Name: Marcaje fluorescente retrógrada Permite dirigida extracelular sola unidad de grabación de neuronas identificadas En vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: Aprende a realizar grabaciones extracelulares de unidades individuales de neuronas identificadas in vivo mediante marcaje fluorescente retrógrado. Esta técnica permite estudiar circuitos neuronales en sistemas no genéticos como peces eléctricos.

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Los fondos de la Fundación Nacional para la Ciencia (IOS-1050701 a BAC), los Institutos Nacionales de Salud (NS54174 a SM y F30DC0111907 de AML-W.), La Fundación Uehara Memorial de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (G2205 a los conocimientos tradicionales ). Damos las gracias a Julian Meeks por su apoyo y orientación sobre el tema de las grabaciones extracelulares axonal. Damos las gracias a Carl Hopkins para proporcionar una cámara de registro prototipo.

<ol><li>Meeks, J. P., Jiang, X., Mennerick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+potential+fidelity+during+normal+and+epileptiform+activity+in+paired+soma-axon+recordings+from+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Action potential fidelity during normal and epileptiform activity in paired soma-axon recordings from rat hippocampus.</a> J. Physiol. 566, 425-441 (2005).</li>
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<li>Heiligenberg, W., Rose, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+and+amplitude+computations+in+the+midbrain+of+an+electric+fish%3A+Intracellular+studies+of+neurons+participating+in+the+jamming+avoidance+response+of+Eigenmannia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Phase and amplitude computations in the midbrain of an electric fish: Intracellular studies of neurons participating in the jamming avoidance response of Eigenmannia.</a> J. Neurosci. 5, 515-531 (1985).</li>
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<li>Xu-Friedman, M. A., Hopkins, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+mechanisms+of+temporal+analysis+in+the+knollenorgan+pathway+of+mormyrid+electric+fish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Central mechanisms of temporal analysis in the knollenorgan pathway of mormyrid electric fish.</a> J. Exp. Biol. 202, 1311-1318 (1999).</li>
<li>Amagai, S., Friedman, M. A., Hopkins, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+coding+in+the+midbrain+of+mormyrid+electric+fish.+I.+Physiology+and+anatomy+of+cells+in+the+nucleus+exterolateralis+pars+anterior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%3A+Neuroethol+Sens+Neural.+Behav.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Time coding in the midbrain of mormyrid electric fish. I. Physiology and anatomy of cells in the nucleus exterolateralis pars anterior.</a> J. Comp. Physiol. A: Neuroethol Sens Neural. Behav. Physiol. 182, 115-130 (1998).</li>
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<li>Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+nonlinear+optical+imaging%3A+beyond+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy.</a> Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 507-530 (2011).</li>
<li>Holekamp, T. F., Turaga, D., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+three-dimensional+fluorescence+imaging+of+activity+in+neural+populations+by+objective-coupled+planar+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Fast three-dimensional fluorescence imaging of activity in neural populations by objective-coupled planar illumination microscopy.</a> Neuron. 57, 661-672 (2008).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Una vez dominado, esta técnica permitirá una para apuntar a las neuronas identificadas, incluyendo los axones individuales en grabaciones in vivo en muchos sistemas modelo. Además, esta técnica permite grabar fiable de salida de pico de las neuronas con características anatómicas únicas que lo hacen tradicional en métodos de grabación que desafían in vivo. Hemos utilizado esta técnica para grabar desde ELA &quot;pequeñas células&quot; en mormyrid peces débilmente eléctrica. Los intentos anteriores para estudiar las propiedades de ajuste de &quot;celdas pequeñas&quot; no tuvieron éxito debido a las condiciones difíciles de grabación 11, 14. Características anatómicas similares crean barreras para obtener grabaciones de una sola unidad de diversos vertebrados y neuronas auditivas electrosensoriales 8-10. Para superar estos retos de nuestro sistema, tomamos ventaja del hecho de que &quot;células pequeñas&quot; son las únicas células en ELA que proyectan a ELP. Por lo tanto, el transporte retrógrado de colorante colocado en ELP limita etiquetado en ELA para &quot;pequeña&quot;somas celulares y axones. etiquetado fluorescente de los axones permite la colocación precisa del electrodo al lado de los axones marcados, por lo que las grabaciones de una sola unidad de células identificadas posibles a pesar de somas inaccesibles. Se intentó grabaciones somáticas, pero no tuvieron éxito, probablemente debido a las sinapsis envolventes alrededor de 11 , 17. Sin embargo, somática etiquetado era claramente visible lo que sugiere que esta técnica podría ser utilizada para orientar grabaciones somáticas en otros tipos de células y otros circuitos. etiquetado fluorescente de las neuronas a través de transporte retrógrado in vivo se ha usado para guiar grabaciones específicas in vitro 19-21 . Una técnica similar se utiliza para dirigido en grabaciones in vivo de las neuronas motoras en la médula espinal pez cebra 22. Nuestro trabajo representa una nueva expansión de este enfoque, en el que tanto el etiquetado y la grabación se realiza in vivo en el cerebro. Nuestro método demuestra que en vivo etiquetado de las áreas del sistema nervioso central con una retrógrada tcorredor se puede ampliar para el estudio de otros circuitos intactos con las neuronas de proyección similar selectivos. Por ejemplo, en el procesamiento auditivo mamífero, el colículo inferior (CI) sirve como un centro de retransmisión importante para las entradas de múltiples estructuras rhombencephalic 23. Inyección de un contraste en el IC se etiquete selectivamente las células de proyección de cada uno de estos núcleos. El colículo superior (SC) cumple una función similar para la visión 24. Preparaciones de médula espinal son particularmente adecuados para esta técnica, como la médula espinal es de fácil acceso, la inyección de medio de contraste puede ocurrir lejos del sitio de registro, y que se pueden combinar con el registro intracelular y el llenado de las neuronas seleccione para adquirir información más detallada anatómica 25. Finalmente, el trazado de las vías es una técnica bien establecida usada en todo el sistema nervioso central para asignar circuitos complejo 26. Nuestro método se puede utilizar para añadir información funcional a estos estudios como se ha hecho windicadores sensibles al calcio ith de gato corteza visual 27. La cirugía, que está bien establecida, fiable, y se usa regularmente para ciego in vivo grabaciones 16, debe ser completada con un sangrado mínimo y ningún daño a la superficie del cerebro para permitir que el animal y el tejido para sobrevivir. Con la práctica, la aplicación de la cirugía y el tinte se puede completar en 30-45 minutos. Hemos marcado con éxito &quot;pequeñas células&quot; axones en el 67% de las preparaciones. La mayoría de las preparaciones de tener sólo 1 o 2 axones marcados visibles, pero algunos tienen el mayor número 8. De las 119 unidades etiquetadas intentos, se obtuvo grabaciones de una sola unidad de 26 unidades distribuidas en 12 preparaciones (Tabla 2). Por lo tanto, los datos se obtuvieron de 41% de las preparaciones con axones etiquetados para una tasa de éxito del 28%. El aspecto crítico de la aplicación de tinte es el etiquetado profundidad. Poca inserción del alambre de tungsteno dará lugar a que el colorante de ser lavada away. Sin embargo, si la penetración es demasiado profunda, los axones marcados no serán visibles para la orientación. Además, algunos daños mecánicos en la celda debe ocurrir para que el medio de contraste para ser tomada adecuadamente hasta 25, 28. Sin embargo, demasiado daño matará a las células. Hemos intentado marcar con otros tintes y otros métodos (Tabla 2), incluido el etiquetado anterógrada a través de inyección de tinta en ELA junto con la grabación de los axones marcados en ELP (Tabla 3). Nuestra hipótesis es que el etiquetado anterógrada no tuvo éxito porque el etiquetado se limita a las células con daños somáticos, por lo que no responde. Además, los terminales presinápticos pueden haber sido perturbado. Por el contrario, el etiquetado retrógrada minimiza tanto de estas preocupaciones. La cantidad y la ubicación de la aplicación del colorante pueden ser modificados de acuerdo con el circuito particular que está siendo estudiado. Etiquetado máxima se produce con la mayor concentración de colorante, lo que hemos logrado con alambres de tungsteno recubiertas. Sin embargo, para la rotulación de los axones conproyecciones ep, colorante podrían salir de una aguja de tungsteno, ya que es avanzado. En estos casos, la inyección de presión sería más apropiado. La absorción de colorante y el transporte son rápidos, con los axones marcados en nuestra preparación son visibles tan temprano como 2 horas después de la inyección y los axones marcados adicionales que aparecen tan tarde como 6 horas después de la inyección. Por lo tanto, el etiquetado y registro pueden llevarse a cabo en un solo día, la eliminación de dificultades técnicas asociadas con la cirugía de la supervivencia. El tiempo variará para cada aplicación en función de la distancia necesaria para el transporte de tinte. Otro aspecto crítico es la colocación de electrodos. Es importante para entrar en el tejido cerca del sitio del axón marcado para evitar la obstrucción de la punta. Para tejido denso como en ELA, un largo, pierna delgada en el electrodo de registro minimiza el movimiento excesivo de los tejidos circundantes. Si una grabación correcta no se consigue en el primer intento, repita con electrodos frescos hasta que se obtiene una grabación o el TISSue se interrumpe hasta el punto en el que el axón es ya no es visible. Sin embargo, también es importante para colocar rápidamente el electrodo al lado del axón para reducir al mínimo la cantidad de exposición fluorescente, que puede causar fototoxicidad, blanqueo y puede afectar a las propiedades fisiológicas de la célula 29-31. Una vez que un segmento de axón se filtra con succión con éxito en el electrodo de registro, las grabaciones se puede conseguir por varias horas. Si las unidades se pierden constantemente en menos de 1 hora, considerar la posibilidad de puntas de los electrodos más pequeños para prevenir el axón se deslice fuera. Por otra parte, demasiado pequeño de una punta puede dar lugar a la obstrucción, baja relación señal-ruido, o daños en el axón. Una disminución constante de la amplitud de la espiga y el &quot;retorno&quot; de una unidad con succión adicional es una indicación de que la punta es demasiado grande. El exceso de aspiración puede causar daños irreparables en el axón. Una solución es permitir que una pequeña fuga en la línea de aire para que la presión lentamente vuelve a cero. Rápidamente igualar ªpresión e dará lugar a un &quot;empuje&quot; relativa-transitoria de salida que puede expulsar al axón. Aunque esta técnica representa una gran ventaja para la obtención de grabaciones específicas de las neuronas de proyección identificados, no será útil para distinguir interneuronas locales, como colorante estaría ocupado por todos los tipos de células en el sitio de la inyección. Teóricamente, el uso de múltiples fluoróforos con distintos lugares de inyección puede permitir que este método se expanda. Por ejemplo, la comparación de un solo frente de doble etiquetado podría ser utilizado para distinguir interneuronas de las neuronas de proyección después de las inyecciones de doble en dos puntos en el circuito 32. Del mismo modo, los trazadores retrógrados se pueden combinar con otras técnicas de imagen avanzadas, tales como la imagen de dos fotones, como se hizo recientemente en el centro de Vocal zebra finch High (HVc) 32. Además, las regiones de grabación se limitan a los que están cerca de la superficie cuando se utiliza microscopios de epifluorescencia, ya que sólo hemos sido capaces de resolver 1 &amp;mu; estructuras m dentro de los primeros 30 micras de tejido. Sin embargo, esta profundidad se podría extender a través de la utilización de otras técnicas de microscopía, como la microscopía de dos fotones 33 u objetivo-junto microscopía de iluminación plana 34. En general, esta técnica representa un avance importante en el estudio de los circuitos neuronales in vivo, ya que puede ser utilizado para grabar desde las neuronas individuales en muchos circuitos diferentes en una variedad de sistemas de modelos - incluyendo aquellos que son relativamente inaccesibles.

<table><tbody><tr><td>Metsulfonato de tricaina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>MS-222</td></tr><tr><td>Trietioduro de galamina </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8134</td><td>Flaxedil</td></tr><tr><td>Clorhidrato de lidocaína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5647</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Solución de Ringer de Hickman&amp;rsquo;s </td><td>NA</td><td>NA</td><td>NaCl (6,48 g/l), KCl (0,15 g/l), CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;bull;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0 (0,29 g/l), MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (0,12 g/l), NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; (0,084 g/l), NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (0,06 g/l)</td></tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>Gilson o Rainin</td><td>Modelo Minipulse 3 312; RP-1</td><td>10,0 &amp;plusmn; 1,0 rpm, alternativamente, una línea alimentada por gravedad con un medidor de flujo</td></tr><tr><td>Micróscopio de disección </td><td>Nikon</td><td>SM2645</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Pegamento Super Glue</td><td>Super Glue Corporation</td><td>SGH2</td><td>Tubo de 2 g</td></tr><tr><td>Omni Drill 35</td><td>World Precision Instruments</td><td>503-598</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Broca de carburo para fresadora #1/4</td><td>World Precision Instruments</td><td>501860</td><td>Diámetro 0,19 (diámetro de la broca = 0,48 mm) </td></tr><tr><td>Kit de cauterización de baja temperatura</td><td>World Precision Instruments</td><td>500391</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Micromanipulador manual</td><td>World Precision Instruments</td><td>M3301R</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dextrano conjugado con Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>D-22912</td><td>Concentración de 2 mM; peso molecular 10.000. La elección de la longitud de onda del colorante debe seleccionarse para que coincida con los ajustes del filtro del microscopio</td></tr><tr><td>Micróscopio epifluorescente</td><td>Nikon</td><td>E600 FN</td><td>Un accesorio de enfoque remoto es útil para el enfoque fino. Filtro TRITC, o filtro adecuado para hacer coincidir los planos focales para diferentes longitudes de onda del colorante</td></tr><tr><td>Objetivo de baja potencia</td><td>Nikon</td><td>93182</td><td>Serie CFI Plan Achromat, 4X N.A. 0,1, D.T. 30 mm</td></tr><tr><td>Objetivo de alta potencia</td><td>Nikon</td><td>93148</td><td>Serie CFI Fluor, 40X AI N.A. 0,8, D.T. 2,0 mm</td></tr><tr><td>Fuente de luz blanca</td><td>Dolan-Jenner</td><td>Modelo 190</td><td>Iluminador de fibra óptica</td></tr><tr><td>Fuente de luz fluorescente </td><td>Lumen Dynamics</td><td>X-Cite 120Q</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Cámara de bajo nivel de luz</td><td>Photometrics</td><td>CoolSnap ES</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Manómetro digital</td><td>Omega Engineering</td><td>HHP-201</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Micromanipulador motorizado</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-285</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Etapa de cabezal</td><td>Molecular Devices</td><td>CV-7B</td><td>Axon Instruments</td></tr><tr><td>Amplificador</td><td>Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td>Axon Instruments</td></tr><tr><td>Sistema de adquisición de datos</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1322A</td><td>Axon Instruments</td></tr><tr><td>Estimulador de pulso aislado</td><td>A-M Systems</td><td>2100</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas Flaming/Brown</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td>Ajustes del programa para nuestra aplicación: Calor: rampa + 1, Tracción: &amp;rsquo;0&amp;rsquo;, Velocidad: 60, Tiempo: 90 Filamento tipo caja</td></tr><tr><td>Vidrio para pipetas</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td>Vidrio capilar de borosilicato con filamento (1 mm de diámetro externo, 0,58 mm de diámetro interno) </td></tr></tbody></table>

marcaje fluorescente retrógrada permite dirigida extracelular sola unidad de grabación de neuronas identificadas<em&gt; en vivo</em

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

El objetivo general de este método consiste en registrar las respuestas de una sola unidad de una población seleccionada de las neuronas. En los registros electrofisiológicos in vivo de neuronas individuales son fundamentales para la comprensión de cómo funcionan los circuitos neuronales en condiciones naturales. Tradicionalmente, estas grabaciones se han realizado &quot;a ciegas&quot;, es decir, la identidad de la célula registrada es desconocido al inicio de la grabación. Identidad celular puede determinarse posteriormente mediante intracelular 1, juxtacellular 2 o sueltas-patch 3 iontoforesis de tinte, pero estas grabaciones no se puede pre-dirigido a neuronas específicas en regiones con tipos de células funcionalmente heterogéneas. Las proteínas fluorescentes se pueden expresar de una manera específica del tipo de célula que permite visualmente guiada por electrofisiología de una sola célula 4-6. Sin embargo, hay muchos sistemas modelo para el que estas herramientas genéticas no están disponibles. Incluso en sistemas de modelos genéticamente accesibles, el programa deseadopromotor puede ser desconocida o neuronas genéticamente homogéneos puede haber diferentes patrones de proyección. Del mismo modo, los vectores virales se han utilizado para etiquetar los subgrupos específicos de las neuronas de proyección 7, pero el uso de este método está limitada por la toxicidad y la falta de especificidad trans-sináptica. Por lo tanto, se necesitan técnicas adicionales que ofrecen pre-visualización específica para grabar desde neuronas individuales identificados in vivo. Pre-visualización de la neurona diana es particularmente útil para condiciones de grabación desafiantes, para los que las grabaciones de una sola célula clásicos a menudo son prohibitivamente difícil 8-11. La novedosa técnica descrita en este documento se utiliza el transporte retrógrado de un colorante fluorescente aplicada, utilizando agujas de tungsteno para etiquetar rápidamente y selectivamente un subconjunto específico de células dentro de una región particular del cerebro sobre la base de sus proyecciones axonales únicas, proporcionando de ese modo una señal visual para obtener registros electrofisiológicos dirigidos de las neuronas identificadas en un circuito intacto withina vertebrado SNC. La novela avance más significativo de nuestro método es el uso de etiquetado fluorescente para apuntar a tipos de células específicos en un sistema modelo accesible no genéticamente. Débilmente peces eléctricos son un excelente sistema modelo para el estudio de los circuitos neuronales en despierto, comportándose los animales 12. Hemos utilizado esta técnica para estudiar el procesamiento sensorial de &quot;células pequeñas&quot; en el núcleo exterolateral anterior (ELA) de peces mormyrid débilmente eléctrica. &quot;Células pequeñas&quot; son la hipótesis de que el tiempo de comparación neuronas importantes para detectar diferencias submillisecond en los tiempos de llegada de los picos presináptica 13. Sin embargo, las características anatómicas tales como la mielina densa, que envuelve las sinapsis, y cuerpos celulares pequeños han hecho extremadamente difícil para grabar a partir de estas células utilizando métodos tradicionales 11, 14. Aquí nos demuestran que nuestro método novedoso etiqueta selectivamente estas células en el 28% de los preparativos, lo que permite, grabaciones robustos y fiables caracrización de las respuestas a la estimulación electrosensory.

Transporte retrógrado de tinte fluorescente etiqueta a una subpoblación de neuronas en base a la proyección anatómica. Axones etiquetadas pueden orientarse visualmente<em&gt; In vivo</em&gt;, Que permite la grabación extracelular de los axones identificados. Esta técnica facilita la grabación cuando las neuronas no se pueden etiquetar a través de la manipulación genética o son difíciles de aislar el uso de &quot;ciego&quot;<em&gt; In vivo</em&gt; Enfoques.

Marcaje fluorescente retrógrada Permite dirigida extracelular sola unidad de grabación de neuronas identificadas<em&gt; En vivo</em

El objetivo general de este método es registrar respuestas de unidades individuales de una población de neuronas identificada. Los registros electrofisiológicos in vivo de...

El objetivo general de este procedimiento es registrar las respuestas de unidades individuales in vivo desde una población identificada de neuronas en un sistema modelo no genético. Esto se logra primero realizando una craneotomía para exponer la región cerebral de interés. El segundo paso consiste en utilizar alambres de tungsteno para colocar el colorante fluorescente en la región a la cual proyectan las neuronas objetivo.A continuación, el colorante es transportado de forma retrógrada, lo que da como resultado la marcación selectiva de las neuronas de proyección. El último paso consiste en registrar la actividad del axón marcado de la neurona de proyección individual. En última instancia, se utilizan grabaciones extracelulares de unidad individual para mostrar cómo las neuronas sensoriales centrales en un circuito intacto responden a la estimulación sensorial en evo.Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre cómo los circuitos neuronales detectan diferencias de submilisegundos en el momento de llegada de las entradas sinápticas. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es la capacidad de dirigirse a neuronas individuales o incluso a axones y sistemas no accesibles genéticamente. Los peces eléctricos semanales utilizan señales eléctricas para la comunicación y la navegación.Distinguen las señales de diferentes peces utilizando diferencias de submilisegundos en el momento de llegada de las entradas sinápticas. Nos preguntamos cómo las neuronas comparadoras de tiempo presumiblemente presentes en su circuito sensorial electroreceptivo pueden detectar diferencias tan pequeñas en el tiempo. Sin embargo, esta técnica también puede aplicarse a otros sistemas, como las vías sensoriales visual y auditiva.Es particularmente difícil extraer líquido de estas células debido al pequeño tamaño, la densa enmarañación en el tejido circundante y las terminaciones presinápticas que cubren la mayor parte del cuerpo celular. La inyección intracelular de colorante durante un registro en modo de célula íntegra marca una sola célula para guiar grabaciones dirigidas desde ese axón. De manera similar, el transporte retrógrado tras la inyección extracelular de colorante proporciona un medio para etiquetar selectivamente las neuronas de proyección en regiones cerebrales superficiales.Esto puede utilizarse para proporcionar orientación visual para grabaciones unitarias in vivo. Para preparar la aguja codificada con D, primero electrólisis una punta de alambre de tungsteno de 160 micrómetros de diámetro hasta alcanzar el diámetro final de la punta de la aguja, que será de cinco a 50 micrómetros. Luego, la noche anterior al experimento, marque la punta de la aguja con una solución de dos milimoles de colorante Alexa Fluor conjugado con dextrano de 10.000 pesos moleculares para inducir anestesia general.Coloque el pez en agua del tanque con solución MS 222 al 300 miligramos por litro para inmovilizarlo y silenciarlo eléctricamente mediante la inyección de 100 microlitros de flail al 3 miligramos por mililitro en la musculatura dorsal del cuerpo. A continuación, llene la cámara de registro con agua del tanque y coloque el pez con el lado ventral hacia abajo sobre la plataforma en el centro de la cámara. Luego, administre la solución MS 222 aireada al 100 miligramos por litro a una velocidad de uno a dos mililitros por minuto colocando la punta de una pipeta en su boca.Posteriormente, estabilice el pez con varillas fijas y cera en ambos lados del cuerpo. Monitoree el estado de salud del pez verificando el flujo sanguíneo continuo en los vasos oculares y un color corporal normal. Luego, gire la plataforma alrededor del eje vertical.Ajuste un extremo de la plataforma de manera que un lado de la superficie dorsal de la cabeza del pez quede expuesto por encima del agua, mientras que el resto del cuerpo del pez permanece sumergido. Coloque un pequeño trozo de toalla de papel Kimwipe sobre cualquier porción de la piel no sumergida para evitar que se seque. En este procedimiento, aplique lidocaína al 0,4 % sobre la superficie expuesta de la cabeza utilizando un hisopo.Luego, use una hoja de bisturí para cortar un trozo rectangular de tejido cutáneo de aproximadamente tres milímetros por cinco milímetros para un pez de 6,2 centímetros. El borde lateral del rectángulo debe alinearse con el centro del ojo. El borde anterior del rectángulo debe ubicarse justo posterior al ojo, y el borde medial del rectángulo debe estar justo lateral a la línea media.Posteriormente, retire el rectángulo utilizando un par de pinzas. Corte un cuadrado adicional de 2,5 milímetros en la región anterior para exponer el cráneo. Limpie completamente la superficie expuesta del cráneo raspando cualquier tejido excesivo con la hoja de bisturí.Luego, seque completamente la superficie con una toallita Kim y aire forzado. A continuación, pegue un poste metálico a la región expuesta del cráneo medial anterior con pegamento rápido. Espere hasta que el pegamento esté completamente seco.Utilice un taladro dental con una punta de carburo de 0,5 milímetros de diámetro para trazar un rectángulo de aproximadamente dos milímetros por cuatro milímetros en el cráneo de un pez de 6,2 centímetros. A continuación, corte el perímetro del rectángulo con el bisturí y la pinza. Luego, retire el cráneo.Para exponer el cerebro, corte tanto la duramadre pigmentada como la piamadre transparente utilizando un par de tijeras de resorte o una aguja. Luego retire las porciones cortadas con un par de pinzas para exponer el núcleo extra lateral anterior y el núcleo extra lateral posterior. Ahora coloque un manipulador con una aguja recubierta de D preparada previamente sobre la región diana que contiene los axones de interés.El núcleo posterolateral externo, en nuestro caso, inserta rápidamente la aguja aproximadamente 25 micrómetros dentro del tejido. Después de que el colorante se haya difundido durante 15 a 30 segundos, retire la aguja. Repita el procedimiento con agujas nuevas adicionales según sea necesario.Coloque cada uno en una ubicación diferente para que el colorante se distribuya por toda la región objetivo. Luego, enjuague el exceso de colorante de la cavidad con solución de Ringer de Hickman y espere al menos dos horas para la absorción y el transporte del colorante. Para visualizar los axones de interés, coloque la cámara de registro con el pez debajo del objetivo de un microscopio de epifluorescencia con platina fija vertical.Cambie la solución de respiración por agua de tanque fresca y mantenga el mismo caudal. Luego, coloque un extremo del cable de tierra en la cavidad cerebral expuesta y conecte el otro extremo a la tierra de la etapa de registro. A continuación, coloque un par de electrodos de registro junto a la base de la cola.Luego conecte los electrodos a un amplificador diferencial y un dispositivo de grabación. Con el fin de monitorear la orden de descarga del órgano eléctrico o EODC, prepare un esquema a escala de la región del cerebro vista a baja magnificación, incluyendo los principales vasos sanguíneos como puntos de referencia para identificar la ubicación exacta de los axones marcados. Para confirmar primero la colocación de D, observe todo el tejido con iluminación de campo claro para orientación.Luego, obsérvelo con iluminación fluorescente. El núcleo extra lateral posterior debe mostrar una marcación difusa. A continuación, bajo alta magnificación, localice el núcleo extra lateral anterior utilizando los vasos como puntos de referencia.Ilumínelo con luz fluorescente mientras busca un axón marcado cerca de la superficie, utilizando un capilar de vidrio de borosilicato con filamento de un milímetro de diámetro externo y 0,58 milímetros de diámetro interno. Tire de un electrodo de registro con una vara estrecha de cinco milímetros de longitud y un diámetro de punta de aproximadamente uno a 2,4 micrómetros.Llene el electrodo con solución de Ringer de Hickman filtrada. La resistencia final de la punta debe estar en el rango de 16 a 155 megaohmios. Coloque el electrodo en un porta-electrodos con un puerto de presión.Conéctelo al cabezal montado en un manipulador. Luego, conecte el cabezal a un amplificador. Un dispositivo de adquisición analógico-digital, no mostrado, conecta el amplificador a la computadora.A continuación, aplique una presión positiva de 30 milibares a la línea del electrodo. Avance lentamente el electrodo hacia el axón desde la superficie del tejido. Cuando el electrodo esté cerca del axón, la presión positiva debe provocar un movimiento leve pero notable del axón mientras el electrodo se encuentra junto a este.Registre la actividad durante la presentación de los estímulos de prueba. Aunque un artefacto eléctrico confirma la grabación y estimulación adecuadas, no debería haber potenciales de acción. Libere la presión hacia afuera en el electrodo y repita la estimulación y la grabación.Luego, aplique una succión ligera que provoque el desplazamiento del axón hacia el electrodo. Repita la estimulación y la grabación nuevamente. Ahora debería observar algunos potenciales de acción en respuesta a las estimulaciones.Una vez que los potenciales de acción sean visibles, cierre la línea de presión. Cuando se hayan completado todas las grabaciones deseadas, cambie el agua del tanque nuevamente a la solución de respiración con MS 2 22 a cien miligramos por litro para asegurar que el pez esté completamente anestesiado. No se debe detectar EODC durante al menos 10 minutos antes de sacrificar al pez.Aquí se muestran cinco trazas de ejemplo que muestran los potenciales de acción evocados por un estímulo cuadrado transversal monofásico contralateral positivo de 0,1 milisegundo y seis milivoltios por centímetro, y aquí hay un gráfico de raster que muestra los tiempos de los picos durante 20 repeticiones de una ventana de registro de 75 milisegundos para la misma unidad estimulada en el tiempo cero con estímulos de seis milivoltios por centímetro. El rango de duraciones se indica a la derecha. Se muestra aquí una curva de sintonización de duración del estímulo que cuantifica las respuestas en picos por repetición del estímulo.Una vez dominada, la cirugía y la inyección del colorante mostradas en esta técnica pueden realizarse en una hora si se llevan a cabo correctamente, y las grabaciones pueden iniciarse de dos a tres horas después de la inyección del colorante. Al intentar este procedimiento, es importante recordar monitorear cuidadosamente la salud del animal experimental tras seguir este procedimiento. Otros métodos, como la imagenología de dos fotones, pueden realizarse para grabar actividad de neuronas en estructuras cerebrales aún más profundas.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo etiquetar y registrar las respuestas de unidad individual de una población identificada de neuronas.

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