Name: Un método paso a paso para la reconstitución de un transportador ABC en partículas lipídicas Nanodisc (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: Aprende a reconstituir el transportador ABC MalFGK2 en nanodiscos lipídicos mediante mezcla de proteínas scaffold, lípidos y cromatografía de filtración en gel. Este método permite estudiar proteínas de membrana en entornos solubles controlados.

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Este trabajo fue apoyado por el Instituto Canadiense de Investigación en Salud. CSC fue financiado por una beca postdoctoral de las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá. FD es un Tier II Cátedra de Investigación de Canadá.

<html> Proceso de reconstitución global El proceso de reconstitución se inicia mediante la mezcla de la proteína de membrana andamio (MSP) con el complejo purificado MalFGK 2 en presencia de solubilizadas en detergente fosfolípidos. El paso es seguido por la eliminación lenta del detergente por un material de poliestireno adsorbente llamado Bio-Beads o Amberlite (Figura 1). El proceso de auto-ensamblaje ocurre muy probablemente debido a las interacciones apolares entre los fosfolípidos hidrófobos, el complejo MalFGK 2 y la superficie de la proteína anfipática MSP. El producto final es una partícula discoide formado por dos moléculas de envolver alrededor de la MSP 2 MalFGK complejo. Las partículas se separan de los aductos y los agregados por ultra-centrifugación y cromatografía analítica de exclusión por tamaño. Las partículas se caracterizan por electroforesis en gel nativo y espectroscopia de dispersión de luz dinámica. título &quot;&gt; 1. preparación de la membrana andamio de proteínas, MSP <ol><li> El Su-etiquetados MSP (versión MSP1D1 1) se produce a partir pMSP1D1 plásmido en E. coli BL21 (DE3) indujo a una DO de 600 ~ 0,5 con 0,5 mM de isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido durante 3 horas a 37 ° C. </li><li> Las células se recogieron por centrifugación a 5.000 xg durante 10 min a 4 ° C y se resuspendieron en tampón que contenía TSG10 100 mM fluoruro de fenilmetanosulfonilo. </li><li> Las células se lisaron con una prensa francesa (3x) a 8.000 psi y el material insoluble se eliminó por centrifugación a 5.000 xg durante 10 min a 4 ° C. La fracción soluble que contiene el MSP se aísla por ultra-centrifugación a 125.000 xg durante 45 min. </li><li> El MSP se purifica mediante cromatografía de níquel quelante de uso de ~ 1,5 ml Ni Sepharose HP en TSG10 buffer. Los contaminantes se eliminan por lavado con TSG10 tampón que contiene 50 mM de imidazol. El MSP se eluye con tampón que contiene TSG10 600 mMimidazol. La proteína purificada se dializó en tampón TSG10 y almacenado en -70 º C a una concentración de proteína de ~ 10-15 mg / ml. </li></ol> 2. Preparación de la MalFGK 2 Complejo <ol><li> El MalFGK 2 compleja, su etiquetado en el extremo C-terminal de Malk, se expresa a partir del plásmido pBAD22-FGK en E. coli BL21 (DE3) y se indujo a una DO de 600 ~ 0,5 con 0,2% de L-arabinosa durante 3 horas a 37 ° C. </li><li> Después de la lisis celular y centrifugación como en el paso 1,3, el sedimento de membrana se resuspende en tampón TSG20 a una concentración final de 5 mg / ml. El material se solubiliza con w / v 1% de n-dodecil-β-maltopiranósido (DDM) durante 3 horas a 4 ° C con agitación suave. </li><li> El material insoluble se elimina por ultra-centrifugación como en el paso 1,3 y el sobrenadante que contiene el solubilizado 2 MalFGK complejo se recogió y se purificó como en el paso 1,4, pero sin diálisis. </li><li> Further purificación se realizó mediante cromatografía de filtración en gel en tampón TSGD en un Superdex 200 HR 10/300 columna a un caudal de 0,5 ml / min. </li></ol> 3. Preparación de fosfolípidos <ol><li> Una E. lípidos totales coli extracto disuelto en cloroformo se separó en alícuotas de 1.000 nmol en tubos de microcentrífuga tornillos de cabeza. El disolvente se evaporó bajo una corriente suave de nitrógeno y se secó adicionalmente durante una noche en un desecador a vacío. </li><li> La película de lípido se disuelve en tampón TS a una concentración de 5 nM final y vortex vigorosamente, y se sonicó. Los lípidos disueltos aparecerá ligeramente opaco debido a su insolubilidad en general en tampón TS acuoso, pero debe permanecer en suspensión. DDM se añade a una concentración final de 0,5% (~ 10 mM), en la que la solución se vuelva clara. </li><li> La mezcla de lípidos se coloca en un baño de agua y el pulso se sonicó durante 5 veces para ~ 5 seg. La mezcla de lípidos se almacenan a 4 ° C durante un máximo de 1 week. </li></ol> 4. Preparación de Bio-Beads <ol><li> Aproximadamente el 10-15 ml (volumen seco) Bio-Beads se coloca en un tubo de 50 ml. </li><li> Las perlas se lavaron sucesivamente con 50 ml de metanol al 100%, 95% de etanol, milliQ H 2 O, y finalmente tampón TS (dos veces cada uno). </li><li> Las perlas lavadas se almacenan a 4 ° C en tampón de ~ 10 ml de TS. </li></ol> 5. Nanodisc Reconstitución <ol><li> El MSP se diluye en tampón TSGD a la concentración final de ~ 7 mg / ml (~ 0,3 mM). </li><li> ~ 2 nmol de 2 purificado MalFGK complejo se mezclan a una proteína: MSP: lípido de 1:3:60 o 1:3:400 en tampón TSGD. La concentración final es de 6 micras MalFGK 2, 18 mM y lípidos MSP 360 micras (1:3:60) o 2,4 mM (lípidos 1:3:400). El volumen final es de 300 l. La concentración final de DDM es 0,08% (~ 1,6 mM). La concentración final de glicerol depende de la cantidad de lípido añadido, pero sigue siendo alrededor de 5-10% v / v </li&gt; <li> ~ 50 l de Bio-Bead suspensión se añadió al tubo y se incuba la mezcla durante toda la noche en un agitador a 4 º C. </li><li> Las perlas se sedimentan por gravedad y la solución se pipeteó a través de una punta estrecha para evitar en la medida Bio-Beads como sea posible. </li><li> Grandes precipitados se separan por ultra-centrifugación a 100.000 xg durante 20 min. Los discos se purificó por cromatografía de filtración en gel como en el paso 2,4 en TSG10 tampón. Las fracciones que contenían los discos se reúnen y una alícuota se vuelve a inyectar en la columna de filtración en gel mismo para probar la estabilidad de la preparación. </li><li> Los discos purificadas pueden almacenarse a -70 ° C durante un período prolongado de tiempo. Después de la descongelación en hielo, los discos debe ser sometido a ultra-centrifugación como en el paso 5,5 para eliminar el potencial de precipitados. Una alícuota se analizó por cromatografía de filtración en gel para garantizar que la agregación o precipitación significativa no se produjo durante la descongelaciónproceso. </li></ol> 6. Electroforesis en gel nativo <ol><li> 1 M de nanodiscos (~ 0,2 mg / ml) se analizan por PAGE nativa 6, 7 (Tris-HCl pH 8,8, 4-12%) para evaluar la calidad de la reconstitución (Figura 3A). </li><li> La unión de macho (1 M) a la 2-complejo MalFGK reconstituyó en nanodiscos también es evaluado por nativo-PAGE (Figura 3A). </li><li> Después de la electroforesis, el gel se tiñe con azul de Coomassie durante 10 min, y se decoloró durante ~ 1 hr. </li></ol> 7. Dispersión de luz dinámica (DLS) <ol><li> Nanodiscos se purificó por cromatografía de filtración en gel como en el paso 2,4 en TSG10 tampón utilizando un Superdex 200 HR 10/300 columna a un caudal de 0,1 ml / min. Las fracciones que contenían nanodiscos se reúnen y se concentran a ~ 10 mg / ml con un filtro Amicon centrífuga. </li><li> La muestra se filtra dos veces (0,22 micras filtro) antes del análisis por DLS utilizandoun instrumento DynaPro NANOSTAR (Wyatt Technology) en un volumen de 1 l cubeta de cuarzo interno. Los datos se ajustaron usando el software de dinámica (Wyatt Technology) para estimar el diámetro y el peso molecular de las partículas. </li></ol> 8. ATPasa Medidas <ol><li> La actividad de ATPasa de MalFGK 2-reconstituidas nanodiscos se determina mediante un ensayo colorimétrico 8. </li><li> 1 M de discos purificadas y 1 mM de ATP se mezclan con cantidades crecientes de MalE y se incubaron a 37 ° C durante 20 min. La liberación de fosfato inorgánico se midió a 660 nm. </li><li> La cantidad de fosfato liberado se comparó con una curva estándar generada con una solución estándar de fósforo. </li></ol> 9. Los resultados representativos Los nanodiscos se purificó por cromatografía de filtración en gel (Figura 2A, izquierda). El cromatograma muestra que la mayoría de la reconstituida dISCS (negro traza) se eluyen como un solo pico, mientras que los discos hechos con exceso de lípidos (curva roja) eluyen en el volumen vacío y como una serie de picos anchos. La calidad de los nanodiscos se analiza adicionalmente por electroforesis en gel nativo y espectroscopia de dispersión de luz dinámica (DLS). Reconstituidos correctamente los discos migran como una banda fuerte en el gel mientras que los reconstituida en presencia de un exceso de lípidos migrar como frotis (Figura 2A, derecha). El análisis por DLS muestra que la población disco es homogéneo con un diámetro medio de 11,4 nm (Figura 2B). Los discos reconstituidas tienen un peso molecular aparente de 215 kDa basado en la aproximación DLS. Las muestras reconstituidas en la presencia de exceso de lípidos de visualización ampliamente distribuido radios alrededor de 100 nm, que es típico de las muestras no homogéneas. La calidad de la MalFGK 2 complejo se evaluó por electroforesis en gel nativo y su actividad por ATPasalas mediciones (Figura 3). El macho proteína de unión a maltosa se ​​une con una afinidad alta a la MalFGK 2 transportador 9, 10. Utilizando electroforesis no desnaturalizante en gel, es posible detectar un complejo entre el macho y MalFGK 2 (Figura 3A). La estimulación de la actividad de la ATPasa MÄLK 2 por MalE se muestra en la Figura 3B. <img src="/files/ftp_upload/3910/3910fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Diagrama de flujo típico para el protocolo de reconstitución. <img src="/files/ftp_upload/3910/3910fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Control de calidad de la preparación nanodisc. A. Análisis de filtración en gel (Superdex 200 HR 10 / columna de 300) de los nanodiscos reconstituido en relación baja en lípidos (01/03/60; trazo negro) o la relación de lípido alta (1/3/400; trazo rojo). Electroforesis en gel nativo de la preparación del disco mismo. Molecular marcadores de peso en kDa se indican. B. La luz dinámica de análisis de dispersión de la preparación de un mismo disco. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3910/3910fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . <img src="/files/ftp_upload/3910/3910fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Análisis de la MalFGK 2-nanodisc partículas. A. Análisis Gel cambio de MalE incubaron con cantidades crecientes de MalFGK 2 nanodisc partículas. B. actividad ATPasa de la MalFGK 2-nanodisc partículas como una función de la concentración masculina.

<ol><li>Denisov, I. G., Ginkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+self-assembly+of+monodisperse+phospholipid+bilayer+Nanodiscs+with+controlled+size%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 3477-3487 (2004).</li>
<li>Boldog, T., Grimme, S., Li, M., Sligar, S. G., Hazelbauer, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanodiscs+separate+chemoreceptor+oligomeric+states+and+reveal+their+signaling+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Nanodiscs separate chemoreceptor oligomeric states and reveal their signaling properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 11509-11514 (2006).</li>
<li>Bass, B. J., Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homotropic+cooperativity+of+monomeric+cytochrome+P450+3A4+in+a+nanoscale+native+bilayer+environment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Homotropic cooperativity of monomeric cytochrome P450 3A4 in a nanoscale native bilayer environment.</a> J. Biol. Chem. 282, 7066-7076 (2007).</li>
<li>Alami, M., Dalal, K., Lelj-Garolla, B., Sligar, S. G., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanodiscs+unravel+the+interaction+between+the+SecYEG+channel+and+its+cytosolic+partner+SecA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Nanodiscs unravel the interaction between the SecYEG channel and its cytosolic partner SecA.</a> EMBO J. 26, 1995-2004 (2007).</li>
<li>Mi, L. -Z., Grey, M. J., Nishida, N., Walz, T., Lu, C., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+structural+stability+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+in+detergent+micelles+and+phospholipid+nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Functional and structural stability of the epidermal growth factor receptor in detergent micelles and phospholipid nanodiscs.</a> Biochemistry. 47, 10314-10323 (2008).</li>
<li>Schägger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal. Biochem. 217, 220-230 (1994).</li>
<li>Dalal, K., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+SecY+translocon+in+Nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the SecY translocon in Nanodiscs.</a> Methods Mol. Biol. 619, 145-156 (2010).</li>
<li>Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+assay+for+nanomole+amounts+of+inorganic+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate.</a> Anal. Biochem. 100, 95-97 (1979).</li>
<li>Davidson, A. L., Dassa, E., Orelle, C., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+function+and+evolution+of+bacterial+ATP-binding+cassette+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Structure, function and evolution of bacterial ATP-binding cassette systems.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 72, 317-364 (2008).</li>
<li>Bordignon, E., Grote, M., Schneider, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maltose+ATP-binding+cassette+transporter+in+the+21st+century-towards+a+structural+dynamic+perspective+on+its+mode+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The maltose ATP-binding cassette transporter in the 21st century-towards a structural dynamic perspective on its mode of action.</a> Mol. Microbiol. 77, 1354-1366 (2010).</li>
<li>Alvarez, F. J., Orelle, C., Davidson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+reconstitution+of+an+ABC+transporter+for+use+in+electron+paramagnetic+resonance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Functional reconstitution of an ABC transporter for use in electron paramagnetic resonance spectroscopy.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 9513-9515 (2010).</li>
<li>Ritchie, T. K., Grinkova, Y. V., Bayburt, T. H., Denisov, I. G., Zolnerciks, J. K., Atkins, W. M., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+in+phospholipid+bilayer+Nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins in phospholipid bilayer Nanodiscs.</a> Methods Enzymol. 464, 211-231 (2009).</li>
<li>Glück, J. M., Koenig, B. W., Willbold, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanodiscs+allow+the+use+of+integral+membrane+proteins+as+analytes+in+surface+plasmon+resonance+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Nanodiscs allow the use of integral membrane proteins as analytes in surface plasmon resonance studies.</a> Anal. Biochem. 408, 46-52 (2011).</li>
<li>Wan, C. -P. L., Chiu, M. H., Wu, X., Lee, S. K., Prenner, E. J., Weers, P. M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein-induced+conversion+of+phosphatidylcholine+bilayer+vesicles+into+nanodisks%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta+%28BBA%29%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein-induced conversion of phosphatidylcholine bilayer vesicles into nanodisks.</a> Biochim. Biophys. Acta (BBA). 1808, 606-613 (2011).</li>
<li>Nath, A., Trexler, A. J., Koo, P. K., Miranker, A. D., Atkins, W. M., Rhoades, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+fluorescence+spectroscopy+using+phospholipid+bilayer+Nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule fluorescence spectroscopy using phospholipid bilayer Nanodiscs.</a> Methods Enzymol. 472, 89-117 (2010).</li>
<li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochromes+P450+in+Nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Cytochromes P450 in Nanodiscs.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1814, 223-229 (2011).</li>
<li>Zhang, X. X., Chan, C. S., Bao, H., Fang, Y., Foster, L. J., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanodiscs+and+SILAC-based+mass+spectrometry+to+identify+a+membrane+protein+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Nanodiscs and SILAC-based mass spectrometry to identify a membrane protein interactome.</a> J. Proteome Res. , Forthcoming (2011).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Se describe un procedimiento sencillo para la reconstitución del transportador de maltosa en nanodiscos. El transportador es ATPasa activa y la interacción con el macho pareja de unión soluble puede ser recreada (Figura 3). La reconstitución exitosa del transportador en nanodiscos abrir el camino para un análisis adicional biofísica y bioquímica. De particular interés será el análisis sistemático de la ATPasa y la actividad Malk maltosa transporte en el detergente, liposomas y nanodiscos. Transportadore...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-4 50K filtro centrífugo </td><td> Millipore </td><td> UFC805008 </td><td> Seguir el protocolo del fabricante para el uso apropiado </td></tr><tr><td> Bio-Beads SM-2 Adsorbente </td><td> Bio-Rad </td><td> 152-3920 </td><td></td></tr><tr><td> E. coli lípidos totales </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 100500C </td><td> Disuelto en cloroformo, según sea apropiado para manejar un disolvente orgánico </td></tr><tr><td> Ni Sepharose HP resina </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5268-01 </td><td></td></tr><tr><td> Fósforo solución estándar </td><td>Sigma-Aldrich </td><td> P3869 </td><td></td></tr><tr><td> pMSP1D1 </td><td> Addgene </td><td> 20061 </td><td></td></tr><tr><td> Superdex 200 HR 10/300 </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5172-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabla I. Los reactivos específicos. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Composición </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> DDM acciones </td><td> 10% w / v DDM </td><td> Volver a suspender en agua MilliQ y se almacena a -20 ° C </td></tr><tr><td> MalFGK 2 stock </td><td> 1-2 mg / ml 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v / v de glicerol 0,03% w / v DDM </td><td> Almacenar a -70 ° C después de la purificación </td></tr><tr><td> MSP acciones </td><td> 10-15 mg / ml 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v / v de glicerol </td><td> Almacenar a -70 ° C después de la purificación en &lt;alícuotas de 1 ml y evitar excesivos ciclos descongelación / congelación </td></tr><tr><td> Fosfolípidos acciones </td><td> 5 nM E. coli total de lípidos 0,5% w / v (10 mM) DDM 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 50 mM NaCl </td><td> Almacenar a 4 ° C durante 1 semana </td></tr><tr><td> TS búfer </td><td> 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 50 mM NaCl </td><td> Almacenar a 4 ° C </td></tr><tr><td> TSG10 búfer </td><td> 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v / v de glicerol </td><td> Almacenar a 4 ° C </td></tr><tr><td> TSG20 búfer </td><td> 50 mM Tris-HCl, pH 8 100 mM NaCl 20% v / v de glicerol </td><td> Almacenar a 4 ° C </td></tr><tr><td> TSGD búfer </td><td> 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v / v de glicerol 0,03% w / v DDM </td><td> Almacenar a 4 ° C y se añade justo antes de utilizar DDM </td></tr><tr><td colspan="3"> Tabla II. Recetas de soluciones. </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

un método paso a paso para la reconstitución de un transportador abc en partículas lipídicas nanodisc

A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles

El nanodisc es una partícula discoidal (~ 10-12 nm grande) que las proteínas de membrana trampa en un pequeño parche de doble capa de fosfolípidos. El nanodisc es una opción particularmente atractiva para el estudio de proteínas de membrana, especialmente en el contexto de las interacciones ligando-receptor. El método por primera vez por Sligar y colegas se basa en las propiedades anfipáticas de una ingeniería altamente a-helicoidal andamio de proteínas derivadas de la apolipoproteína A1. Las caras hidrófobas de la proteína andamio interactúan con los de acilo graso cadenas laterales de la bicapa de lípido, mientras que las regiones polares frente al entorno acuoso. Los análisis de proteínas de membrana en nanodiscos tienen ventajas significativas sobre liposoma porque las partículas son pequeñas, homogéneas y solubles en agua. Además, los métodos bioquímicos y biofísicos normalmente reservados para las proteínas solubles se pueden aplicar, y desde ambos lados de la membrana. En este protocolo visual, se presenta una reconstitución paso a paso de un carácter bienracterizado ABC transportador bacteriano, el macho-2 MalFGK complejo. La formación del disco es un proceso de auto-ensamblaje que depende de las interacciones hidrofóbicas que tienen lugar durante la eliminación progresiva del detergente. Se describen los pasos esenciales y se destaca la importancia de elegir una correcta proteína-lípido con el fin de limitar la formación de agregados y partículas más grandes de liposomas como polidispersos. Calidad simples controles, tal como cromatografía de filtración en gel, electroforesis en gel nativo y la espectroscopia de dispersión de luz dinámica asegurar que los discos han sido correctamente reconstituido.

Nanodiscos son pequeñas partículas discoidales que incorporan proteínas de membrana en un pequeño parche de doble capa de fosfolípidos. Proporcionamos un protocolo visual que muestra la incorporación paso a paso del transportador de MalFGK2 en un disco.

Un método paso a paso para la reconstitución de un transportador ABC en partículas lipídicas Nanodisc

The nanodisc is a discoidal particle (~ 10-12 nm large) that trap membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. The nanodisc is a ...

El objetivo general de este procedimiento es incorporar un transportador A, b, C. En este caso, el transportador de maltosa malf GK dos en partículas solubles de nanodiscos de membrana. Esto se logra primero mezclando la proteína de andamio de membrana MSP, con el transportador y la cantidad correcta de lípidos en micelas de detergente.El segundo paso consiste en agregar perlas de poliestireno y agitar suavemente la mezcla durante la noche; el detergente se absorbe progresivamente sobre las perlas, lo que permite la formación de las partículas de nanodiscos. A continuación, las perlas se eliminan por sedimentación. El paso final es separar los discos correctamente formados de los agregados y de las proteínas andamio no ensambladas mediante cromatografía de filtración en gel. Finalmente, la calidad de los discos se evalúa mediante electroforesis en gel nativo o espectroscopía de dispersión de luz. La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos como los liposomas es que las proteínas de membrana y los discos son perfectamente solubles en solución acuosa. Además, los dominios proteicos ahora son accesibles desde ambos lados.Dado que ahora ya no existe un compartimento de membrana, utilizando proteínas de andamiaje de membrana de diferentes longitudes, pude atrapar y estudiar los diferentes estados conformacionales de las proteínas de membrana. Lo más importante es que este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del proteómica de membrana, como la identificación de nuevos socios de unión de los transportadores a, b, C. De hecho, las implicaciones de esta técnica se extienden aún más hacia la terapia, ya que pueden ayudar al descubrimiento de activadores o inhibidores de proteínas y receptores de membrana.Aunque este método parece sencillo, debe tenerse precaución al elegir la proporción correcta de proteínas y lípidos. Por lo general, las personas nuevas en este método tienen dificultades para calcular la proporción molar correcta o para realizar los controles adecuados que aseguren la calidad de la preparación. Por lo tanto, una demostración visual de este método es muy útil para que un estudiante principiante aprenda los diversos pasos y las dificultades potenciales.Para comenzar, exprese la MSP con etiqueta de hexa-histidina en la cepa de E. coli BL21(DE3) a partir del plásmido pMSSP1D. Induzca la producción de proteína cuando la densidad óptica medida a 600 nanómetros sea aproximadamente 0,5 durante tres horas a 37 grados Celsius. Recoga las células mediante centrifugación a 5.000 ×g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Re suspenda el precipitado en tampón TSG10 que contiene 100 micromolares de PMSF. Lice las células con una prensa francesa tres veces a 8.000 PSI. Elimine el material insoluble mediante centrifugación a 5.000 ×g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. A continuación, aísle la fracción soluble que contiene la MSP mediante ultracentrifugación a 125.000 ×g durante 45 minutos.Purifique la MSP mediante cromatografía de afinidad al níquel utilizando aproximadamente 1.5 mililitros de níquel seros de alto rendimiento en tampón TSG 10. Lave los contaminantes con tampón TSG 10 que contiene 50 milimolares de ILE. Eluya la MSP con tampón TSG 10 que contiene 600 milimolares de I midaz tras la diálisis.La proteína purificada en el tampón TSG 10 MSP se puede almacenar a menos 70 grados Celsius y una concentración de proteína de aproximadamente 10 a 15 miligramos por mililitro. El complejo MALF GK dos, con etiqueta His en el extremo C de MAL K, se expresa a partir del plásmido. PED 22 FG K cultivado en la cepa de E. coli BL 21 DE tres, induce la producción de proteína cuando la densidad óptica medida a 600 nanómetros es de aproximadamente 0,5 con 0,2 %L Arabos durante tres horas a 37 grados Celsius tras la lisis celular y la centrifugación.Como antes, suspendemos el sedimento de membrana en tampón TSG 20 hasta una concentración final de cinco miligramos por mililitro. A continuación, solubilizamos el material con GDM al 1% peso por volumen durante tres horas a cuatro grados Celsius con agitación suave. Eliminamos el material insoluble mediante ultracentrifugación, como en la purificación de MAL FTK dos.Luego, recoja el sobrenadante que contiene el complejo mal FTK dos solubilizado y vuelva a purificar mediante cromatografía de afinidad con níquel. Purifique aún más el complejo mediante cromatografía de filtración en gel en tampón TSGD, utilizando una columna SUEx 200, HR 10/300, a un flujo de 0,5 mililitros por minuto. Para preparar los fosfolípidos, separe un extracto total de lípidos de e coli disuelto en cloroformo en alícuotas de 1000 anomal en tubos microficha con tapón de rosca, evapore el disolvente con una corriente suave de nitrógeno y deje secar durante la noche en vacío.Desecar a continuación, disolver la película lipídica en tampón TS a una concentración final de cinco NMO y mezclar en vórtex vigorosamente, luego sonicar en pulsos cinco veces durante aproximadamente cinco segundos. Los lípidos disueltos aparecerán ligeramente opacos debido a su baja solubilidad general en tampón TS acuoso, pero deben permanecer en suspensión. Añadir DDM hasta alcanzar una concentración final de 0,5 %. En este punto, la solución se volverá transparente; colocar la mezcla lipídica en un baño de agua y sonicar en pulsos cinco veces durante aproximadamente cinco segundos.La mezcla de lípidos puede almacenarse a cuatro grados Celsius durante un máximo de una semana. Para preparar las perlas bio, coloque aproximadamente de 10 a 15 mililitros de perlas bio en un tubo de 50 mililitros. Primero, lave las perlas con 50 mililitros de metanol al 100 %.Deje que los perlas sedimenten por gravedad y luego vierta cuidadosamente la solución. Repita el proceso una vez con metanol y luego dos veces con etanol al 95%, agua milli Q y finalmente tampón TS. Comience la constitución nano discreta diluyendo MSP en tampón TSGD hasta una concentración final de aproximadamente siete miligramos por mililitro o 0,3 milimolar.Para garantizar un experimento exitoso, es importante elegir las proporciones correctas de lípidos y proteínas que se mezclarán. Mezcle aproximadamente dos M de complejo purificado malf GK dos a una relación de proteína a MS P a lípido de uno a tres a 60 en tampón TSGD, para un volumen final de 300 microlitros. Aquí, también se prepara una muestra con exceso de lípido en la relación de uno a tres a 400 como control negativo. Añada 50 microlitros de suspensión de bio perlas al tubo e incube la mezcla durante la noche en una mesa agitadora a cuatro grados Celsius. Al día siguiente, sedimente las perlas por gravedad. Una vez que las perlas hayan sedimentado, aspire la solución a través de una punta estrecha para evitar tantas bio perlas como sea posible.Elimine los grandes precipitados mediante ultracentrifugación a 100,000 ×g durante 20 minutos. A continuación, proceda a purificar los discos mediante cromatografía de filtración en gel, tal como se realizó previamente en el tampón TSG 10. Luego, inyecte un Eloqua en la misma columna de filtración en gel para evaluar la estabilidad del preparado.Luego, reúna las fracciones que contienen los discos. La calidad de la preparación se evalúa mediante electroforesis en gel nativo. Analice un micromolar de nanodiscos para evaluar la calidad de la reconstitución.También evalúe la unión de mal E al complejo mal ftk dos reconstituido en nanodiscos. Después de la electroforesis, tiña el gel con azul de Kumasi durante 10 minutos y detenga durante aproximadamente una hora. Para realizar dispersión dinámica de luz o DLS, primero purifique los nanodiscos mediante cromatografía de filtración en gel como antes, utilizando una columna SUEx 200 HR 10/300 a un flujo de 0,1 mililitros por minuto.Agrupe las fracciones que contienen nanodiscos y concéntrelas hasta aproximadamente 10 miligramos por mililitro utilizando un filtro centrífugo AmCon. Luego, filtre la muestra dos veces. Realice el análisis mediante DLS usando un instrumento Dynapro Nano Star en una celda de cuarzo con volumen interno de un microlitro.Utilizando el software dinámico para estimar el diámetro y el peso molecular de las partículas, determine la actividad de la aTPAs en dos nanodiscos reconstituidos con mal FTK mediante un ensayo colorimétrico. Primero, mezcle un micromolar de discos purificados y un milimolar de aTP con cantidades crecientes de mal e. Incube las muestras a 37 grados Celsius durante 20 minutos.Luego, mida la liberación de fosfato inorgánico a 660 nanómetros. Compare la cantidad de fosfato liberado con una curva patrón generada con una solución patrón de fósforo. Los nanodiscos se purifican mediante cromatografía de filtración en gel.El cromatograma muestra que la mayoría de los discos reconstituidos eluyen como un solo pico, mientras que los discos elaborados con exceso de lípidos eluyen en el volumen de exclusión y como una serie de picos amplios. La calidad de la preparación de discos se analiza además mediante electroforesis en gel nativo: los discos reconstituidos con una cantidad limitada de lípidos migran como una banda definida en el gel nativo, mientras que aquellos reconstituidos en presencia de un exceso de lípidos migran como manchas difusas. El análisis mediante DLS muestra que la población de discos es homogénea, con un radio promedio de 5,0 nanómetros. Según la aproximación de DLS, los discos reconstituidos tienen un peso molecular aparente de 215 kilodalton. Las muestras reconstituidas en presencia de exceso de lípidos muestran radios ampliamente distribuidos alrededor de los 100 nanómetros, lo cual es típico de muestras no homogéneas.La actividad del complejo MAL FTK dos se evalúa midiendo la velocidad de hidrólisis de TP y la afinidad por sus socios de interacción, como la proteína fijadora de maltosa, MAL E, la proteína fijadora de maltosa. MAL E se une con alta afinidad al transportador MAL FTK dos mediante electroforesis en gel no desnaturalizante. Es posible detectar un complejo entre MAL E y MAL FTK dos; aquí se muestra la estimulación de la actividad MAL KA TPA por MAL E en función de la concentración de MAL E.La elaboración del disco nano es relativamente sencilla, aunque pequeñas desviaciones de las condiciones óptimas pueden provocar agregación irreversible de proteínas; una vez dominada, esta técnica puede realizarse en menos de dos días. Al intentar este procedimiento, es importante tener en cuenta la importancia de elegir una relación proteína-lípido adecuada, ya que un exceso de lípidos conducirá a la producción de partículas grandes, polidispersas y similares a liposomas. Por ello, es fundamental analizar cuidadosamente la calidad del material reconstituido utilizando técnicas distintas de la filtración en gel, como la espectroscopía de dispersión de luz, la ultracentrifugación analítica o, de forma más sencilla, la electroforesis nativa en gel.Recuerde, el tipo de fosfolípido que incorpora el disco, así como el de la proteína de andamiaje de membrana, puede influir en la eficiencia de la reconstitución. Después de ver este video, esperamos que haya comprendido bien cómo generar discos nano solubles y homogéneos que contengan su proteína de membrana de interés. Buena suerte con sus experimentos.

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Investigación

JoVE Journal

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