Marcaje fluorescente retrógrada Permite dirigida extracelular sola unidad de grabación de neuronas identificadas En vivo

El objetivo general de este procedimiento es registrar las respuestas de unidades individuales in vivo desde una población identificada de neuronas en un sistema modelo no genético. Esto se logra primero realizando una craneotomía para exponer la región cerebral de interés. El segundo paso consiste en utilizar alambres de tungsteno para colocar el colorante fluorescente en la región a la que proyectan las neuronas objetivo.

A continuación, el colorante es transportado de forma retrógrada, lo que da lugar a la marcación selectiva de las neuronas de proyección. El paso final consiste en realizar una grabación desde el axón marcado de la neurona de proyección individual. En última instancia, se utilizan grabaciones extracelulares de unidad individual para mostrar cómo las neuronas sensoriales centrales en un circuito intacto responden a la estimulación sensorial en evo.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre cómo los circuitos neuronales detectan diferencias de submilisegundos en el momento de llegada de las entradas sinápticas. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es la capacidad de dirigirse a neuronas individuales o incluso a axones y sistemas no accesibles genéticamente. Los peces eléctricos utilizan señales eléctricas para la comunicación y la navegación.

Distinguen las señales de diferentes peces utilizando diferencias de submilisegundos en el momento de llegada de las entradas sinápticas. Nos preguntamos cómo las neuronas comparadoras de tiempo, supuestas en su circuito sensorial electrostático, son capaces de detectar diferencias tan pequeñas en el tiempo. Sin embargo, esta técnica también puede aplicarse a otros sistemas, como las vías sensoriales visual y auditiva.

Es particularmente difícil obtener líquido de estas células debido al pequeño tamaño, al denso entramado en el tejido circundante y a los terminales presinápticos que cubren la mayor parte del cuerpo celular. La inyección intracelular de colorante durante un registro en célula íntegra marca una sola célula para guiar grabaciones dirigidas desde ese axón. De manera similar, el transporte retrógrado tras la inyección extracelular de colorante proporciona un medio para etiquetar selectivamente las neuronas de proyección en regiones cerebrales superficiales.

Esto puede utilizarse para proporcionar orientación visual para grabaciones unitarias in vivo. Para preparar la aguja codificada con D, primero afílese electroquímicamente un alambre de tungsteno de 160 micrómetros de diámetro hasta alcanzar un diámetro final de la punta de la aguja entre cinco y 50 micrómetros. Luego, la noche anterior al experimento, márquese la punta de la aguja con una solución de dos milimolares de dextrano conjugado con colorante Alexa floor de 10 000 de peso molecular para inducir anestesia general.

Coloque el pez en agua del tanque con solución MS 222 al 300 miligramos por litro para inmovilizarlo y silenciarlo eléctricamente mediante la inyección de 100 microlitros de flail al 3 miligramos por mililitro en la musculatura dorsal del cuerpo. A continuación, llene la cámara de registro con agua del tanque y coloque el pez con el lado ventral hacia abajo sobre la plataforma en el centro de la cámara. Luego, administre la solución MS 222 aireada al 100 miligramos por litro a una velocidad de uno a dos mililitros por minuto colocando la punta de una pipeta en su boca.

Posteriormente, estabilice el pez con varillas fijas y cera en ambos lados del cuerpo. Monitoree la condición de salud del pez verificando el flujo sanguíneo continuo en los vasos oculares y un color corporal normal. Luego, gire la plataforma a lo largo del eje vertical.

Ajuste un extremo de la plataforma de manera que un lado de la superficie dorsal de la cabeza del pez quede expuesto por encima del agua, mientras que el resto del cuerpo del pez permanece sumergido. Coloque un pequeño trozo de toalla de papel Kimwipe sobre cualquier porción de la piel que no esté sumergida para evitar que se seque. En este procedimiento, aplique lidocaína al 0,4 % sobre la superficie expuesta de la cabeza utilizando un hisopo.

Luego, use una hoja de bisturí para cortar un trozo rectangular de tejido cutáneo de aproximadamente tres milímetros por cinco milímetros en un pez de 6,2 centímetros. El borde lateral del rectángulo debe alinearse con el centro del ojo. El borde anterior del rectángulo debe ubicarse justo posterior al ojo, y el borde medial del rectángulo debe estar justo lateral a la línea media.

Posteriormente, retire el rectángulo utilizando un par de pinzas. Corte un cuadrado adicional de 2,5 milímetros en sentido anterior para exponer el cráneo. Limpie completamente la superficie expuesta del cráneo raspando cualquier tejido excesivo con la hoja del bisturí.

Luego seque completamente la superficie con una toalla Kim y aire forzado. A continuación, pegue un poste metálico a la región anterior medial expuesta del cráneo con pegamento rápido. Espere hasta que el pegamento esté completamente seco.

Utilice un taladro dental con una punta de carburo de 0,5 milímetros de diámetro para trazar un rectángulo de aproximadamente dos milímetros por cuatro milímetros en el cráneo de un pez de 6,2 centímetros. A continuación, corte el perímetro del rectángulo con el bisturí y la pinza. Luego, retire el cráneo.

Para exponer el cerebro, corte tanto la duramadre pigmentada como la piamadre transparente utilizando un par de tijeras de resorte o una aguja. Luego, retire las porciones cortadas con un par de pinzas para exponer el núcleo extra lateral anterior y el núcleo extra lateral posterior. Ahora, coloque un manipulador con una aguja recubierta de D preparada previamente sobre la región diana que contiene los axones de interés.

El núcleo posterolateral externo en nuestro caso inserta rápidamente la aguja aproximadamente 25 micrómetros dentro del tejido. Tras la difusión del colorante durante 15 a 30 segundos, retire la aguja. Repita el procedimiento con agujas nuevas adicionales según sea necesario.

Coloque cada uno en una ubicación diferente para que el colorante se distribuya por toda la región objetivo. Luego, enjuague el exceso de colorante de la cavidad con solución de Ringer de Hickman y espere al menos dos horas para la absorción y el transporte del colorante. Para visualizar los axones de interés, coloque la cámara de registro con el pez debajo del objetivo de un microscopio de epifluorescencia con platina fija vertical.

Cambie la solución de respiración por agua de tanque fresca y mantenga el mismo caudal. Luego, coloque un extremo del cable de tierra en la cavidad cerebral expuesta y conecte el otro extremo a la tierra de la etapa de grabación. A continuación, coloque un par de electrodos de registro junto a la base de la cola.

Luego, conecte los electrodos a un amplificador diferencial y un dispositivo de registro. Con el fin de monitorear la descarga eléctrica del órgano comando o EODC, prepare un esquema a escala de la región cerebral observada con aumento bajo, incluyendo los principales vasos sanguíneos como puntos de referencia para identificar la ubicación exacta de las axones marcadas. Para confirmar primero la colocación de D, observe todo el tejido con iluminación de campo claro para orientación.

Luego, obsérvelo con iluminación fluorescente. El núcleo extra lateral posterior debe mostrar una marcación difusa. A continuación, bajo alta magnificación, localice el núcleo extra lateral anterior utilizando los vasos como puntos de referencia.

Ilumínelo con luz fluorescente mientras busca un axón marcado cerca de la superficie, utilizando un capilar de vidrio de borosilicato con filamento de un milímetro de diámetro externo y 0,58 milímetros de diámetro interno. Tire de un electrodo de registro con una vara estrecha de cinco milímetros de longitud y un diámetro de punta de aproximadamente uno a 2,4 micrómetros.

Llene el electrodo con solución de Ringer de Hickman filtrada. La resistencia final de la punta debe estar en el rango de 16 a 155 megaohmios. Coloque el electrodo en un porta-electrodos con un puerto de presión.

Conéctelo al cabezal montado en un manipulador. Luego, conecte el cabezal a un amplificador. Un dispositivo de adquisición analógico-digital, no mostrado, conecta el amplificador al ordenador.

A continuación, aplique una presión positiva de 30 milibares a la línea del electrodo. Avance lentamente el electrodo hacia el axón desde la superficie del tejido. Cuando el electrodo esté cerca del axón, la presión positiva debe provocar un movimiento leve pero notable del axón mientras el electrodo se encuentra junto al axón.

Registre la actividad durante la presentación de los estímulos de prueba. Aunque un artefacto eléctrico confirma una grabación y estimulación adecuadas, no debería haber potenciales de acción. Libere la presión hacia afuera en el electrodo y repita la estimulación y el registro.

Luego, aplique una succión ligera para que el axón se mueva hacia el electrodo. Repita la estimulación y la grabación nuevamente. Ahora debería observar algunos potenciales de acción en respuesta a las estimulaciones.

Una vez que sean visibles los potenciales de acción, cierre la línea de presión. Cuando se completen todas las grabaciones deseadas, cambie el agua del tanque nuevamente a la solución de respiración con MS 2 22 a cien miligramos por litro para asegurar que el pez esté completamente anestesiado. No se debe detectar ningún EODC durante al menos 10 minutos antes de sacrificar al pez.

Aquí se muestran cinco trazas de ejemplo que muestran los potenciales de acción evocados por un estímulo cuadrado transversal monofásico contralateral positivo de 0,1 milisegundos y seis milivoltios por centímetro, y aquí hay un gráfico de raster que muestra los tiempos de los picos durante 20 repeticiones de una ventana de registro de 75 milisegundos para la misma unidad estimulada en el tiempo cero con estímulos de seis milivoltios por centímetro. El rango de duraciones se indica a la derecha. Se muestra aquí una curva de sintonización de duración del estímulo que cuantifica las respuestas como picos por repetición del estímulo.

Una vez dominada, la cirugía y la inyección del colorante mostradas en esta técnica pueden realizarse en una hora si se llevan a cabo correctamente, y las grabaciones pueden iniciarse de dos a tres horas después de la inyección del colorante. Al intentar este procedimiento, es importante recordar monitorear cuidadosamente la salud del animal experimental tras seguir este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como la imagenología de dos fotones, para registrar neuronas en estructuras cerebrales aún más profundas.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo etiquetar y registrar las respuestas de una unidad individual provenientes de una población identificada de neuronas.