Una técnica de microscopía TIRF en tiempo real, imágenes simultáneas de la TCR y sus proteínas asociadas de señalización

Este video describe un procedimiento para rastrear eventos de señalización del receptor de células T mediante la adquisición simultánea en dos canales. Primero, las células T se transfectan con un plásmido que codifica ZAP-70 marcado con GFP mediante microscopía de fluorescencia por reflexión total interna, o microscopía TIRF. Se prepara una bicapa lipídica soportada sobre vidrio, que incorpora péptidos anclados mediante lípidos, complejos de MHC, moléculas de adhesión y moléculas coestimuladoras.

Las células T transfectadas con ZAP 70 se añaden a la bicapa cuando los receptores de células T se unen a complejos peptídicos de MHC. Las cadenas CD3 asociadas al receptor de células T son fosforiladas por la quinasa LCK de la familia SARC, y la quinasa ZAP 70 es reclutada desde el citoplasma. Luego, el receptor de células T se marca fluorescentemente y se realiza la imagen, en la cual las células se sumergen en medio con un índice de refracción menor que el del cubreobjetos y se iluminan con un haz láser en un ángulo que experimenta reflexión interna total.

Esto genera una onda evanescente en la interfaz entre el vidrio y el agua, que decae exponencialmente hacia el medio, permitiendo una profundidad de penetración de 100 a 200 nanómetros. Por lo tanto, solo se excitan los fluoróforos en la membrana plasmática o muy cercanos a ella. El análisis de las imágenes resultantes revela que la señalización tiene lugar en microagregados del receptor de células T.

La principal ventaja de la microscopía TIRF o de la microscopía confocal convencional es que se obtiene una mejor resolución, de modo que los grupos de señalización o complejos de señalización, como los microgrupos del TCR, se visualizan fácilmente. Travis Crites y Chen, ambos postdoctorados en mi laboratorio, demostrarán cómo transfectar linfocitos T primarios de ratón utilizando la tecnología de nucleofección maxi y luego obtener imágenes mediante microscopía de fluorescencia por reflexión interna total o TIRF, tras estimularlos con una bicapa lipídica de vidrio que contiene antígeno.

Este método se ha utilizado ampliamente para estudiar la señalización en diversas células inmunitarias, incluidas las células T, células B, células asesinas naturales y células madre. El método es ampliamente aplicable y puede utilizarse para estudiar la mayoría de los sistemas de receptores en células de mamíferos, especialmente si la señalización ocurre en grupos. Las personas nuevas en este método pueden tener dificultades inicialmente, ya que las células T son muy difíciles de transfectar.

Además, se requiere una coordinación precisa para que la viabilidad de los linfocitos T y la eficiencia de transfección, la calidad del sello bilar, así como el alineamiento del microscopio, estén a la altura adecuada. El primer paso de este procedimiento consiste en transfectar linfocitos T primarios, ya sean naïve o activados in vitro, con plásmidos de expresión que codifican moléculas de señalización marcadas con GFP, utilizando un kit efector nucleofector para linfocitos T de ratón AM maxa. Todos los linfocitos T utilizados en este estudio expresaban el A-N-D-T-C-R que reconoce el péptido MCC unido a la molécula MHC IE de K. El procedimiento de transfección aquí mostrado se lleva a cabo según las recomendaciones del fabricante.

Sin embargo, se presentan algunas recomendaciones que favorecen la viabilidad de los linfocitos T tras la transfección. Tanto la viabilidad como la eficiencia de transfección son mayores en linfocitos T activados in vitro que en células naïve, y por ello, este protocolo utiliza linfocitos T activados in vitro antes de comenzar. Prepare dos mililitros de medio para linfocitos T suplementado por cada transfección combinando 1,9 mililitros del medio proporcionado en el kit, 20 microlitros del componente A, 20 microlitros del componente B y 100 microlitros de suero bovino fetal en un tubo de dos mililitros.

Transfiera dos mililitros de medio a cada pocillo de una placa de 12 pocillos. Coloque la placa en un incubador humedecido a 37 grados Celsius durante al menos una hora para permitir que el medio se equilibre; la muerte celular se producirá si se suspenden las células transfectadas en un medio frío o que no tenga un pH de 7,2. Para preparar la mezcla de transfección, combine 82 microlitros de solución nucleoefectora para linfocitos T de ratón con 18 microlitros del suplemento dos y cinco microgramos de ADN plasmídico libre de endotoxinas a una concentración no inferior a 0,5 microgramos por microlitro, mezclando bien mediante golpecitos.

Transfiera de cinco a diez millones de células a un tubo cónico de 15 mililitros, centrifugue a 75 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Tras la centrifugación, utilice un aspirador al vacío para eliminar la mayor cantidad posible del sobrenadante y luego resuspenda el botón celular en la mezcla de transfección; aspire lentamente el botón celular de tres a cuatro veces hasta que no queden grumos grandes de células. Utilizando una pipeta, transfiera cuidadosamente la suspensión a un vial Amaxa certificado, asegurándose de que no haya burbujas presentes.

Tape el qve y seleccione el programa efector nuclear X 0 0 1 en el dispositivo efector nuclear. Inserte el vete en el soporte Q vete y presione el botón para aplicar el programa seleccionado. Luego, transfiera inmediatamente el vete y el medio de cultivo pre-equilibrado al cabina.

Utilizando la pipeta de plástico proporcionada, agregue aproximadamente 500 microlitros del medio previamente equilibrado al vete. Luego, agregue la suspensión celular al medio en la placa. Gota a gota.

Incube las células a 37 grados Celsius durante cuatro horas para permitir una expresión baja de las proteínas marcadas con GFP y minimizar la aparición de artefactos por sobreexpresión. En esta sección, se describe un método para alinear el microscopio para la obtención de imágenes simultáneas en dos canales antes de encender todos los componentes del microscopio. Encienda la computadora y el software.

Luego, asegúrese de que todos los componentes de hardware sean reconocidos por el software. Dado que el software se inicia sin mensajes de error, todos los componentes han sido detectados. Diluya un microlitro de subresolución.

Dispersar las microesferas fluorescentes brillantes Flores en dos mililitros de PBS para usar como estándar de colocalización. A continuación, añadir 0,25 mililitros de la suspensión de microesferas a cada pocillo de un sistema de cubreobjetos con cámara de ocho pocillos de Lab Tech. Colocar el sistema de portaobjetos con cámara sobre la plataforma situada encima del objetivo.

Luego, enfoque las perlas absorbidas en el vidrio en la vista previa en vivo. El panel izquierdo es el canal en el que serán visibles las células transfectadas con GFP. El panel derecho mostrará el TCR marcado durante los experimentos de imagenología en células vivas.

Utilizando la alineación Y del lanzamiento de fibra XY, Z, ajuste la posición del haz láser de manera que el haz salga por el objetivo y se proyecte sobre el techo. Es importante hacer esto cuando el objetivo está en la posición en la que el plano de vidrio está enfocado. Si el haz en el techo está difuso, el haz no está colimado.

Ajuste el micrómetro Z para lograr una alineación completa para cada una de las líneas láser que se utilizarán en el experimento. Luego, utilizando un medidor de potencia láser, ajuste la potencia del láser a entre 20 y 30 microvatios para cada canal. Los linfocitos T son extremadamente sensibles a la radiación láser y la iluminación se limita a un total combinado de 50 microvatios.

A continuación, ajuste el ángulo para el césped. Gire el micrómetro de alineación Y en el lanzamiento de la fibra para desplazar el haz lejos del techo hasta que su ángulo, con respecto al eje óptico del objetivo, se aproxime a 90 grados.

Una vez que se alcanza el ángulo crítico para la reflexión interna total, la luz del láser ya no saldrá del objetivo. Para evaluar si se logra el alineamiento del césped, enfoque hacia arriba y hacia abajo a través del plano del cubreobjetos. Observe aquí que, cuando los microesferas absorbidas a la superficie salen del enfoque, pueden verse muchas microesferas flotando en la solución. Para lograr un buen alineamiento del césped, es necesario aumentar el ángulo del haz con respecto al objetivo.

A medida que aumenta el ángulo del haz, las perlas que flotan cerca de la superficie comienzan a desaparecer y aumenta la intensidad de las perlas absorbidas en la interfase. Ahora, cuando las perlas agregadas y absorbidas en la interfase se sacan del enfoque, no quedan visibles perlas flotando en la solución. En este punto, el sistema está correctamente alineado, ya que solo las perlas que están absorbidas en la cubreobjetivo pueden estar en foco.

A continuación, para alinear los canales fluorescentes rojo y verde entre sí, enfoque las perlas y compare la posición de características identificables en las imágenes producidas en ambos canales. Utilizando los tornillos micrométricos X e Y en uno de los soportes de cámara, acerque lo más posible la posición relativa de las perlas. Observe la perla brillante en el cuadrante inferior izquierdo de ambas imágenes para asegurar la alineación espacial entre los dos canales.

Esta característica se coloca en la misma posición relativa en ambas imágenes. Capture y guarde la imagen de ambos canales. Estas imágenes se utilizarán como un estándar de colocalización para alinear los dos canales.

Un ejemplo de esta alineación se observa aquí antes de la alineación. Uno de los canales está rotado con respecto al otro, como se muestra en esta imagen en la que se superponen las imágenes de los dos canales de las perlas de subresolución. Tras los ajustes, las imágenes quedan alineadas como se muestra aquí.

La calidad del alineamiento puede examinarse más a fondo comparando imágenes de células vivas transfectadas con GFP. Observe cómo los podios Laila de los dos canales están perfectamente alineados, tras alinear las dos imágenes utilizando la calibración establecida con las microperlas fluorescentes.

Una vez que se ha configurado el microscopio, se preparan cámaras de flujo que contienen bicapas lipídicas soportadas sobre vidrio con antígenos presentados y se realiza la técnica de alfombra (turf M) para visualizar primero las células T TRANSFECTADAS interaccionando con el sustrato. Siguiendo el protocolo descrito por Ana y Dustin, ensamble una cámara de flujo con bicapas lipídicas planas formadas sobre un cubreobjetos de vidrio que contenga lípidos NI NTA, la molécula de adhesión ICAM uno y complejos péptido-MHC. Los IEFK cargados con MCC se incorporan en la bicapa mediante etiquetas de histidina.

Se incorpora la molécula coestimuladora CD80. Utilizando un anclaje GPI, coloque la celda de flujo en la platina del microscopio y estabilícela sujetando la cámara a una placa adaptadora en la platina del microscopio mediante una barra de tensión para inmovilizarla. A continuación, conecte el elemento calefactor suministrado por el fabricante a la celda de flujo para controlar su temperatura.

Coloque el objetivo sobre una bicapa y enfoque el plano de la bicapa para activar el calentamiento del objetivo y el intercambio de flujo en la celda; encienda los calentadores de la celda de flujo y del objetivo para elevar la temperatura de la cámara a 37 grados Celsius. Tras cuatro horas de incubación, transfiera los linfocitos T seccionados a un tubo de 15 mililitros y centrifugue a una velocidad de 80 veces G. Re_suspenda las células en 300 microlitros de tampón H-B-S-B-S-A. A continuación, añada H 57 FAB o el fragmento variable de cadena sencilla H 57 para marcar el TCR hasta una concentración final de 10 microgramos por mililitro para el FAB o 20 microgramos por mililitro para el fragmento variable de cadena sencilla.

Transfiera las células a un tubo cónico de cinco mililitros. A continuación, utilizando una jeringa de punta lisa de un mililitro, inyecte las células en la cámara de flujo a través de una válvula de tres vías. Configure las condiciones de adquisición de imágenes para que la adquisición en vivo de doble canal muestre una vista previa en tiempo real de los canales TCR y GFP, y localice un campo con células transfectadas.

Debido a las diferencias de intensidad entre el TCR y la GFP, puede ser necesario ajustar la escala de las imágenes en tiempo real para que las células sean visibles en ambos canales. Como ocurre en este caso, confirme la iluminación del césped enfocando hacia el plano de vidrio para detectar cualquier tinción de la membrana lateral. Si las membranas laterales no entran en foco, entonces el alineamiento del césped es adecuado.

En esta vista previa en vivo, la tinción de la membrana lateral es evidente tanto en el plano del cubreobjetos como cuando se desenfoca el cubreobjetos para alinear adecuadamente el microscopio con el césped. El ángulo del láser con respecto al objetivo aumenta y la membrana lateral se desenfoca. Comience a capturar imágenes individuales y secuencias de lapsos de tiempo con un intervalo de 10 segundos.

Durante cinco minutos, las células se incubaron sobre bicapas soportadas en vidrio y en INTA que contenían seis moléculas por micrómetro cuadrado de péptido cargado, 100 moléculas por micrómetro cuadrado de IEFK con etiqueta His, 100 moléculas por micrómetro cuadrado de ICAM-1 etiquetada con His y conjugada con Alexa 647, y 100 moléculas por micrómetro cuadrado de CD80 anclado mediante GPI. Se realizó microscopía SIM de dos canales con adquisición simultánea en presencia continua del fragmento FAB H57 conjugado con Alexa 546.

Para teñir las células TCR, se realizaron imágenes hasta una hora después del contacto inicial con la bicapa. El número de agrupaciones de ZAP-70 por célula se analizó mediante un software automatizado de conteo de agrupaciones. En cada caso, se analizaron al menos 40 células.

Los péptidos cargados se indican en el recuadro. ICAM uno se refiere a células sobre bicapas que contienen 100 moléculas por micrómetro cuadrado de Alexa 6 4 7 conjugado. His marcado ICAM uno como se muestra en la figura, la señalización dependiente de zap 70 ocurre en microagregados de TCR y solo en respuesta a ligandos agonistas, como puede observarse en esta película, tomada a 10 segundos por cuadro.

La señalización del TCR en respuesta a péptidos agonistas se mantiene mediante la generación continua de microagregados de TCR en la periferia del área de contacto, los cuales reclutan ZAP-70. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo transfectar linfocitos T primarios utilizando una tecnología de transfección nuclear maxa e imaginar adecuadamente el reclutamiento de moléculas señalizadoras GFP a los microagregados de TCR mediante microscopía TURB. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en siete horas si se lleva a cabo correctamente.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar ser muy cuidadoso con sus células primarias. Cuanto más sanas estén las células en cada paso del experimento, mayor será la eficiencia de transfección y más células capturará en sus imágenes. Los linfocitos T son altamente móviles y, como resultado, la adquisición secuencial de imágenes en los canales TCR y GFP provoca que ambas imágenes no se alineen perfectamente debido al movimiento de los microgrupos de TCR y de las células.

Para superar este problema, desarrollamos el microscopio TURF de adquisición simultánea de doble canal.