Name: Un método paso a paso para la reconstitución de un transportador ABC en partículas lipídicas Nanodisc (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: Aprende a reconstituir el transportador ABC MalFGK2 en nanodiscos lipídicos mediante mezcla de proteínas scaffold, lípidos y cromatografía de filtración en gel. Este método permite estudiar proteínas de membrana en entornos solubles controlados.

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Este trabajo fue apoyado por el Instituto Canadiense de Investigación en Salud. CSC fue financiado por una beca postdoctoral de las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá. FD es un Tier II Cátedra de Investigación de Canadá.

<html> Proceso de reconstitución global El proceso de reconstitución se inicia mediante la mezcla de la proteína de membrana andamio (MSP) con el complejo purificado MalFGK 2 en presencia de solubilizadas en detergente fosfolípidos. El paso es seguido por la eliminación lenta del detergente por un material de poliestireno adsorbente llamado Bio-Beads o Amberlite (Figura 1). El proceso de auto-ensamblaje ocurre muy probablemente debido a las interacciones apolares entre los fosfolípidos hidrófobos, el complejo MalFGK 2 y la superficie de la proteína anfipática MSP. El producto final es una partícula discoide formado por dos moléculas de envolver alrededor de la MSP 2 MalFGK complejo. Las partículas se separan de los aductos y los agregados por ultra-centrifugación y cromatografía analítica de exclusión por tamaño. Las partículas se caracterizan por electroforesis en gel nativo y espectroscopia de dispersión de luz dinámica. título &quot;&gt; 1. preparación de la membrana andamio de proteínas, MSP <ol><li> El Su-etiquetados MSP (versión MSP1D1 1) se produce a partir pMSP1D1 plásmido en E. coli BL21 (DE3) indujo a una DO de 600 ~ 0,5 con 0,5 mM de isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido durante 3 horas a 37 ° C. </li><li> Las células se recogieron por centrifugación a 5.000 xg durante 10 min a 4 ° C y se resuspendieron en tampón que contenía TSG10 100 mM fluoruro de fenilmetanosulfonilo. </li><li> Las células se lisaron con una prensa francesa (3x) a 8.000 psi y el material insoluble se eliminó por centrifugación a 5.000 xg durante 10 min a 4 ° C. La fracción soluble que contiene el MSP se aísla por ultra-centrifugación a 125.000 xg durante 45 min. </li><li> El MSP se purifica mediante cromatografía de níquel quelante de uso de ~ 1,5 ml Ni Sepharose HP en TSG10 buffer. Los contaminantes se eliminan por lavado con TSG10 tampón que contiene 50 mM de imidazol. El MSP se eluye con tampón que contiene TSG10 600 mMimidazol. La proteína purificada se dializó en tampón TSG10 y almacenado en -70 º C a una concentración de proteína de ~ 10-15 mg / ml. </li></ol> 2. Preparación de la MalFGK 2 Complejo <ol><li> El MalFGK 2 compleja, su etiquetado en el extremo C-terminal de Malk, se expresa a partir del plásmido pBAD22-FGK en E. coli BL21 (DE3) y se indujo a una DO de 600 ~ 0,5 con 0,2% de L-arabinosa durante 3 horas a 37 ° C. </li><li> Después de la lisis celular y centrifugación como en el paso 1,3, el sedimento de membrana se resuspende en tampón TSG20 a una concentración final de 5 mg / ml. El material se solubiliza con w / v 1% de n-dodecil-β-maltopiranósido (DDM) durante 3 horas a 4 ° C con agitación suave. </li><li> El material insoluble se elimina por ultra-centrifugación como en el paso 1,3 y el sobrenadante que contiene el solubilizado 2 MalFGK complejo se recogió y se purificó como en el paso 1,4, pero sin diálisis. </li><li> Further purificación se realizó mediante cromatografía de filtración en gel en tampón TSGD en un Superdex 200 HR 10/300 columna a un caudal de 0,5 ml / min. </li></ol> 3. Preparación de fosfolípidos <ol><li> Una E. lípidos totales coli extracto disuelto en cloroformo se separó en alícuotas de 1.000 nmol en tubos de microcentrífuga tornillos de cabeza. El disolvente se evaporó bajo una corriente suave de nitrógeno y se secó adicionalmente durante una noche en un desecador a vacío. </li><li> La película de lípido se disuelve en tampón TS a una concentración de 5 nM final y vortex vigorosamente, y se sonicó. Los lípidos disueltos aparecerá ligeramente opaco debido a su insolubilidad en general en tampón TS acuoso, pero debe permanecer en suspensión. DDM se añade a una concentración final de 0,5% (~ 10 mM), en la que la solución se vuelva clara. </li><li> La mezcla de lípidos se coloca en un baño de agua y el pulso se sonicó durante 5 veces para ~ 5 seg. La mezcla de lípidos se almacenan a 4 ° C durante un máximo de 1 week. </li></ol> 4. Preparación de Bio-Beads <ol><li> Aproximadamente el 10-15 ml (volumen seco) Bio-Beads se coloca en un tubo de 50 ml. </li><li> Las perlas se lavaron sucesivamente con 50 ml de metanol al 100%, 95% de etanol, milliQ H 2 O, y finalmente tampón TS (dos veces cada uno). </li><li> Las perlas lavadas se almacenan a 4 ° C en tampón de ~ 10 ml de TS. </li></ol> 5. Nanodisc Reconstitución <ol><li> El MSP se diluye en tampón TSGD a la concentración final de ~ 7 mg / ml (~ 0,3 mM). </li><li> ~ 2 nmol de 2 purificado MalFGK complejo se mezclan a una proteína: MSP: lípido de 1:3:60 o 1:3:400 en tampón TSGD. La concentración final es de 6 micras MalFGK 2, 18 mM y lípidos MSP 360 micras (1:3:60) o 2,4 mM (lípidos 1:3:400). El volumen final es de 300 l. La concentración final de DDM es 0,08% (~ 1,6 mM). La concentración final de glicerol depende de la cantidad de lípido añadido, pero sigue siendo alrededor de 5-10% v / v </li&gt; <li> ~ 50 l de Bio-Bead suspensión se añadió al tubo y se incuba la mezcla durante toda la noche en un agitador a 4 º C. </li><li> Las perlas se sedimentan por gravedad y la solución se pipeteó a través de una punta estrecha para evitar en la medida Bio-Beads como sea posible. </li><li> Grandes precipitados se separan por ultra-centrifugación a 100.000 xg durante 20 min. Los discos se purificó por cromatografía de filtración en gel como en el paso 2,4 en TSG10 tampón. Las fracciones que contenían los discos se reúnen y una alícuota se vuelve a inyectar en la columna de filtración en gel mismo para probar la estabilidad de la preparación. </li><li> Los discos purificadas pueden almacenarse a -70 ° C durante un período prolongado de tiempo. Después de la descongelación en hielo, los discos debe ser sometido a ultra-centrifugación como en el paso 5,5 para eliminar el potencial de precipitados. Una alícuota se analizó por cromatografía de filtración en gel para garantizar que la agregación o precipitación significativa no se produjo durante la descongelaciónproceso. </li></ol> 6. Electroforesis en gel nativo <ol><li> 1 M de nanodiscos (~ 0,2 mg / ml) se analizan por PAGE nativa 6, 7 (Tris-HCl pH 8,8, 4-12%) para evaluar la calidad de la reconstitución (Figura 3A). </li><li> La unión de macho (1 M) a la 2-complejo MalFGK reconstituyó en nanodiscos también es evaluado por nativo-PAGE (Figura 3A). </li><li> Después de la electroforesis, el gel se tiñe con azul de Coomassie durante 10 min, y se decoloró durante ~ 1 hr. </li></ol> 7. Dispersión de luz dinámica (DLS) <ol><li> Nanodiscos se purificó por cromatografía de filtración en gel como en el paso 2,4 en TSG10 tampón utilizando un Superdex 200 HR 10/300 columna a un caudal de 0,1 ml / min. Las fracciones que contenían nanodiscos se reúnen y se concentran a ~ 10 mg / ml con un filtro Amicon centrífuga. </li><li> La muestra se filtra dos veces (0,22 micras filtro) antes del análisis por DLS utilizandoun instrumento DynaPro NANOSTAR (Wyatt Technology) en un volumen de 1 l cubeta de cuarzo interno. Los datos se ajustaron usando el software de dinámica (Wyatt Technology) para estimar el diámetro y el peso molecular de las partículas. </li></ol> 8. ATPasa Medidas <ol><li> La actividad de ATPasa de MalFGK 2-reconstituidas nanodiscos se determina mediante un ensayo colorimétrico 8. </li><li> 1 M de discos purificadas y 1 mM de ATP se mezclan con cantidades crecientes de MalE y se incubaron a 37 ° C durante 20 min. La liberación de fosfato inorgánico se midió a 660 nm. </li><li> La cantidad de fosfato liberado se comparó con una curva estándar generada con una solución estándar de fósforo. </li></ol> 9. Los resultados representativos Los nanodiscos se purificó por cromatografía de filtración en gel (Figura 2A, izquierda). El cromatograma muestra que la mayoría de la reconstituida dISCS (negro traza) se eluyen como un solo pico, mientras que los discos hechos con exceso de lípidos (curva roja) eluyen en el volumen vacío y como una serie de picos anchos. La calidad de los nanodiscos se analiza adicionalmente por electroforesis en gel nativo y espectroscopia de dispersión de luz dinámica (DLS). Reconstituidos correctamente los discos migran como una banda fuerte en el gel mientras que los reconstituida en presencia de un exceso de lípidos migrar como frotis (Figura 2A, derecha). El análisis por DLS muestra que la población disco es homogéneo con un diámetro medio de 11,4 nm (Figura 2B). Los discos reconstituidas tienen un peso molecular aparente de 215 kDa basado en la aproximación DLS. Las muestras reconstituidas en la presencia de exceso de lípidos de visualización ampliamente distribuido radios alrededor de 100 nm, que es típico de las muestras no homogéneas. La calidad de la MalFGK 2 complejo se evaluó por electroforesis en gel nativo y su actividad por ATPasalas mediciones (Figura 3). El macho proteína de unión a maltosa se ​​une con una afinidad alta a la MalFGK 2 transportador 9, 10. Utilizando electroforesis no desnaturalizante en gel, es posible detectar un complejo entre el macho y MalFGK 2 (Figura 3A). La estimulación de la actividad de la ATPasa MÄLK 2 por MalE se muestra en la Figura 3B. <img src="/files/ftp_upload/3910/3910fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Diagrama de flujo típico para el protocolo de reconstitución. <img src="/files/ftp_upload/3910/3910fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Control de calidad de la preparación nanodisc. A. Análisis de filtración en gel (Superdex 200 HR 10 / columna de 300) de los nanodiscos reconstituido en relación baja en lípidos (01/03/60; trazo negro) o la relación de lípido alta (1/3/400; trazo rojo). Electroforesis en gel nativo de la preparación del disco mismo. Molecular marcadores de peso en kDa se indican. B. La luz dinámica de análisis de dispersión de la preparación de un mismo disco. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3910/3910fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . <img src="/files/ftp_upload/3910/3910fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Análisis de la MalFGK 2-nanodisc partículas. A. Análisis Gel cambio de MalE incubaron con cantidades crecientes de MalFGK 2 nanodisc partículas. B. actividad ATPasa de la MalFGK 2-nanodisc partículas como una función de la concentración masculina.

<ol><li>Denisov, I. G., Ginkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+self-assembly+of+monodisperse+phospholipid+bilayer+Nanodiscs+with+controlled+size%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 3477-3487 (2004).</li>
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<li>Zhang, X. X., Chan, C. S., Bao, H., Fang, Y., Foster, L. J., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanodiscs+and+SILAC-based+mass+spectrometry+to+identify+a+membrane+protein+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Nanodiscs and SILAC-based mass spectrometry to identify a membrane protein interactome.</a> J. Proteome Res. , Forthcoming (2011).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Se describe un procedimiento sencillo para la reconstitución del transportador de maltosa en nanodiscos. El transportador es ATPasa activa y la interacción con el macho pareja de unión soluble puede ser recreada (Figura 3). La reconstitución exitosa del transportador en nanodiscos abrir el camino para un análisis adicional biofísica y bioquímica. De particular interés será el análisis sistemático de la ATPasa y la actividad Malk maltosa transporte en el detergente, liposomas y nanodiscos. Transportadore...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-4 50K filtro centrífugo </td><td> Millipore </td><td> UFC805008 </td><td> Seguir el protocolo del fabricante para el uso apropiado </td></tr><tr><td> Bio-Beads SM-2 Adsorbente </td><td> Bio-Rad </td><td> 152-3920 </td><td></td></tr><tr><td> E. coli lípidos totales </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 100500C </td><td> Disuelto en cloroformo, según sea apropiado para manejar un disolvente orgánico </td></tr><tr><td> Ni Sepharose HP resina </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5268-01 </td><td></td></tr><tr><td> Fósforo solución estándar </td><td>Sigma-Aldrich </td><td> P3869 </td><td></td></tr><tr><td> pMSP1D1 </td><td> Addgene </td><td> 20061 </td><td></td></tr><tr><td> Superdex 200 HR 10/300 </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5172-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabla I. Los reactivos específicos. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Composición </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> DDM acciones </td><td> 10% w / v DDM </td><td> Volver a suspender en agua MilliQ y se almacena a -20 ° C </td></tr><tr><td> MalFGK 2 stock </td><td> 1-2 mg / ml 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v / v de glicerol 0,03% w / v DDM </td><td> Almacenar a -70 ° C después de la purificación </td></tr><tr><td> MSP acciones </td><td> 10-15 mg / ml 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v / v de glicerol </td><td> Almacenar a -70 ° C después de la purificación en &lt;alícuotas de 1 ml y evitar excesivos ciclos descongelación / congelación </td></tr><tr><td> Fosfolípidos acciones </td><td> 5 nM E. coli total de lípidos 0,5% w / v (10 mM) DDM 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 50 mM NaCl </td><td> Almacenar a 4 ° C durante 1 semana </td></tr><tr><td> TS búfer </td><td> 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 50 mM NaCl </td><td> Almacenar a 4 ° C </td></tr><tr><td> TSG10 búfer </td><td> 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v / v de glicerol </td><td> Almacenar a 4 ° C </td></tr><tr><td> TSG20 búfer </td><td> 50 mM Tris-HCl, pH 8 100 mM NaCl 20% v / v de glicerol </td><td> Almacenar a 4 ° C </td></tr><tr><td> TSGD búfer </td><td> 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v / v de glicerol 0,03% w / v DDM </td><td> Almacenar a 4 ° C y se añade justo antes de utilizar DDM </td></tr><tr><td colspan="3"> Tabla II. Recetas de soluciones. </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

un método paso a paso para la reconstitución de un transportador abc en partículas lipídicas nanodisc

A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles

El nanodisc es una partícula discoidal (~ 10-12 nm grande) que las proteínas de membrana trampa en un pequeño parche de doble capa de fosfolípidos. El nanodisc es una opción particularmente atractiva para el estudio de proteínas de membrana, especialmente en el contexto de las interacciones ligando-receptor. El método por primera vez por Sligar y colegas se basa en las propiedades anfipáticas de una ingeniería altamente a-helicoidal andamio de proteínas derivadas de la apolipoproteína A1. Las caras hidrófobas de la proteína andamio interactúan con los de acilo graso cadenas laterales de la bicapa de lípido, mientras que las regiones polares frente al entorno acuoso. Los análisis de proteínas de membrana en nanodiscos tienen ventajas significativas sobre liposoma porque las partículas son pequeñas, homogéneas y solubles en agua. Además, los métodos bioquímicos y biofísicos normalmente reservados para las proteínas solubles se pueden aplicar, y desde ambos lados de la membrana. En este protocolo visual, se presenta una reconstitución paso a paso de un carácter bienracterizado ABC transportador bacteriano, el macho-2 MalFGK complejo. La formación del disco es un proceso de auto-ensamblaje que depende de las interacciones hidrofóbicas que tienen lugar durante la eliminación progresiva del detergente. Se describen los pasos esenciales y se destaca la importancia de elegir una correcta proteína-lípido con el fin de limitar la formación de agregados y partículas más grandes de liposomas como polidispersos. Calidad simples controles, tal como cromatografía de filtración en gel, electroforesis en gel nativo y la espectroscopia de dispersión de luz dinámica asegurar que los discos han sido correctamente reconstituido.

Nanodiscos son pequeñas partículas discoidales que incorporan proteínas de membrana en un pequeño parche de doble capa de fosfolípidos. Proporcionamos un protocolo visual que muestra la incorporación paso a paso del transportador de MalFGK2 en un disco.

Un método paso a paso para la reconstitución de un transportador ABC en partículas lipídicas Nanodisc

The nanodisc is a discoidal particle (~ 10-12 nm large) that trap membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. The nanodisc is a ...

El objetivo general de este procedimiento es incorporar un transportador A, b, C. En este caso, el transportador de maltosa malf GK dos en partículas solubles de nanodiscos de membrana. Esto se logra primero mezclando la proteína de andamio de membrana MSP, con el transportador y la cantidad correcta de lípidos en micelas de detergente.El segundo paso consiste en agregar perlas de poliestireno y agitar suavemente la mezcla durante la noche; el detergente se absorbe progresivamente sobre las perlas, lo que permite la formación de las partículas de nanodiscos. A continuación, las perlas se eliminan por sedimentación. El paso final es separar los discos correctamente formados de los agregados y de las proteínas andamio no ensambladas mediante cromatografía de filtración en gel. Finalmente, la calidad de los discos se evalúa mediante electroforesis en gel nativo o espectroscopía de dispersión de luz. La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos como los liposomas es que las proteínas de membrana y los discos son perfectamente solubles en solución acuosa. Además, los dominios proteicos ahora son accesibles desde ambos lados.Dado que ahora ya no existe un compartimento de

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Investigación

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Biología

Se describen procedimientos para la reconstitución completa de un canal de potasio dependiente de voltaje prototipo en las membranas lipídicas. Los canales reconstituidas son adecuadas para los ensayos bioquímicos, grabaciones eléctricas, detección ligando y estudios de cristalografía de electrones. Estos métodos pueden tener aplicaciones generales a los estudios estructurales y funcionales de otras proteínas de membrana.

La reconstitución de un canal Kv en las membranas lipídicas de Estudios estructurales y funcionales

Bicapas lipídicas soportadas y partículas de membrana naturales son sistemas convenientes que pueden aproximarse a las propiedades de las membranas celulares y ser incorporadas en una gran variedad de estrategias de análisis. Aquí se demuestra un método para preparar compuestos de microarrays de soportados de lípidos de la bicapa recubiertos de SiO 2 perlas, vesículas de fosfolípidos o partículas de membrana naturales.

Formación de biomembrana Microarrays con un método basado en la Asamblea Rasero

Muchas proteínas realizan su función cuando se unen a las superficies de las membranas. La unión de proteínas extrínsecas en membranas de nanodiscos se puede obtener indirectamente mediante microscopía electrónica de transmisión. Demostramos que el apilamiento característico (rouleau) de los nanodiscos inducido por la tinción negativa de fosfotungstato de sodio se previene mediante la unión de proteínas extrínsecas.

Método para visualizar y analizar de membrana Interactuando Proteínas por Microscopía Electrónica de Transmisión

Apoyo sólido, libre de proteína, dobles membranas de bicapa de fosfolípidos (DLBM) pueden transformarse en redes de nanotubos de lípidos complejos y dinámicos y pueden servir como modelos 2D de abajo hacia arriba del retículo endoplasmático.

Formación espontánea y cambio de redes de nanotubos lipídica Artificial como un modelo Bottom-Up de retículo endoplasmático

La fusión mitocondrial es una reacción homeostática importante subyacente a la dinámica mitocondrial. Aquí se describe un sistema de reconstitución in vitro para estudiar la fusión de membrana interna mitocondrial que puede resolver el anclaje de membrana, acoplamiento, hemisfusión y apertura de poros. Se discute la versatilidad de este enfoque en la exploración de los sistemas de membrana celular.

Una plataforma de membrana modelo para la reconstitución de la dinámica de membrana mitocondrial

Este protocolo describe la formación de bicapas lipídicas soportadas y la adición de filamentos citoesqueléticos y proteínas motoras para estudiar la dinámica de las redes citoesqueléticas reconstituidas y atadas a la membrana utilizando microscopía de fluorescencia.

Reconstitución de corticidades mínimas de actina atadas a la membrana en bicapas lipídicas soportadas

En este manuscrito, demostramos las técnicas experimentales para encapsular el citoesqueleto de actina F en vesículas lipídicas unilamelares gigantes (también llamadas liposomas), y el método para formar una capa de actina F que imita la corteza en la valva interna de la membrana liposómica.

In vitro Reconstitución del citoesqueleto de actina dentro de vesículas unilamelares gigantes

La reconstitución libre de células ha sido una herramienta clave para comprender el ensamblaje del citoesqueleto, y el trabajo en la última década ha establecido enfoques para estudiar la dinámica de la septina en sistemas mínimos. Aquí se presentan tres métodos complementarios para observar el ensamblaje de la septina en diferentes contextos de membrana: bicapas planas, soportes esféricos y soportes de varilla.

Reconstitución del ensamblaje de septina en membranas para estudiar propiedades y funciones biofísicas

Este protocolo describe una configuración para la cristalización del transportador de esteroles ABCG5/G8. ABCG5/G8 se reconstituye en biceles para la cristalización en gotas colgantes. El protocolo no requiere materiales ni sustratos especializados, por lo que es accesible y fácil de adaptar en cualquier laboratorio para la determinación de la estructura de la proteína mediante cristalografía de rayos X.

Cristalización ABCG5/G8 en un entorno de bicelas lipídicas para cristalografía de rayos X

Presentamos un protocolo para la reconstitución de proteínas de membrana y encapsulación de enzimas y otros componentes solubles en agua en vesículas lipídicas de tamaño submicrométrico y micrométrico.

Construcción de redes metabólicas fuera de equilibrio en vesículas de tamaño nanométrico y micrométrico

Este estudio describe el procedimiento para reconstituir el canal K+ sensible a ácidos relacionado con la proteína de membrana TWIK (Task2) en nanodiscos. El ensamblaje exitoso fue confirmado mediante crio-microscopía electrónica de partícula única, que proporcionó promedios bien definidos de clase bidimensionales.

Una técnica para estabilizar proteínas de membrana en nanodiscos

Aprende a reconstituir el transportador ABC MalFGK2 en nanodiscos lipídicos mediante mezcla de proteínas scaffold, lípidos y cromatografía de filtración en gel. Este método permite estudiar proteínas de membrana en entornos solubles controlados.

Un método paso a paso para la reconstitución de un transportador ABC en partículas lipídicas Nanodisc

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