Marcaje fluorescente retrógrada Permite dirigida extracelular sola unidad de grabación de neuronas identificadas En vivo

El objetivo general de este procedimiento es registrar las respuestas de una sola unidad in vivo de una población identificada de neuronas en un sistema modelo no genético. Esto se logra realizando primero una craneotomía para exponer la región cerebral de interés. El segundo paso es utilizar alambres de tungsteno para colocar el tinte fluorescente en la región a la que se proyectan las neuronas objetivo.

A continuación, el tinte se transporta retrógradamente, lo que da lugar a un marcaje selectivo de las neuronas de proyección. El paso final es registrar desde el axón marcado de la neurona de proyección individual. En última instancia, las grabaciones extracelulares de una sola unidad se utilizan para mostrar cómo las neuronas sensoriales centrales en un circuito intacto responden a la estimulación sensorial en evo.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre cómo los circuitos neurológicos detectan diferencias de menos de un milisegundo en el tiempo de las entradas sinápticas. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes es la capacidad de dirigirse a neuronas individuales o incluso axones y sistemas no genéticamente accesibles. Los peces eléctricos semanales utilizan señales eléctricas para la comunicación y la navegación.

Distinguen las señales de diferentes peces utilizando diferencias de menos de un milisegundo en el tiempo de las entradas sinápticas. Nos preguntamos cómo las supuestas neuronas comparadoras de tiempo en su circuito electrosensorial son capaces de detectar diferencias de tiempo tan pequeñas. Pero esta técnica también se puede aplicar a otros sistemas, como las vías sensoriales visuales y auditivas.

Es particularmente difícil que se liquide de estas células debido al pequeño tamaño, la densa sedimentación en el tejido circundante y las terminales presinápticas que cubren la mayor parte del vientre celular. In vitro marca una sola célula para guiar las grabaciones específicas de ese axón. De manera similar, el transporte retrógrado después de la inyección de tinte extracelular proporciona un medio para etiquetar selectivamente las neuronas de proyección en las regiones cerebrales superficiales.

Esto se puede utilizar para proporcionar una guía visual para las grabaciones in vivo de una sola unidad. Para preparar la aguja codificada D, primero afile electrolíticamente un alambre de tungsteno de 160 micrómetros de diámetro hasta el diámetro final de la punta de la aguja de cinco a 50 micrómetros. Luego, la noche anterior al experimento, codifique la punta de la aguja con una solución de dos milimolares de tinte de piso Alexa conjugado con dextrano de 10.000 pesos moleculares para inducir la anestesia general.

Coloque los peces en el agua del tanque con solución MS 2 22 a 300 miligramos por litro, inmovilice y silencie eléctricamente al pez inyectando 100 microlitros de mayal a tres miligramos por mililitro en la musculatura dorsal del cuerpo. A continuación, llene la cámara de registro con agua del tanque y coloque el pez con el lado ventral hacia abajo en la plataforma en el centro de la cámara. A continuación, administre la solución aireada MS 2 22 a 100 miligramos por litro en uno o dos mililitros por minuto colocando una punta de pipeta en su boca.

Después, estabilice el pez con cañas fijas y cera a ambos lados del cuerpo. Controle el estado de salud de los peces verificando el flujo sanguíneo continuo en los vasos oculares y un color corporal normal. A continuación, gire la plataforma a lo largo del eje vertical.

Ajuste un extremo de la plataforma de modo que un lado de la superficie dorsal de la cabeza del pez quede expuesto por encima del agua mientras el resto del cuerpo del pez permanece sumergido. Coloque un pequeño trozo de toallita Kim en cualquier parte no sumergida de la piel para evitar que se seque. En este procedimiento, aplique lidocaína al 0,4% en la superficie expuesta de la cabeza con un hisopo.

A continuación, utiliza una hoja de bisturí para cortar un trozo rectangular de tejido cutáneo de aproximadamente tres milímetros por cinco milímetros para un pez de 6,2 centímetros. El borde lateral del rectángulo debe alinearse con el centro del ojo. El borde anterior del rectángulo debe ser justo posterior al ojo, y el borde medial del rectángulo debe ser justo lateral a la línea media.

A continuación, retira el rectángulo con unas pinzas. Corta un cuadrado adicional de 2,5 milímetros en la parte anterior para exponer el cráneo. Limpie completamente la superficie expuesta del cráneo raspando cualquier exceso de tejido con la hoja del bisturí.

A continuación, seque completamente la superficie con una toallita Kim y aire forzado. A continuación, pega un poste de metal en la región expuesta del cráneo medial anterior con superpegamento. Espera hasta que el pegamento esté completamente seco.

Use un taladro dental con una punta de carburo de molino de bolas de 0,5 milímetros de diámetro para dibujar un rectángulo de aproximadamente dos milímetros por cuatro milímetros en el cráneo para un pez de 6,2 centímetros. Después de eso, corta el perímetro del rectángulo con el bisturí y las pinzas. A continuación, retira el cráneo.

Para exponer el cerebro, corta tanto la duramadre pigmentada como la pia madre transparente con unas tijeras de resorte o una aguja. A continuación, retire las partes cortadas con un par de pinzas para exponer el núcleo extralateral anterior y el núcleo extralateral posterior. Ahora coloque un manipulador con una aguja recubierta de D preparada anteriormente por encima de la región objetivo que contiene los axones de interés.

El núcleo extra lateral posterior, en nuestro caso, inserta rápidamente la aguja aproximadamente 25 micrómetros en el tejido. Después de que el tinte se haya difundido durante 15 a 30 segundos, retrae la aguja. Repita con agujas nuevas adicionales según sea necesario.

Coloque cada uno en un lugar diferente para que el tinte se distribuya por toda la región objetivo. A continuación, enjuague el exceso de tinte de la cavidad con la solución de timbre de Hickman y espere al menos dos horas para que el tinte lo absorba y lo transporte. Para visualizar los axones de interés, coloque la cámara de registro con el pez debajo del objetivo de un microscopio de epifluorescencia de etapa fija vertical.

Cambie la solución de respiración a agua dulce del tanque y mantenga el mismo caudal. A continuación, coloque un extremo del cable de tierra en la cavidad cerebral expuesta y conecte el otro extremo a la tierra de la etapa del cabezal de grabación. A continuación, coloque un par de electrodos de registro junto a la base de la cola.

A continuación, conecte los electrodos a un amplificador diferencial y a un dispositivo de grabación. Con el fin de monitorear el comando de descarga eléctrica de órganos o EODC, prepare un boceto a escala de la región del cerebro vista a bajo aumento, incluidos los vasos sanguíneos principales como puntos de referencia para identificar la ubicación exacta de los axones marcados. Para confirmar primero la colocación de la D, observe todo el tejido con iluminación de campo claro para orientarse.

A continuación, véalo con iluminación fluorescente. El núcleo extralateral posterior debe mostrar un marcaje difuso. Después de eso, bajo un gran aumento, localice el núcleo extra lateral anterior con los vasos como puntos de referencia.

Ilumínelo con luz fluorescente mientras busca un axón marcado cerca de la superficie, utilizando un diámetro exterior de un milímetro y un diámetro interior de 0,58 milímetros. Vidrio capilar de silicato Bo con filamento. Tire de un electrodo registrador con un vástago estrecho de cinco milímetros de largo y un diámetro de punta de aproximadamente uno a 2,4 micrómetros.

Llene el electrodo con solución filtrada de timbre de Hickman. La resistencia final de la punta debe estar en el rango de 16 a 155 mega ohmios. Coloque el electrodo en un portaelectrodos con un puerto de presión.

Conéctelo a la etapa principal montada en un manipulador. A continuación, conecte la etapa principal a un amplificador. Un dispositivo de adquisición de analógico a digital que no se muestra conecta el amplificador a la computadora.

Después de eso, aplique 30 milibares de presión positiva a la línea de electrodos. Avance el electrodo lentamente hacia el axón desde la superficie del tejido. Como el electrodo está cerca del axón, la presión positiva debe causar un movimiento leve pero notable del axón mientras el electrodo está al lado del axón.

Registre la actividad durante la presentación de los estímulos de la prueba. Aunque un artefacto eléctrico confirma el registro y la estimulación adecuados, no debería haber potenciales de acción. Libere la presión hacia afuera en el electrodo y repita la estimulación y el registro.

A continuación, aplique una ligera succión que haga que el axón se mueva hacia el electrodo. Repita la estimulación y la grabación nuevamente. Ahora deberías ver algunos potenciales de acción en respuesta a los estímulos.

Una vez que los potenciales de acción sean visibles, cierre la línea de presión. Cuando se hayan completado todos los registros deseados, vuelva a cambiar el agua del tanque a la solución de respiración con MS 2 22 a cien miligramos por litro para asegurarse de que el pez esté completamente anestesiado. No se debe detectar ningún EODC durante al menos 10 minutos antes de sacrificar a los peces.

Aquí hay cinco trazas de muestra que muestran los potenciales de acción evocados por un estímulo monofásico de pulso cuadrado transversal transversal contralateral contralateral monofásico de 0,1 milisegundos y seis milivoltios, y aquí hay un gráfico de trama que muestra los tiempos de pico durante 20 repeticiones de una ventana de registro de 75 milisegundos para la misma unidad estimulada a veces cero con estímulos de seis milivoltios por centímetro. El rango de duraciones se muestra a la derecha. Aquí se muestra una curva de ajuste de la duración del estímulo que cuantifica las respuestas como picos por repetición de estímulo.

Una vez dominada, la cirugía y la inyección de tinte que se muestran en esta técnica se pueden realizar en una hora si se realiza correctamente, y las grabaciones se pueden iniciar dos o tres horas después de la inyección de tinte. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe controlar cuidadosamente la salud del animal de experimentación después de este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como la obtención de imágenes de dos fotones, para registrar las neuronas en estructuras cerebrales aún más profundas.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo etiquetar y registrar las respuestas de una sola unidad de una población identificada de neuronas.