La identificación y aislamiento de Slow división de las células de glioblastoma humano utilizando carboxi fluoresceína Succinimidyl Ester (CFSE)

Este protocolo en video demuestra la identificación y aislamiento de células de división lenta en glioblastoma humano utilizando el éter de carboxifluoresceína SDI, CFSE. Las células tumorales de glioblastoma se cultivan primero mediante el ensayo de neuroesferas. Luego, las esferas resultantes se disocian en células individuales y se tiñen con CFSE.

Las células cargadas con CFSE se siembran nuevamente. En el cultivo de neuroesferas, las esferas resultantes se disocian en células individuales y se analizan mediante citometría de flujo. Las células con división lenta y rápida se identifican y separan según la intensidad de fluorescencia en función de la división celular.

La heterogeneidad de frecuencia es una característica esencial en el cáncer. Esta heterogeneidad sustenta la robustez del tumor y representa un gran obstáculo para el desarrollo de tratamientos completamente eficaces. Por lo tanto, es fundamental desarrollar herramientas y ensayos para estudiar y comprender esta heterogeneidad, definida genética, fenotípica y funcionalmente.

En este protocolo en video, describimos un método establecido que utiliza los flujos y la I-C-F-S-C. Esta técnica permite la identificación y separación mediante citometría de flujo de subpoblaciones individuales dentro de un cultivo de células derivadas de glioblastoma humano que poseen diferentes características funcionales. Hemos utilizado esta técnica para aislar y caracterizar una población tumoral de células que exhiben una tasa de división lenta, una propiedad funcional que se ha demostrado asociada con la iniciación tumoral en gliomas. El cultivo de esferas tumorales se establece y mantiene utilizando el ensayo de neuroesferas, el cual se describe en un video aparte en la dirección que aparece en pantalla.

Cuando las esferas de glioma alcanzan un tamaño de 150 a 200 micrones de diámetro, el medio que contiene las esferas se retira y coloca en un tubo de cultivo de tejidos estéril de tamaño adecuado, y se centrifuga a 800 RPM o 110 G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego se descarta el sobrenadante y el pellet de esferas se resuspende en un mililitro de tripsina-EDTA precalentada y se incuba a 37 grados en un baño de agua durante tres a cinco minutos. A continuación, se añade un volumen igual de inhibidores de tripsina con pipeteo suave hacia arriba y hacia abajo para disociar las esferas.

La suspensión celular se centrifuga nuevamente. Se elimina el sobrenadante y las células se resuspenden en un mililitro de medio basal para células madre neurales. Diez microlitros de la suspensión simple de células se mezclan bien con 90 microlitros de azul de tripano y se realiza un recuento celular por cada millón de células a teñir.

Se prepara un mililitro de reactivo de tinción añadiendo un microlitro de colorante CFSE cinco milimolar a un mililitro de medio basal de células madre neurales, obteniendo una concentración final de tinción de cinco micromolar. A continuación, se mezcla adecuadamente la solución de tinción. El número deseado de células se transfiere entonces a un tubo separado, se centrifuga y se elimina el sobrenadante.

La solución de tinción con CFSE se añade luego al precipitado y se mezcla suavemente hasta lograr homogeneidad, y se incuba a temperatura ambiente durante 10 minutos para detener el proceso de tinción. Se añaden de 5 a 10 volúmenes de medio basal frío de células madre neurales a las células cargadas con CFSE y se mezcla bien. La suspensión celular se centrifuga entonces y se descarta el sobrenadante.

En este momento, debería aparecer un ellete de células en la parte inferior del tubo con un tono verde que indica que la tinción fue exitosa. Para eliminar el exceso de colorante CFSE, se realizan de dos a tres lavados mediante resuspensión, suspendiendo el precipitado en un mililitro de medio basal para células madre neurales, centrifugando y descartando el sobrenadante.

Después del tercer lavado, las células se resuspenden en un mililitro de medio basal para células madre neurales, y se realiza un conteo celular tal como se describió previamente para sembrar las células. El medio completo para células madre neurales se suplementa con EGF a una concentración final de 20 nanogramos por ml. Luego, las células de los grupos cargados y no cargados con CFSE se añaden a sus respectivos tubos para alcanzar una concentración final de 50.000 células por ml.

Luego, las suspensiones celulares se mezclan completamente y se siembran en frascos estériles para cultivo de tejidos. A continuación, se etiquetan los frascos. Las células pueden monitorearse mediante microscopía de fluorescencia para verificar la tinción con CFSE y luego se colocan en un incubador húmedo a 37 grados y 5% de CO2 durante cinco a 10 días.

Para verificar la tinción con CFSE mediante citometría de flujo, se transfieren 500.000 células de los grupos control negativo cargados y no cargados con CFSE a tubos FACS separados. El citómetro de flujo se ajusta según las instrucciones del manual de usuario para los parámetros relacionados. Primero, se analizan las células control no cargadas y se registran los eventos según sus propiedades de dispersión directa y lateral, y luego, en un gráfico de histograma basado en la frecuencia celular frente a la intensidad de CFSE, se selecciona la población celular principal para verificar el nivel de intensidad de fluorescencia de CFSE.

A continuación, las células cargadas con CFSE se analizan utilizando los mismos parámetros empleados para las células de control, como es evidente. Las células positivas para CFSE exhiben una intensidad de fluorescencia varias órdenes de magnitud mayor que las células de control. Cuando las esferas de glioma han alcanzado un tamaño promedio de aproximadamente 150 a 200 micrones de diámetro.

Se realiza el pase de las esferas y se prepara una suspensión individual de células a partir de ambos grupos, con y sin carga de CFSE, como se describió anteriormente. Luego, las células se resuspenden en un volumen adecuado de PBS estéril al 1× y se realiza un conteo celular para excluir células muertas o dañadas. Al clasificar mediante citometría de flujo, se añade yoduro de propidio a una concentración de un microlitro por ml de suspensión celular para recolectar células de división lenta y células de división rápida.

Al clasificar, se preparan dos tubos estériles de cultivo de tejidos de 15 ml, cada uno conteniendo un ml de medio completo para células madre neurales. Luego, las células se colocan en hielo durante la transferencia a la instalación de citometría de flujo. Primero, se pasa la suspensión celular del grupo de células no tratadas a través del citómetro de flujo.

Los eventos se representan según dispersión directa frente a dispersión lateral para excluir células muertas o dañadas. Las células se representan según dispersión lateral frente a reactividad al PI, y se selecciona una población única de células vivas como población uno. Luego, se selecciona una población celular homogénea a partir de la población uno según sus propiedades de dispersión directa y lateral, y se delimita como población dos. A continuación, la población dos se representa en un histograma basado en frecuencia celular frente a intensidad de CFSE, con escala logarítmica, utilizando los mismos parámetros y estrategia de selección.

Las células marcadas con CFSE se analizan mediante citometría de flujo. Posteriormente, se selecciona el 85 % inferior de las células como población de división rápida y el 5 % superior como población de división lenta. Estas diferentes poblaciones celulares de interés se seleccionan y separan en tubos estériles de cultivo tisular de 15 ml que contienen un ml de medio completo para células madre neurales.

La tasa de umbral de clasificación debe ajustarse para no exceder los 2.500 eventos por segundo. Tras finalizar la clasificación, las células se centrifugan, se descarta el sobrenadante y el sedimento se resuspende en un volumen adecuado de medio y se realiza un recuento celular. Luego, las células de las diferentes poblaciones clasificadas se siembran a una densidad de 50.000 células por ml.

En medio completo para células madre neurales, suplementado con 20 nanogramos por mL de EGF, las células se incuban luego durante cinco a 10 días para formar esferas. Este es un ejemplo de células. Poco después de la carga con el colorante CFSE, todas las células presentan una fluorescencia verde intensa, como se observa mediante microscopía de fluorescencia.

Esta es una imagen de una esfera de glioma representativa derivada de la célula cargada con A-C-F-S-E seis días después de la siembra. Observe que algunas de las células aún presentan una tinción muy intensa de CFSE. Este es un ejemplo de un histograma de citometría de flujo que muestra cómo la intensidad de CFSE decae con el tiempo.

Azul representa las células recién cargadas con CFSE que muestran intensidad de fluorescencia, que es órdenes de magnitud mayor que la de las células no cargadas, representadas en rojo. Verde representa la intensidad de fluorescencia que ha decaído tras un período de seis días posteriores a la carga con CFSE debido a la división celular.

Estas son esferas representativas cultivadas siete días después del aislamiento de poblaciones con división rápida y lenta. Las frecuencias de formación de esferas no difieren entre los dos grupos, pero las células que retienen CFSC crecen más lentamente y dan lugar a esferas más pequeñas en comparación con las células que diluyen CFSC. El uso de CFSC para identificar y aislar subpoblaciones celulares según la tasa de división celular es un punto de partida para experimentos posteriores y caracterizaciones adicionales.

Este protocolo proporcionó un ejemplo para identificar células de división lenta en cultivos derivados de glioma humano, pero también puede aplicarse a otros tipos de células tumorales o a sistemas no cancerosos. Gracias por verlo y esperamos que este protocolo le haya resultado útil para su investigación.