la TCR y sus proteínas asociadas de señalización (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 10 s
Description: Aprende a rastrear eventos de señalización del receptor de células T mediante microscopía TIRF de adquisición simultánea de doble canal. Este método permite visualizar microclústeres de TCR y la dinámica de proteínas ZAP-70 en células T transfectadas.

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Esta investigación fue apoyada por la División de Investigación Intramural del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas, Institutos Nacionales de Salud. Estamos muy agradecidos a Juan Huppa y Mark Davis para que nos proporciona el scFv de H57 se utilizan en estos estudios. RV gustaría dar las gracias Keir Neumann útil para el debate durante el desarrollo de esta técnica.

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</ol>

Todos los animales utilizados en estos experimentos se mantuvieron en un libre de agentes patógenos medio ambiente, y los experimentos fueron aprobados por los Institutos Nacionales de Salud Animal y el empleo.

Se describe aquí un sistema de señalización en el estudio de antígenos específicos de células T primarios de ratón utilizando TIRFM vidrio y apoyadas bicapas lipídicas artificiales como vehículos blindados. La técnica se basa en las buenas prácticas agrarias con éxito la expresión de proteínas etiquetadas en estas células. Transfección de células T es siempre una tarea difícil. Típicamente, la entrega de electroporación o genes utilizando retrovirus o lentivirus se utilizan. Una técnica no es superior sobre el otro, ambos tienen sus limitaciones y ventajas. Encontramos que la electroporación tiene las siguientes ventajas: 1) No se requiere que las células se dividen activamente como se requiere para los retrovirus, pero no lentivirus, y 2) El nivel de expresión puede ser controlada mediante la variación del tiempo, las células se incuban antes de imágenes. El mayor inconveniente es que nos resulta muy difícil expresar las proteínas que son de gran tamaño en las células primarias. Hemos presentado un método que nos da la viabilidad celular muy bueno después de la electroporación. Como resultado, es serían aplicables-le a su utilización para lograr mediada por siRNA silenciamiento de los genes. También describe aquí un personalizado dos canales simultáneos microscopio TIRF adquisición que se cromáticamente corregida y no requiere alineación separado para diferentes longitudes de onda. Estas capacidades, sin embargo, están disponibles comercialmente. Nuestro sistema se basa en los principios de la microscopía TIRF publicado por expertos en la materia y es más barato que las alternativas comerciales. Una posible crítica de nuestro diseño es que estamos usando el mismo ángulo de incidencia para las longitudes de onda de excitación diferentes. Esto daría lugar a una profundidad de penetración diferente TIRF para longitudes de onda de excitación diferentes. Creemos que estos efectos son pequeños debido a que la onda evanescente es un campo de forma exponencial en descomposición y la profundidad del campo TIRF es una función lineal de longitud de onda. Fluoróforos cercanas a la superficie del vidrio experimentará ninguna diferencia en la intensidad de láser entre las dos longitudes de onda. Para fluoróforos cerca de la PEnetration profundidad, la diferencia de intensidad será 1,3 veces para las dos longitudes de onda 488 y 640 nm y plegado 1,15 para las dos longitudes de onda 488 nm y 561. El mismo sistema puede ser usado en conjunción con técnicas de resolución súper que hacen uso de iluminación TIRF. También se ha descrito un sistema de dos cámaras, que es hecha a la medida. Al igual que el sistema TIRF, aparatos similares también están disponibles comercialmente. Nuestro sistema ofrece flexibilidad para cambiar los filtros dicroicos y, lo que permite su uso con diferentes combinaciones de longitudes de onda. El inconveniente de nuestro sistema es el grado de una rotación necesaria para alinear las dos imágenes. Este problema se puede resolver mediante el uso de soportes de la cámara que se piezo impulsado y ofrecen grados de rotación de la alineación. También hemos aplicado con éxito un sistema de cámara dos en este microscopio, en la que las cámaras son diferentes y tienen diferentes tamaños de pixel. Un sistema como este podría ser útil si se necesita la sensibilidad en un canal y un gran dyrango dinámico en otro, los cuales rara vez están disponibles en la misma cámara. Se utilizó la Fotometría HQ-2 cámara en binning 2x2 que nos da un tamaño de píxeles efectivos de 12,9 m con la Fotometría Quant-EM cámara que tiene un tamaño de píxel de 16 micras. Un 180 mm de longitud focal de lente del tubo se utiliza para la Quant-EM y un 145 mm de longitud focal del objetivo tubo fue utilizado para la cámara HQ-2. El HQ-2 se controla mediante el software Metamorph y el Quant-EM se controla a través de software de micro-manager en un equipo distinto en el modo de disparo externo. El disparo externo se proporciona a la cámara Quant-EM con una salida digital de la medición a bordo del CAD de computación, que se llevó a cabo como un disparador adicional en la configuración de configure iluminación de Metamorph. La relación de las distancias focales de las lentes del tubo coincide con la proporción de los tamaños de pixel eficaces. Una alineación representativo se muestra en la Figura 5.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Amaxa nucleofector Kit de ratón las células T </td><td> Lonza Inc. </td><td> VPA-1006 </td><td></td></tr><tr><td> PureLink HiPure plásmido Kit Midiprep </td><td> Tecnologías de la Vida </td><td> K2100-05 </td><td> Para preparaciones de ADN libres de endotoxinas </td></tr><tr><td> Amaxa nucleofector dispositivo </td><td> Lonza Inc. </td><td> AAD-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Murina recombinante de IL-2 </td><td> Peprotech Inc. </td><td> 212-12 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoresbrite Multifluorescent microesferas 0.20μm </td><td> Polysciences, Inc. </td><td> 24050-5 </td><td></td></tr><tr><td> Lab-Tek II de 8 cámaras y cubre objetos </td><td> Thermo Scientific, Nunc </td><td> 155409 </td><td></td></tr></tbody></table>

una técnica de microscopía tirf en tiempo real, imágenes simultáneas de la tcr y sus proteínas asociadas de señalización

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

La señalización se inicia a través del receptor de la célula T (TCR) cuando se acopla con fragmentos de péptidos antigénicos unidos por complejo mayor de histocompatibilidad (pMHC) las proteínas expresadas en la superficie de las células presentadoras de antígeno (APC). El complejo TCR se compone del heterodímero ligando TCRαβ unión que asocia de forma no covalente con CD3 dímeros (los εδ y εγ heterodímeros y el homodímero ζζ) 1. Tras la participación del receptor, las cadenas ζ de CD3 se fosforilada por la quinasa de la familia Src, Lck. Esto conduce a la contratación de la familia Syk quinasa, Zap70, que luego se fosforila y activa por Lck. Después de eso, Zap70 fosforila el adaptador de proteínas LAT y SLP76, iniciando la formación del complejo de señalización proximal que contiene un gran número de diferentes moléculas de señalización 2. La formación de este complejo, finalmente, los resultados en calcio y TRA Ras-dependientenscription activación de los factores y la iniciación consecuente de una compleja serie de programas de expresión de genes que dan lugar a la diferenciación de células T 2. Señales (TCR y el estado resultante de la diferenciación) son modulados por otros muchos factores, incluyendo la potencia del antígeno y la diafonía con co-stimulatory/co-inhibitory, quimiocinas y receptores de citoquinas 3-4. El estudio de la organización espacial y temporal del complejo de señalización proximal en condiciones de estimulación diferentes, por lo tanto, clave para entender la vía de señalización del TCR, así como su regulación por otras vías de señalización. Uno de los sistemas modelo muy útil para estudiar la señalización iniciada por el TCR en la membrana plasmática de las células T es de cristal apoyados por bicapas de lípidos, como se describe anteriormente 5-6. Ellos pueden ser utilizados para presentar complejos antigénicos pMHC, adherencia, y moléculas co-estimuladoras a las células T-sirviendo como APCs artificiales. Por imágenes de las células T interactuar con elbicapa lipídica utilizando total de microscopía de fluorescencia interna reflexión (TIRFM), se puede restringir la excitación a 100 nm dentro del espacio existente entre el cristal y la superficie de la célula 7-8. Esto nos permite la imagen sobre todo los eventos de señalización que ocurren en la membrana plasmática. Como estamos interesados ​​en la imagen de la contratación de las proteínas de señalización del complejo TCR, se describe una de dos cámaras TIRF sistema de imagen en la que el TCR, marcado con fluorescente de Fab (fragmento de unión del antígeno) fragmentos del anticuerpo H57 (purificada a partir de hibridoma H57-597 , ATCC, número ATCC: HB-218) que es específico para TCRβ, y proteínas de señalización, marcado con GFP, pueden tomarse imágenes simultáneamente y en tiempo real. Esta estrategia es necesaria debido a la naturaleza altamente dinámica tanto de las células T y de los eventos de señalización que se están produciendo en el TCR. Esta técnica de imagen ha permitido a los investigadores a los ligandos de imágenes individuales 9-11, así como el reclutamiento de moléculas de señalización de los receptores activados yes un excelente sistema para estudiar la bioquímica in situ 12-16.

La compartimentación de las proteínas, ya sea dentro de la membrana plasmática o en lugares intracelulares es un mecanismo de regulación que pueden influir mucho en los resultados de señalización, por lo que, para comprender la señalización es importante estudiar el comportamiento espacial y temporal de las proteínas implicadas. Se describe aquí un sistema de microscopía TIRF base para estudiar la transducción de señal en las células T, pero es ampliamente aplicable.

Una técnica de microscopía TIRF en tiempo real, imágenes simultáneas de la TCR y sus proteínas asociadas de señalización

La señalización se inicia a través del receptor de células T (TCR) cuando este es activado por fragmentos de péptidos antigénicos unidos al complejo mayor de histocompatibilidad...

Este video describe un procedimiento para rastrear eventos de señalización del receptor de células T mediante la adquisición simultánea en dos canales. Primero, las células T se transfectan con un plásmido que codifica ZAP-70 marcado con GFP mediante microscopía de fluorescencia por reflexión interna total o microscopía TURF. Se prepara una bicapa lipídica soportada sobre vidrio, que incorpora un péptido anclado mediante lípidos, complejos peptídicos MHC, moléculas de adhesión y moléculas coestimuladoras.Las células T transfectadas con ZAP 70 se añaden a la bicapa cuando los receptores de células T se unen a complejos peptídicos de MHC. Las cadenas CD3 asociadas al receptor de células T son fosforiladas por la quinasa LCK de la familia SARC, y la quinasa ZAP 70 es reclutada desde el citoplasma. Luego, el receptor de células T se marca fluorescentemente y se realiza la imagen, en la que las células se sumergen en medio con un índice de refracción menor que el del cubreobjetos y se iluminan con un haz láser en un ángulo que experimenta reflexión interna total.Esto genera una onda evanescente en la interfaz entre el vidrio y el agua, que decae exponencialmente hacia el medio, permitiendo una profundidad de penetración de 100 a 200 nanómetros. Por lo tanto, solo se excitan los fluoróforos en la membrana plasmática o muy cercanos a ella. El análisis de las imágenes resultantes revela que la señalización tiene lugar en microagregados del receptor de células T.La principal ventaja de la microscopía TIRF o de la microscopía confocal convencional es que se obtiene una mejor resolución, de modo que los grupos de señalización o complejos de señalización, como los microgrupos del TCR, se visualizan fácilmente. Travis Crites y Chen, ambos postdoctorados en mi laboratorio, demostrarán cómo transfectar linfocitos T primarios de ratón utilizando la tecnología de nucleofección maxi y luego obtener imágenes mediante microscopía de fluorescencia por reflexión interna total o TIRF M, estimulados con una bicapa lipídica de vidrio recubierta con antígeno.Este método se ha utilizado ampliamente para estudiar la señalización en diversas células inmunitarias, incluidas las células T, células B, linfocitos asesinos naturales y células madre. El método es ampliamente aplicable y puede emplearse para estudiar la mayoría de los sistemas de receptores en células de mamíferos, especialmente si la señalización ocurre en grupos. Las personas nuevas en este método pueden tener dificultades inicialmente, ya que las células T son muy difíciles de transfectar.Además, se requiere una coordinación precisa para que la viabilidad de los linfocitos T y la eficiencia de transfección, la calidad del sello bilar y el alineamiento del microscopio estén a la altura adecuada. El primer paso de este procedimiento consiste en transfectar linfocitos T primarios, ya sean naïve o activados in vitro, con plásmidos de expresión que codifican moléculas de señalización marcadas con GFP, utilizando un kit nucleofector para linfocitos T de ratón AM maxa. Todos los linfocitos T utilizados en este estudio expresaban el A-N-D-T-C-R que reconoce el péptido MCC unido a la molécula MHC IE de K. El procedimiento de transfección aquí mostrado se lleva a cabo según las recomendaciones del fabricante.Sin embargo, se presentan algunas recomendaciones que favorecen la viabilidad de los linfocitos T tras la transfección. Tanto la viabilidad como la eficiencia de transfección son mayores en linfocitos T activados in vitro que en células naïve, y por ello, este protocolo utiliza linfocitos T activados in vitro antes de comenzar. Prepare dos mililitros de medio para linfocitos T suplementado por cada transfección mezclando 1,9 mililitros del medio proporcionado en el kit, 20 microlitros del componente A, 20 microlitros del componente B y 100 microlitros de suero bovino fetal en un tubo de dos mililitros.Transfiera dos mililitros de medio a cada pocillo de una placa de 12 pocillos. Coloque la placa en un incubador humedecido a 37 grados Celsius durante al menos una hora para permitir que el medio se equilibre; la muerte celular se producirá si se suspenden las células transfectadas en un medio frío o que no tenga un pH de 7,2. Para preparar la mezcla de transfección, combine 82 microlitros de solución nucleoefectora para linfocitos T de ratón con 18 microlitros del suplemento dos y cinco microgramos de ADN plasmídico libre de endotoxinas a una concentración no inferior a 0,5 microgramos por microlitro, mezclando bien mediante golpecitos.Transfiera de cinco a diez millones de células a un tubo cónico de 15 mililitros, centrifugue a 75 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Tras la centrifugación, utilice un aspirador al vacío para eliminar la mayor cantidad posible del sobrenadante y resuspenda el botón celular en la mezcla de transfección; aspire y expulse lentamente el botón celular tres o cuatro veces hasta que no queden grumos grandes de células. Utilizando una pipeta, transfiera cuidadosamente la suspensión a un vial Amaxa certificado, asegurándose de que no haya burbujas presentes.Tape el qve y seleccione el programa del efector nuclear X 0 0 1 en el dispositivo efector nuclear. Inserte el vete en el soporte Q vete y presione el botón para aplicar el programa seleccionado. Luego transfiera inmediatamente el vete y el medio de cultivo pre-equilibrado al flujo laminar.Utilizando la pipeta de plástico proporcionada, agregue aproximadamente 500 microlitros del medio previamente equilibrado al vete. Luego, agregue la suspensión celular al medio en la placa. Gota a gota.Incube las células a 37 grados Celsius durante cuatro horas para permitir una expresión baja de las proteínas marcadas con GFP y minimizar la aparición de artefactos por sobreexpresión. En esta sección, se describe un método para alinear el microscopio para la obtención de imágenes simultáneas en dos canales antes de encender todos los componentes del microscopio. Encienda la computadora y el software.Luego, asegúrese de que todos los componentes de hardware sean reconocidos por el software. Dado que el software se inicia sin mensajes de error, todos los componentes han sido detectados. Diluya un microlitro de subresolución.Dispersar las microesferas fluorescentes brillantes Flores en dos mililitros de PBS para usar como estándar de colocalización. A continuación, añadir 0,25 mililitros de la suspensión de microesferas a cada pocillo de un sistema de cubreobjetos con cámara de ocho pocillos de Lab Tech. Colocar el sistema de portaobjetos con cámara sobre la plataforma situada encima del objetivo.Luego, enfoque las perlas absorbidas en el vidrio en la vista previa en vivo. El panel izquierdo es el canal en el que serán visibles las células transfectadas con GFP. El panel derecho mostrará el TCR marcado durante los experimentos de imagen en células vivas.Utilizando la alineación Y del lanzamiento de fibra XY, Z, ajuste la posición del haz láser de manera que el haz salga por el objetivo y se proyecte sobre el techo. Es importante hacer esto cuando el objetivo está en la posición en la que el plano de vidrio está enfocado. Si el haz en el techo está difuso, el haz no está colimado.Ajuste el micrómetro Z para lograr una alineación completa para cada una de las líneas láser que se utilizarán en el experimento. Luego, utilizando un medidor de potencia láser, ajuste la potencia del láser a entre 20 y 30 microvatios para cada canal. Los linfocitos T son extremadamente sensibles a la radiación láser y la iluminación se limita a un total combinado de 50 microvatios.A continuación, ajuste el ángulo para el césped. Gire el micrómetro de alineación Y en el lanzamiento de la fibra para desplazar el haz lejos del techo hasta que su ángulo, con respecto al eje óptico del objetivo, se aproxime a 90 grados.Una vez que se alcanza el ángulo crítico para la reflexión interna total, la luz del láser ya no saldrá por el objetivo. Para evaluar si se logra el alineado del césped, enfoque hacia arriba y hacia abajo a través del plano del cubreobjetos. Observe aquí que, cuando los microesferas absorbidas a la superficie se desenfocan, pueden verse muchas microesferas flotando en la solución. Para lograr un buen alineado del césped, es necesario aumentar el ángulo del haz con respecto al objetivo.Al aumentar el ángulo del haz, las perlas que flotan cerca de la superficie comienzan a desaparecer y aumenta la intensidad de las perlas absorbidas en la interfase. Ahora, cuando las perlas agregadas y absorbidas en la interfase se sacan de foco, no quedan perlas visibles flotando en la solución. En este punto, el sistema está correctamente alineado, ya que solo las perlas que están absorbidas en la cubeta pueden estar en foco.A continuación, para alinear los canales fluorescentes rojo y verde entre sí, enfoque las perlas y compare la posición de características identificables en las imágenes producidas en ambos canales. Utilizando los tornillos micrométricos X e Y en uno de los soportes de cámara, acerque lo más posible la posición relativa de las perlas. Observe la perla brillante en el cuadrante inferior izquierdo de ambas imágenes para asegurar la alineación espacial entre los dos canales.Esta característica se lleva a la misma posición relativa en ambas imágenes. Capture y guarde la imagen de ambos canales. Estas imágenes se utilizarán como un estándar de colocalización para alinear los dos canales.Un ejemplo de esta alineación se observa aquí antes de la alineación. Uno de los canales está rotado con respecto al otro, como se muestra en esta imagen en la que se superponen las imágenes de los dos canales de las perlas de subresolución. Tras los ajustes, las imágenes se alinean como se muestra aquí.La calidad del alineamiento puede examinarse más a fondo comparando imágenes de células vivas transfectadas con GFP. Observe cómo los podios Laila de los dos canales están perfectamente alineados, tras alinear las dos imágenes utilizando la calibración establecida con las microperlas fluorescentes.Una vez que se ha configurado el microscopio, se preparan cámaras de flujo que contienen bicapas lipídicas soportadas sobre vidrio con antígenos presentes, y se realiza la técnica de alfombra (turf M) para visualizar primero las células T TRANSFECTADAS interactuando con el sustrato. Siguiendo el protocolo descrito por Ana y Dustin, ensamble una cámara de flujo con bicapas lipídicas planares formadas sobre un cubreobjetos de vidrio que contenga lípidos NI NTA, la molécula de adhesión ICAM uno y complejos péptido-MHC. Los IEFK cargados con MCC se incorporan en la bicapa mediante etiquetas de histidina.Se incorpora la molécula coestimuladora CD80. Utilizando un anclaje GPI, coloque la celda de flujo sobre la platina del microscopio y estabilícela sujetando la cámara a una placa adaptadora en la platina del microscopio mediante una barra de tensión para inmovilizarla. A continuación, conecte el elemento calefactor suministrado por el fabricante a la celda de flujo para controlar su temperatura.Coloque el objetivo sobre una bicapa y enfoque el plano de la bicapa para activar el calentamiento del objetivo y el interruptor de la celda de flujo; encienda los calentadores de la celda de flujo y del objetivo para llevar la temperatura de la cámara a 37 grados Celsius. Después de cuatro horas de incubación, transfiera los linfocitos T seccionados a un tubo de 15 mililitros y centrifugue a una velocidad de 80 veces G. Resuspenda las células en 300 microlitros de tampón H-B-S-B-S-A. A continuación, añada H 57 FAB o el fragmento variable de cadena simple H 57 para marcar el TCR hasta una concentración final de 10 microgramos por mililitro para el FAB o 20 microgramos por mililitro para el fragmento variable de cadena simple.Transfiera las células a un tubo cónico de cinco mililitros. A continuación, utilizando una jeringa de punta lisa de un mililitro, inyecte las células en la cámara de flujo a través de una válvula de tres vías. Configure las condiciones de adquisición de imágenes de modo que la adquisición en vivo de doble canal muestre una vista previa en tiempo real de los canales TCR y GFP, y localice un campo con células transfectadas.Debido a las diferencias de intensidad entre el TCR y la GFP, puede ser necesario ajustar la escala de las imágenes en tiempo real para que las células puedan visualizarse en ambos canales. Como es el caso aquí, confirme la iluminación del césped enfocando hacia el plano de vidrio para detectar cualquier tinción de la membrana lateral. Si las membranas laterales no entran en foco, entonces la alineación del césped es adecuada.En esta vista previa en vivo, la tinción de la membrana lateral es evidente tanto en el plano del cubreobjetos como cuando se desenfoca el cubreobjetos para alinear adecuadamente el microscopio con el césped. El ángulo del láser con respecto al objetivo aumenta y la membrana lateral se desenfoca. Comience a capturar imágenes individuales y secuencias de lapsos de tiempo con un intervalo de 10 segundos.Durante cinco minutos, las células se incubaron sobre bicapas soportadas de vidrio y de INTA que contenían seis moléculas por micrómetro cuadrado de péptido cargado, 100 moléculas por micrómetro cuadrado de IEFK con etiqueta His, 100 moléculas por micrómetro cuadrado de ICAM-1 con etiqueta His conjugada con Alexa 647 y 100 moléculas por micrómetro cuadrado de CD80 anclado mediante GPI. Se realizó microscopía TIRF de doble canal con adquisición simultánea en presencia continua del fragmento FAB H57 conjugado con Alexa 546.Para teñir las células TCR, se realizaron imágenes hasta una hora después del contacto inicial con la bicapa. El número de agrupaciones de ZAP-70 por célula se analizó mediante un software automatizado de conteo de agrupaciones. En cada caso, se analizaron al menos 40 células.Los péptidos cargados se indican en el recuadro. ICAM uno se refiere a células sobre bicapas que contienen 100 moléculas por micrómetro cuadrado de Alexa 6 4 7 conjugado. His marcado ICAM uno como se muestra en la figura, la señalización dependiente de zap 70 ocurre en microagregados de TCR y solo en respuesta a ligandos agonistas, como puede observarse en esta película, tomada a 10 segundos por cuadro.La señalización del TCR en respuesta a péptidos agonistas se mantiene mediante la generación continua de microagregados de TCR en la periferia del área de contacto, los cuales reclutan ZAP-70. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo transfectar linfocitos T primarios utilizando una tecnología de transfección nuclear maxa e imaginar adecuadamente el reclutamiento de moléculas señalizadoras GFP a los microagregados de TCR mediante microscopía TURB. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en siete horas si se lleva a cabo correctamente.Al realizar este procedimiento, es importante recordar ser muy cuidadoso con sus células primarias. Cuanto más sanas estén las células en cada paso del experimento, mayor será la eficiencia de transfección y mayor será el número de células que podrá capturar en sus imágenes. Los linfocitos T son altamente móviles y, como resultado, la adquisición secuencial de imágenes en los canales del TCR y GFP provoca que ambas imágenes no se alineen perfectamente debido al movimiento de los microgrupos del TCR y de las células.Para superar este problema, desarrollamos el microscopio TURF de adquisición simultánea de doble canal.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Reflexión interna total de fluorescencia (TIRF) microscopía es un enfoque poderoso para observar las estructuras cerca de la superficie celular en alto contraste y resolución temporal. Se demuestra cómo TIRF puede ser empleado para estudiar la dinámica de proteínas en la corteza de la pared celular-cerrados células bacterianas y fúngicas.

La visualización de la corteza organización y dinámica de los microorganismos, con total Microscopía de fluorescencia de reflexión interna

Este video describe TIRF, una técnica basada en microscopía de reflexión interna total para visualizar la dinámica de polimerización de actina y microtúbulos. El método permite obtener imágenes de alta resolución de la dinámica de acoplamiento de actina y microtúbulos en tiempo real, lo cual es esencial para comprender las diafonías celulares.

Microscopía TIRF para visualizar la dinámica de acoplamiento de actina y microtúbulos

Fuente: Daniele, F., et. al TIRFM y sondas GFP sensibles al pH para evaluar la dinámica de las vesículas de neurotransmisores en células de neuroblastoma SH-SY5Y: imágenes celulares y análisis de datos. J. vis. exp. (2015). Este video muestra la obtención de imágenes de células de neuroblastoma humano utilizando un microscopio de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) para visualizar vesículas sinápticas marcadas con fluoróforos. Las células se enfocan primero en modo de...

Obtención de imágenes celulares mediante microscopía de fluorescencia de reflexión interna total

Se describe un método de imágenes de células vivas que da una idea de la dinámica de proteínas durante el proceso de activación de células T. Se demuestra el uso combinado de la T-célula ensayo de difusión, microscopía confocal y análisis de imágenes para producir resultados cuantitativos para seguir la formación de complejos de señalización a través de la activación de células T.

En tiempo real de imágenes en vivo de las células T de señalización Formación de complejos

Este protocolo describe cómo utilizar la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total para visualizar y rastrear receptores individuales en la superficie de las células vivas y, por lo tanto, analizar la movilidad lateral del receptor, el tamaño de los complejos de receptores, así como para visualizar las interacciones transitorias receptor-receptor. Este protocolo puede extenderse a otras proteínas de membrana.

De alta resolución espacio-temporal Análisis de la Dinámica del receptor por Casa molécula de microscopía de fluorescencia

Endocitosis mediada por clatrina, un proceso rápido y altamente dinámico internaliza muchas proteínas, incluidos los receptores de señalización. El protocolo descrito aquí visualiza directamente la cinética de los eventos endocíticos individuales. Esto es esencial para comprender cómo los miembros centrales de la maquinaria endocítica se coordinan entre sí y cómo la carga de proteínas influye en este proceso.

Visualización de endocitosis mediada por clatrina de G receptores acoplados a proteínas en la Resolución Individual de eventos a través de TIRF de Microscopía

Este manuscrito describe cómo realizar ensayos basados en la Transferencia de Energía por Resonancia de Förster (FRET) (molécula única) para medir la dinámica de unión entre el receptor de antígeno de células T (TCR) y las moléculas MHC cargadas de péptidos antigénicos a medida que ocurren dentro de la sinapsis inmunológica de una célula T en contacto con una bicapa lipídica plana funcionalizada con soporte.

Medición de TCR-pMHC Encuadernación<em&gt; In Situ</em&gt; Usando un ensayo de microscopía basada en FRET

Etiquetar el dominio extracelular de una proteína de membrana con un fluoróforo sensible al pH, superecliptic pHluorin (SEP), permite la localización subcelular, la expresión y el tráfico que se determinen. proteínas de imágenes SEP-etiquetado con total de microscopía de fluorescencia de reflexión interna (TIRFM) permite la cuantificación de los niveles de proteína en el ER y la membrana plasmática periférica.

La utilización de receptores de etiquetado pHluorin de Seguimiento de localización subcelular y el Tráfico

Aquí, se presenta un ensayo de reconstitución in vitro basado en microscopía TIRF para cuantificar y comparar simultáneamente la dinámica de dos poblaciones de microtúbulos. Se describe un método para ver simultáneamente la actividad colectiva de múltiples proteínas asociadas a microtúbulos en haces de microtúbulos reticulados y microtúbulos individuales.

Visualización simultánea de la dinámica de microtúbulos reticulados y únicos in vitro mediante microscopía TIRF

Presentamos un protocolo para implementar la microscopía de interferencia-reflexión y la microscopía de reflexión-fluorescencia interna-total para la obtención simultánea de imágenes de microtúbulos dinámicos y proteínas asociadas a microtúbulos marcadas fluorescentemente.

Reflexión de interferencia simultánea y microscopía de fluorescencia de reflexión interna total para imágenes de microtúbulos dinámicos y proteínas asociadas

Este protocolo es una guía para visualizar actina dinámica y microtúbulos utilizando un ensayo de microscopía de fluorescencia interna total (TIRF) in vitro .

Visualización de la dinámica de acoplamiento de actina y microtúbulos in vitro mediante microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF)

Aprende a rastrear eventos de señalización del receptor de células T mediante microscopía TIRF de adquisición simultánea de doble canal. Este método permite visualizar microclústeres de TCR y la dinámica de proteínas ZAP-70 en células T transfectadas.

Una técnica de microscopía TIRF en tiempo real, imágenes simultáneas de la TCR y sus proteínas asociadas de señalización

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