Un método paso a paso para la reconstitución de un transportador ABC en partículas lipídicas Nanodisc

El objetivo general de este procedimiento es incorporar un transportador A, b, C. En este caso, el transportador de maltosa malf GK dos en partículas de nano disco de membrana soluble. Esto se logra mezclando primero la proteína de andamio de membrana MSP, con el transportador y la cantidad correcta de lípidos en las micélulas detergentes.

El segundo paso es agregar perlas de poliestireno y mecer suavemente la mezcla durante la noche, el detergente se absorbe progresivamente sobre las perlas, lo que permite la formación de las partículas del nanodisco. A continuación, las perlas se eliminan por sedimentación. El paso final es separar los discos correctamente formados de los agregados y las proteínas de andamio sin ensamblar mediante cromatografía de filtración en gel.

Por último, la calidad de los discos se evalúa mediante electroforesis en gel nativo o espectroscopía de dispersión de luz. La principal ventaja de esta técnica sobre otros métodos como los liposomas, es que las proteínas de membrana y los discos son perfectamente solubles en solución acuosa. Además, ahora se puede acceder a los dominios de proteínas desde ambos lados.

Dado que ahora ya no hay compartimento de membrana Utilizando proteínas de andamio de membrana de diferentes longitudes, pude atrapar y estudiar los diferentes estados de ligamento de las proteínas de membrana. Y lo que es más importante, este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la proteómica de membranas, como la identificación de nuevos socios de unión de los transportadores a, b y C. De hecho, las implicaciones de esta técnica se extienden más allá de la terapia porque puede ayudar al descubrimiento de activadores o inhibidores de proteínas y receptores de membrana.

Aunque este método parece sencillo, se debe tener cuidado a la hora de elegir la proporción correcta de lípidos proteicos. Generalmente, las personas nuevas en este método luchan por calcular la proporción correcta de moldeo o hacer el control correcto que asegure la calidad de la preparación. Por lo tanto, una demostración visual de este método es muy útil para que un nuevo estudiante aprenda los diversos pasos y las posibles dificultades.

Para empezar, la histidina marcada con grê hexa histidina en la cepa BL 21 DE tres del plásmido P MSSP 1D una indujo la producción de proteínas cuando la densidad óptica medida a 600 nanómetros es de aproximadamente 0,5 durante tres horas a 37 grados Celsius, se recolectan las células por centrifugación a 5.000 Gs durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Vuelva a suspender el pellet en tampón TSG 10 que contiene 100 micromolares PMSF, pique las células con una prensa francesa tres veces a 8, 000 PS. Elimino el material insoluble por centrifugación a 5.000 Gs durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, aislar la fracción soluble que contiene el MSP mediante ultracentrifugación a 125.000 Gs durante 45 minutos.

Purifique el MSP mediante cromatografía quelante de níquel utilizando aproximadamente 1,5 mililitros de seros de níquel de alto rendimiento en tampón TSG 10. Lave los contaminantes con tampón T SG 10 que contiene 50 milimolares de eluido ILE. El MSP con tampón TSG 10 que contiene 600 milimolares I midaz después de la diálisis.

La proteína purificada en el tampón TSG 10 MSP puede almacenarse a menos 70 grados centígrados y una concentración de proteína de aproximadamente 10 a 15 miligramos por mililitro. El complejo MALF GK dos, marcado en el extremo C de MAL K, se expresa a partir de un plásmido. PED 22 FG K cultivado en la cepa de E. coli BL 21 DE tres inducen la producción de proteínas cuando la densidad óptica medida a 600 nanómetros es de aproximadamente 0,5 con 0,2%L de árabes durante tres horas a 37 grados Celsius después de la lisis celular y la centrifugación.

Al igual que antes, suspendemos el pellet de membrana en tampón TSG 20 hasta una concentración final de cinco miligramos por mililitro. A continuación, solubilice el material con 1% de peso por volumen GDM durante tres horas a cuatro grados centígrados con una suave agitación. Elimine el material insoluble por ultracentrifugación como para la purificación de MAL FTK dos.

A continuación, recoja el sobrenadante que contiene el complejo mal FTK dos solubilizado y purifique de nuevo con cromatografía quelante de níquel. Purifique aún más el complejo mediante cromatografía de filtración en gel en tampón TSGD en una columna SUEx 200, HR ten trescientas a un caudal de 0,5 mililitros por minuto. Para preparar fosfolípidos, un extracto lipídico total de E. coli disuelto en cloroformo se separa en 1000 alícuotas anómicas en tubos de microficha con tapón de rosca, evapora el solvente bajo un suave flujo de nitrógeno y se conduce más durante la noche en el vacío.

A continuación, desecar la película lipídica en el tampón TS a una concentración final de cinco NMO y vórtice vigorosamente, luego pulsar el sonicar cinco veces durante aproximadamente cinco segundos. Los lípidos disueltos aparecerán ligeramente opacos debido a su insolubilidad general en tampón TS acuoso, pero deben permanecer en suspensión. Agregue DDM a una concentración final de 0.5%En este punto, la solución se volverá transparente, colocará la mezcla de lípidos en un baño de agua y pulsará el sonicatado cinco veces durante aproximadamente cinco segundos.

La mezcla lipídica se puede almacenar a cuatro grados centígrados durante un máximo de una semana. Para preparar las bio perlas, coloque aproximadamente de 10 a 15 mililitros de bio perlas en un tubo de 50 mililitros. Primero, lave las perlas con 50 mililitros de metanol 100%.

Deje que las perlas se asienten por gravedad y luego vierta suavemente la solución. Repita el proceso una vez para el metanol y luego dos veces para el 95%Ethanol milli Q de agua y finalmente el tampón TS. Comience la constitución nano discreta diluyendo MSP en tampón TSGD hasta la concentración final de aproximadamente siete miligramos por mililitro o 0,3 milimolar.

Para garantizar el éxito del experimento, es importante elegir las proporciones correctas de lípidos y proteínas que se van a mezclar. Mezcle aproximadamente dos M de malf GK dos complejo purificado a una proporción de proteína a MS P a lípidos de uno a tres a 60 en tampón TSGD para un volumen final de 300 microlitros Aquí, una muestra de lípidos en exceso en la proporción de uno a tres a 400 también se prepara como un control negativo a 50 microlitros de suspensión de bio perlas al tubo e incubar la mezcla durante la noche en un mecedora a cuatro grados centígrados al día siguiente, sedimentar las cuentas por gravedad. Una vez que las perlas se hayan asentado, canaliza la solución a través de una punta estrecha para evitar la mayor cantidad posible de perlas biológicas.

Eliminar los precipitados grandes por ultracentrifugación a 100.000 GS durante 20 minutos. Proceda a purificar los discos mediante cromatografía de filtración en gel como se realizó anteriormente en el tampón TSG 10. A continuación, inyecte un Eloqua en la misma columna de filtración de gel para probar la estabilidad de la preparación.

A continuación, agrupa las fracciones que contienen los discos. La calidad de la preparación se evalúa mediante electroforesis en gel nativo. Analice un micromolar de nano discos para evaluar la calidad de la reconstitución.

También se evaluará la unión de mal E al mal ftk dos complejos reconstituidos en nano discos. Después de la electroforesis, tiñir el gel con azul de kumasi durante 10 minutos y mantener durante aproximadamente una hora. Para realizar la dispersión dinámica de la luz o DLS, primero purifique los nano discos mediante cromatografía de filtración en gel como antes, utilizando una columna SUEx 200 HR 100 trescientas a un caudal de 0,1 mililitros por minuto.

Agrupe las fracciones que contienen nano discos, y concéntrelas a aproximadamente 10 miligramos por mililitro con un filtro centrífugo AmCon. A continuación, filtre la muestra dos veces. Realice análisis por DLS utilizando un instrumento dynapro nano star en un volumen interno de un microlitro de datos de ajuste de cuarzo vete.

Utilizando el software dinámico para estimar el diámetro y el peso molecular de las partículas, determine la actividad de A TPAs de dos nanodiscos reconstituidos FTK utilizando un ensayo métrico de chole. Primero mezcle un micromolar de discos purificados y un milimolar un TP con cantidades crecientes de mal. Incubar las muestras a 37 grados centígrados durante 20 minutos.

A continuación, mida la liberación de fosfato inorgánico a 660 nanómetros. Compare la cantidad de fosfato liberado con una curva estándar generada con una solución estándar de fósforo. Los nano discos se purifican mediante cromatografía de filtración en gel.

El cromatograma muestra que la mayoría de los discos reconstituidos eluyen como un solo pico, mientras que los discos hechos con exceso de lípidos eluyen en el volumen vacío, y como una serie de picos amplios, la calidad de la preparación del disco se analiza más a fondo mediante discos de electroforesis en gel nativos reconstituidos con una cantidad limitada de lípidos que migran como una banda afilada en el gel nativo. mientras que los reconstituidos en presencia de un exceso de lípidos migran en forma de frotis. El análisis realizado por DLS muestra que la población del disco es homogénea con un radio medio de 5,0 nanómetros. Según la aproximación DLS, los discos reconstituidos tienen un peso molecular aparente de 215 kilodaltons, las muestras reconstituidas en presencia de exceso de lípidos muestran radios ampliamente distribuidos alrededor de 100 nanómetros, lo que es típico para muestras no homogéneas.

La actividad del complejo MAL FTK dos se evalúa midiendo la tasa de hidrólisis de TP y la afinidad por los socios que interactúan, como la proteína de unión a maltosa, MAL E, la proteína de unión a maltosa. MAL E se une con una alta afinidad al transportador MAL FTK dos mediante electroforesis en gel no desnaturalizante. Es posible detectar un complejo entre MAL E y MAL ftk dos, la estimulación de la actividad MAL KA TPA por MAL E se muestra aquí en función de la concentración de MAL e.

La fabricación del nano disco es relativamente sencilla, sin embargo, pequeñas desviaciones de las condiciones óptimas pueden conducir a una agregación irreversible de proteínas una vez dominado, esta técnica se puede realizar en menos de dos días. Al intentar este procedimiento, es importante recordar la importancia de elegir una proporción correcta de lípidos proteicos porque una cantidad excesiva de lípidos conducirá a la producción de grandes partículas liposomas polidispersas. Es crucial analizar cuidadosamente la calidad del material reconstituido utilizando técnicas distintas a la filtración en gel, como la espectroscopia de dispersión de luz, la ultracentrifugación analítica o, más simplemente, la electroforesis en gel nativo.

Recuerde que el tipo de fosfolípido que incorpora el disco, así como la proteína del andamio de membrana, pueden contribuir a la eficiencia de la reconstitución. Después de ver este vídeo, esperamos que hayas entendido bien cómo generar nanodiscos solubles y homogéneos que contengan la proteína de membrana que elijas. Buena suerte con tus experimentos.